应用CS-SELEX技术筛选特异性结合丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B适配子的研究

中国病原生物学杂志　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐａｔｈｏｇｅｎ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　２０１５年２月　第１Ｏ卷第２期　

Ｆｅｂｒｕａｒｙ　２０１５，Ｖｏ１．１０，Ｎｏ．２　・　９７　・　

ＤＯＩ：１０．１３３５０／ｊ．ｃｊｐｂ．１５０２０１　应用ＣＳ—ＳＥＬＥＸ技术筛选　・论著　特异性结合丙型肝炎病毒　

非结构蛋白ＮＳ４Ｂ适配子的研究　－Ｒ－　曾德钰，潘勤，章晓联一　（武汉大学基础医学院免疫学系，病毒学国家重点实验室，湖北省过敏及免疫相关疾病重点实验室，湖北武汉４３００７１）　

【摘要】　目的　应用ＣＳ＿ＳＥＬＥｘ（ｃｅ１ｌ　ｓｕｒｆａｃｅ—ｓｙｓｔｅｍ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｉｇａｎｄｓ　ｂｙ　ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ　ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）技术筛选与丙型肝　炎病毒（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｃ　ｖｉｒｕｓ，ＨＣＶ）非结构蛋白４Ｂ（ｎｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　４Ｂ，ＮＳ４Ｂ）特异性结合的ｓｓＤＮＡ适配子，建立检测ＨＣＶ　ＮＳ４Ｂ的酶联寡聚核苷酸吸附试验（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ａｓｓａｙ，ＥＬＯＮＡ）方法。　方法　构建ｐＤｉｓｐｌａｙ－ＮＳ４Ｂ　质粒，并转染至ＨｅｐＧ２细胞中，在Ｇ４１８存在情况下连续筛选１个月，得到单克隆细胞群，经过Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ以及流式细　胞术验证，获得稳定表达ＮＳ４Ｂ的ＨｅｐＧ２细胞。设计并合成随机序列ｓｓＤＮＡ文库，以稳定表达ＮＳ４Ｂ的细胞为正向筛　选靶细胞，以ＨｅｐＧ２细胞为反筛细胞进行ＣＳ－ＳＥＬＥＸ技术筛选。每轮筛选获得的具有结合ＮＳ４Ｂ能力的ｓｓＤＮＡ适配　子，通过ＰＣＲ扩增得到富集，随后通过不对称ＰＣＲ获得下一轮筛选的ｓｓＤＮＡ文库。经过１６轮筛选，将亲和力最高的筛　选产物克隆并测序，用ＥＬＯＮＡ方法检测适配子的亲和力。　结果　成功构建表面展示表达重组质粒ｐＤｉｓｐｌａｙ－ＮＳ４Ｂ。　分别将该质粒转入ＨｅｐＧ２细胞，通过Ｇ４１８筛选获得稳定表达ＨＣＶ—ＮＳ４Ｂ的细胞系ＮＳ４Ｂ－ＨｅｐＧ２。对ＣＳ－ＳＥＬＥＸ筛选　的各轮适配子库进行亲和力测定，其中第１４轮库适配子与ＮＳ４Ｂ的亲合力最高。分别对第１４轮库中的单个适配子进　行亲和力测定，以适配子ＺＮ１和ＺＮ５与ＮＳ４Ｂ的亲合力最高。ＺＮ１和ＺＮ５不仅能结合展示在细胞表面的ＮＳ４Ｂ蛋白，　还能结合丙型肝炎病毒感染细胞（ＨＣＶ　ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ，ＨＣＶｃｃ）中的ＨＣＶ—ＮＳ４Ｂ蛋白。　结论适配子ＺＮ１和ＺＮ５对　ＮＳ４Ｂ有高亲和力，这对研究ＨＣＶ　ＮＳ４Ｂ致癌机制、ＨＣＶ诊断以及治疗方面有潜在的应用价值。　【关键词】　丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）；非结构蛋白一ＮＳ４Ｂ；ＣＳ－ＳＥＬＥＸ；适配子　【中图分类号】Ｒ３７３．２１　【文献标识码】Ａ　【文章编号】１６７３—５２３４（２０１５）０２—００９７—０５　

［Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐａｔｈｏｇｅｎ　Ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１５　Ｆｅｂ；１０（２）：９７—１０１．］　Ｕｓｉｎｇ　ＣＳ—ＳＥＬＥＸ　ｔｏ　ｓｅｌｅｃｔ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ａｐｔａｍｅｒｓ　ａｇａｉｎｓｔ　ＨＣＶ　ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　４Ｂ　ＺＥＮＧ　Ｄｅ—Ｙｕ，ＰＡＮ　Ｑｉｎ，ＺＨＡＮＧ　Ｘｉａｏ—Ｌｉａｎ　（Ｔ　Ｐ　Ｓｔａｔｅ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｉｍｍｕ—　ｎｏｌｏｇｙ，Ｈｕｂｅｉ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ａｌｌｅｒｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｅ—ｒｅｌａｔｅｄ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｗｕｈａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉ—　ｃｉｎｅ，Ｗｕｈａｎ　４３００７１，Ｃｈｉｎａ）　

［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅｓ　Ｔｏ　ｕｓｅ　ｃｅｌｌ　ｓｕｒｆａｃｅ　ＳＥＬＥＸ（ＣＳ　ＳＥＬＥＸ）ｔｏ　ｓｃｒｅｅｎ　ｆｏｒ　ｈｉｇｈ—ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｓｓＤＮＡ　ａｐｔａｍｅｒｓ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｃ　ｖｉｒｕｓ（ＨＣＶ）ｎｏｎ－ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　４Ｂ（ＮＳ４Ｂ）ａｎｄ　ｔｏ　ｄｅｖｉｓｅ　ａｎ　ｅｎｚｙｍｅ　ｌｉｎｋｅｄ　ｏ１ｉｇｏｎｕｃ１ｅｏｔｉｄｅ　ａｓｓａｙ（ＥＬ（）　ＮＡ）ｔｏ　ｍｅａｓｕｒｅ　ｔｈｅ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ａｐｔａｍｅｒｓ　ａｎｄ　ＨＣＶ－ＮＳ４Ｂ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ａ　ｐＤｉｓｐｌａｙ－ＮＳ４Ｂ　ｐｌａｓ—　ｍｉｄ　ｗａｓ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ＨｅｐＧ２　ｃｅｌｌｓ．Ａｎ　ＮＳ４Ｂ－ＨｅｐＧ２　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ　ｔｈａｔ　ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔｌｙ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ＮＳ４Ｂ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｅｓｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｇ４１８　ｗａｓ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．Ａ　ｒａｎｄｏｍ　ｓｓＤＮＡ　ｌｉｂｒａｒｙ（ｃａ．１０　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｓｃｒｅｅｎ　ｆｏｒ　ａｐｔａｍｅｒｓ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｔｏ　ＮＳ４Ｂ－ＨｅｐＧ２　ｃｅｌｌｓ．ＮＳ４Ｂ－ＨｅｐＧ２　ｃｅｌｌｓ　ｓｅｒｖｅｄ　ａｓ　ｔｈｅ　ｔａｒｇｅｔ　ｃｅｌｌｓ　ｗｈｉｌｅ　ＨｅｐＧ２　ｃｅｌｌｓ　ｓｅｒｖｅｄ　ａｓ　ｔｈｅ　ｅｏｎｔｒｏｌ　ｃｅｌｌｓ．Ａｆｔｅｒ　１　６　ｒｏｕｎｄｓ　ｏｆ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ｔｈｅ　ｓｓＤＮＡ　ｐｏｏ１　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｈｉｇｈｅｓｔ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｔｏ　ＮＳ４Ｂ　ｗａｓ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ａｎｄ　ｃｌｏｎｅｄ　ｉｎｔｏ　ｐＵＣ１　９．Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ　ａｐｔａｍｅｒ　ｃｌｏｎｅｓ　ｗｅｒｅ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ．Ｔｈｅ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ａｐｔａｍｅｒｓ　ｔｏ　ＮＳ４Ｂ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｅｌｌｓ　ｗａｓ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ＥＬ０ＮＡ．　Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ａｐｔａｍｅｒｓ　ＺＮ１　ａｎｄ　ＺＮ５　ｈａｄ　ｔｈｅ　ｈｉｇｈｅｓｔ　ａｆ—　ｆｉｎｉｔｙ　ｆｏｒ　ＮＳ４Ｂ　ａｎｄ　ＮＳ４Ｂ—ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　ｃｅｌｌｓ　ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ＥＬＯＮＡ．ＺＮ１　ａｎｄ　ＺＮ５　ｄｉｓｐｌａｙｅｄ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｔｏ　ｂｏｔｈ　ＮＳ４Ｂ　ａｎｄ　ＨＣＶ　ｃｅｌｌｓ（ＨＣＶｃｃ）ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｈｕｈ７．５．１　ｃｅｌｌｓ　ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＨＣＶ．　Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｓｓＤ　ＮＡ　ａｐｔａｍｅｒｓ　ＺＮ１　ａｎｄ　ＺＮ５　ｃａｎ　ｓｅｒｖｅ　ａｓ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｐｒｏｂｅｓ　ｆｏｒ　ＮＳ４Ｂ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌ１ｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ａｓ—　ｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＮＳ４Ｂ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｏｆ　ＨＣＶ．　［Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ］Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｃ　ｖｉｒｕｓ（ＨＣＶ）；ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　４Ｂ（ＮＳ４Ｂ）；ＣＳ—ＳＥＬＥＸ；ａｐｔａｍｅｒ　

据世界卫生组织（ＷＨＯ）统计，全球约有３　，即　１．７亿～２．０亿人感染丙型肝炎病毒（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｃ　ｖｉ—　ｒｕｓ，ＨＣＶ）Ⅲ。我国是ＨＣＶ高感染率国家之一。　ＨＣＶ感染后，机体免疫系统往往不能将其清除，约　８Ｏ　的ＨＣＶ感染者常发展成为慢性肝炎，其中有　

＊【基金项目】　围家重大传染病专项（Ｎｏ．２０１２ＺＸ１０００３００２　０１５）；国家自然科学基金项目（Ｎｏ．３１２２１０６１，３１２７０１７６，　８ｌ４７１９１０和３１３７０１９７）；国家杰出青年基金项目（Ｎｏ．　８１０２５００８）　＊＊【通讯作者】章晓联，Ｅ　ｍａｉ１：ｚｈａｎｇｘｉａｏｌｉａｎ＠ｗｈｕ．ｅｄｕ．ｃｎ　【作者简介】曾德钰（１９８８一），男，湖北十堰人，硕士研究生，主　要从事感染免疫与分子免疫研究。Ｅ—ｍａｉｌ：３０６７３０３４１＠ｑｑ．ｃｏｒｎ　中国病原生物学杂志　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐａｔｈｏｇｅｎ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　２０１５年２月　第１０卷第２期　

Ｆｅｂｒｕａｒｙ　２０１５，Ｖｏ１．１０，Ｎｏ．２　

１Ｏ　～３Ｏ　的患者发展为肝硬化、１　～５　７／６发展为晚　期肝癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ，ＨＣＣ）Ｉｔ－ｚ］。ＨＣＶ　是单股正链ＲＮＡ病毒。ＨＣＶ主要有６种基因型，目　前仅基因型１和２有细胞感染模型，我国大部分以基　因型１和２为主。ＨＣＶ包含结构蛋白（核心蛋白　ｃｏｒｅ，包膜蛋白Ｅ１和Ｅ２）及非结构蛋白（ＮＳ２，ＮＳ３，　ＮＳ４Ａ，ＮＳ４Ｂ，ＮＳ５Ａ，ＮＳ５Ｂ）［３－４］。　ＨＣＶ　ＮＳ４Ｂ是一种２７　ｋｕ的疏水性蛋白，有４个　跨膜结构域，其Ｎ端和Ｃ端位于内质网膜上胞质的一　面。ＮＳ４Ｂ的前２７个氨基酸（Ｎ端）形成一个两性螺　旋（ＡＨ）＿５］，ＮＳ４Ｂ蛋白的ＡＨ２紧接着ＡＨ１之后，能　促进膜连接，并参与ＨＣＶ的复制ｌ６］。ＡＨ２能横穿磷　脂双层形成跨膜结构域¨７］，且自身能寡聚化，这可能与　ＮＳ４Ｂ蛋白形成膜网状复制结构有关＿８］。二级结构分　析显示，ＮＳ４Ｂ蛋白的Ｃ端有２个螺旋，分别命名Ｈ１　和Ｈ２，其中Ｈ１在ＨＣＶ各基因型中高度保守，Ｈ２序　列较为可变。Ｈ２也含有一个两性结构，能介导膜连　接，并帮助形成ＨＣＶ复制复合物　］。ＮＳ４Ｂ蛋白有　一个核苷酸结合基序（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ—ｂｉｎｄｉｎｇ　ｍｏｔｉｆ，　ＮＢＭ），ＮＢＭ能结合并水解ＧＴＰ和ＡＴＰ，而且该基　序具有腺苷酸激酶活性，该功能可能与ＮＳ４Ｂ诱导细　胞转化和肿瘤形成有关Ｉ９］。　ＳＥＬＥＸ（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｉｇａｎｄｓ　ｂｙ　ｅｘｐｏ—　ｎｅｎｔｉａｌ　ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）技术是近些年来发展起来的一种　体外高通量筛选技术，运用该技术可以从１Ｏ　～１０　库容量的寡核苷酸文库中筛选特异性、高亲合力识别　靶分子的ＤＮＡ或ＲＮＡ适配子（或称寡核苷酸配　基）［１　０－１４］。这些适配子“抗体”与传统蛋白质抗体的亲　和力相当、甚至更高，还能识别单抗不能区分的蛋白质　分子以及核酸和脂糖类等其他分子［】　¨］。单链寡核苷　酸适配子在合成时可以精确、定点、随意连接上其他功　能基团和分子，如巯基、氨基、荧光素、生物素及酶　等［１　５－２１］。因此ＳＥＬＥＸ技术已被广泛应用于基础医　学、实验诊断及药物筛选等方面。　本研究以稳定表达ＮＳ４Ｂ的细胞系（ＮＳ４Ｂ—　ＨｅｐＧ２）为靶目标，运用ＣＳ—ＳＥＬＥＸ技术筛选特异性　结合ＮＳ４Ｂ适配子，并对其中出现的高频适配子进行　特异性和亲和力检测，结果报告如下。　材料与方法　１　材料　ＨｅｐＧ２（人肝癌细胞），由武汉大学保藏中心提　供；Ｈｕｈ７．５．１细胞（人肝癌细胞），由武汉大学Ａ３动　物实验中心霍文哲教授提供；ｐＵＣ１９和ｐＣＭＶ—ＮＳ４Ｂ　质粒由本实验室保存；限制性内切酶Ｐｓｔ工、Ｂｇｌ　１Ｉ和　Ｔ４　ＤＮＡ连接酶购于美国Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司；ＤＮＡ凝胶　回收试剂盒购自美国ＡｘｙＰｒｅｐ公司；ＤＮＡ小分子质　量Ｍａｒｋｅｒ购于东盛生物公司；辣根过氧化物酶　（ＨＲＰ）标记链霉亲和素购自美国Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ　Ｇｒｏｕｐ　公司；ＴＭＢ底物显色试剂盒购于康为世纪公司；大肠　埃希菌Ｅ　ｃｏｌｉ　ＤＨ５ａ感受态细胞由本实验室制备。　２　方法　２．１　ｐＤｉｓｐｌａｙ－ＮＳ４Ｂ质粒的构建通过ＰＣＲ从ｐＣＭＶ－　ＮＳ４Ｂ获取ＮＳ４Ｂ基因，上游引物：５＇－ＡＡＣＴＧＣＡＧ—　ＧＣＡＴＧＣ￣ＧＴＧＧＡＧＣＡＧＴＣＣＴＣ一３　；下游引物：５　ＡＡＡＧＡＴＣＴＧＣＣＴＣＧＣＡＣＣＴＣＣＣＴＴＡＣＴＡＣ一３　。　将　ＰＣＲ产物用清洁回收试剂盒回收后，用酶ＰｓｔＩ、Ｂｇｌ丌将　回收产物和ｐＤｉｓｐｌａｙ载体分别双酶切，回收后用Ｔ４连　接酶连接并转化到Ｅ　ｃｏｌｉ　ＤＨ５中，涂板后培养过夜。　挑选细胞单克隆，提取质粒并测序。　２．２　ＮＳ４Ｂ—ＨｅｐＧ２细胞系的建立　按照试剂说明书　方法，采用脂质体Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ．）用ｐＤｉｓｐｌａｙ—ＮＳ４Ｂ质粒转染ＨｅｐＧ２细　胞，４８　ｈ后加入Ｇ４１８（５００／￣ｇ／ｍ１），隔天换液，维持１５　ｄ；将Ｇ４１８的浓度降为维持浓度（３００　ｕｇ／ｍ１），再培养　１５　ｄ，获得稳定表达ＮＳ４Ｂ的ＮＳ４Ｂ－ＨｅｐＧ２细胞系，用　流式细胞术（ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ，ＦＣＭ）和Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　方法分别检测细胞ＮＳ４Ｂ蛋白的表达情况。一抗均为　鼠抗ＨＡ的单克隆抗体，ＦＣＭ中二抗为ＦＩＴＣ一羊抗鼠　ＩｇＧ，Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ中二抗为ＨＲＰ一羊抗鼠ＩｇＧ。　２．３　运用ＣＳ—ＳＥＬＥＸ技术筛选特异性结合ＮＳ４Ｂ的　适配子　筛选ＮＳ４Ｂ适配子采用含有８８个碱基的单　链随机ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）文库，其序列为：５，＿ＧＣＧ—　ＧＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＡＣＡＧ　ＴＣＣＧＡＧＣＣ—Ｎ３０一ＧＧＧＴＣＡＡＴＧＣＧＴＣＡＴＡ一３　，　其　中Ｎ３０代表Ａ、Ｇ、Ｃ和Ｔ中的任意一个碱基。细胞膜　上表达ＮＳ４Ｂ蛋白的ＮＳ４Ｂ＿ＨｅｐＧ２细胞作为阳性正　筛靶细胞，其同系ＨｅｐＧ２细胞作为阴性反筛细胞。　首轮筛选时将随机ｓｓＤＮＡ文库（约１０¨适配子库容　量）进行ＰＣＲ。ＰＣＲ上游引物１：５，＿ＧＣＧＧＧＡＴＣ　ＣＴＡＴＧＡＣＧＣＡＴＴＧＡＣＣＣ一３　；下游引物２：５　一ＧＣＧ—　ＧＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＡＣＡＧＴ　３　。将扩增的ｄｓＤＮＡ随机文库作为初始模板保存。　以ｄｓＤＮＡ随机文库作为模板进行不对称ＰＣＲ（该反　应体系中引物１和引物２的比例为１０：１）扩增ｓｓＤ—　ＮＡ文库，用于筛选ＨＣＶ—ＮＳ４Ｂ　ＳＳＤＮＡ适配子。ＳＳ—　ＤＮＡ文库与１０。ＮＳ４Ｂ－ＨｅｐＧ２细胞在筛选缓冲液（２５　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ—ＨＣｌ，５０　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＣｌ，２００　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ，０．２　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ，５　（ｖ／ｖ）ｇｌｙｃｅｒｏｌ和０．５　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＤＴＴ）中３７。Ｃ孵育３０　ｍｉｎ，洗涤细胞以去除　未结合的ｓｓＤＮＡ。将５０　ｌ　ｄｄＨ　Ｏ加人到筛选体系　使结合的ｓｓＤＮＡ与细胞解离，以解离的ｓｓＤＮＡ作为