不同动物源新城疫病毒感染不同种属细胞的病变观察_高以明

NDV 参考毒株 F48E8、La Sota 由扬州大学农 业 部 畜 禽 传 染 病 学 重 点 开 放 实 验 室 保 存 ，NDV 分 离 株 JS-4-05-Go、GX-1-05-Ch、JS-1-07Os、JS-1-07-Du、JS-1-07-Pi 由扬州大学农业部 畜 禽 传 染 病 学 重 点 开 放 实 验 室 分 离 保 存 ；ZJ1GFP、La Sota-GFP 株由扬州大学农业部畜禽传染 病学重点开放实验室胡顺林等构建， 以上 NDV 毒株生物学特征见表 1。 SPF 鸡胚购自山东家禽 所 SPF 鸡场，鸭胚、鹅胚购自扬州市禽产品市场， 猪肾细胞系 PK-15、Dulac 购自中国兽药监察所，
4.扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室，江苏扬州 225009）
210001；
摘 要：用10株不同动物源的新城疫病毒F48E8，La Sota、La Sota-GFP、ZJ1、ZJ1-GFP、 JS-4-05-Go、GX-1-05-Ch、JS-1-07-Os、JS-1-07-Du、JS-1-07-Pi等 毒 株 分 别 感 染 鸡 胚 、 鹅 胚 、 鸭 胚 成 纤 维 细 胞 、PK-15、Dulac、FK81 、MDCK、Vero、Hela 多 种 不 同 动 物 来 源 的 传 代 细 胞系， 通过对病毒感染细胞后病变的观察、ZJ1-GFP及La Sota-GFP两个病毒感染细胞后细 胞中绿色荧光蛋白指示的病变，了解不同的毒株对不同细胞感染性的差别。 结果表明，不同 毒力、不同动物源的新城疫病毒致不同种属细胞病变的作用不同，产生病变的时间有差异， 强毒F48E8等毒株感染细胞后48～72 h可以引起几种禽源成纤维细胞全部裂解， 而哺乳动物 来源的细胞在60～120 h细胞发生病变，且病变也不如禽源成纤维细胞严重，出现了细胞的圆 缩。 弱毒株在胰酶处理后感染细胞，72 h以后出现明显细胞病变，引起的哺乳动物细胞病变 不明显。 受试毒株的动物种属来源与细胞的致病性没有明显相关性。
取 ZJ1-GFP、La Sota-GFP 毒株接种的 24 孔
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实验研究
China Poultry Vol．31,No．23．2009
板，每天观察荧光产生的情况。 2结果 2.1 病毒毒价测定
毒价滴定结果见表 1。 2.2 不同的 NDV 毒株对禽源成纤维细胞的感染 性差异分析
按照常规病毒学方法，用鸡胚成纤维细胞在 96 孔细胞板上进行滴定， 按照 Reed-Muench 法 计算 NDV 毒株的细胞半数感染量（TCID50）。 1.2.4 病毒对细胞的感染试验
在 24 孔板中形成单层的鸡胚、鸭胚、鹅胚成 纤维细胞，用无菌 PBS 洗涤 3 次，每孔接种 1∶100 稀释的不同病毒液 100 μL，每个毒株各接种 3 个 孔。 37 ℃孵育 1 h，弃去病毒液，无菌 PBS 洗涤 2 次。 加入含小牛血清的 DMEM 维持液， 于 37 ℃，5% CO2 条件下继续培养，每天观察细胞病变至 8 d， 并与未接种病毒的细胞进行对照。 1.2.5 荧光观察
猫肾细胞系 FK81、犬肾细胞系 MDCK、非洲绿猴 肾细胞系 Vero、 人宫颈癌细胞系 Hela 等细胞系 均由上述实验室保存。 1.1.2 主要试剂和仪器
DMEM 培养液（GibcoBRL 公司）、小牛血清 （Hyclone 公司）， 胰 酶 和 DMSO （Sigma 公 司 ）， CO2 培 养 箱 （Thermo Forma 公 司 ），倒 置 显 微 镜 （Nicon 公司）。 1.2 方法 1.2.1 病毒增殖
Key words：Newcastle disease virus；embryo fibroblast；cell line；green fluorescence protein；pathogenicity；infectivity
新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）感 染能够引起鸡和多种禽类急性高度致死性的疾 病［1］，该病毒自 1926 年首次报道以来，已在世界范 围内出现了四次大的流行，第二次和第三次分别是 由日本出口到中东地区的鹦鹉和鸽子引起的［1］。 研 究表明，NDV 可以感染 200 多种禽类，哺乳动物有 较强的抵抗力，但人可感染，主要表现为结膜炎，偶 有发热和头痛等症状［1，2］。 该病在世界范围内流行， 对养殖业造成了极大的危害。在世界禽类和禽类产 品的贸易中， 该病是属于严格检疫的疫病之一［3］， 然而除了禽类，该病毒还可以从其它动物体内分离 到，因此，对于人和其它哺乳动物体内携带病毒的 可能性及传播的风险性进行分析，有利于更好地进 行疫病控制和相关动物及其产品的检疫。我们分离 了多株不同动物来源的 NDV，就这些不同来源、不 同生物学特性的毒株对不同禽类的成纤维细胞和 细胞系的感染性进行研究，从细胞水平来探讨造成 致病性差异的可能机制，以确定出入境检疫对象和 加强对该病的防控。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 病毒与鸡胚和鹅胚、鸭胚及各种传代细胞系
表 1 所用 NDV 毒株宿主来源、毒力特征和 HA 效价
分离株/参考毒株 来源 宿主 基因型 毒力 MDT ICPI TCID50（mL）
La Sota La Sota-GFP F48E8 ZJ1 ZJI-GFP JS-4-05-Go GX-1-05-Ch JS-1-07-Os JS-1-07-Du JS-1-07-Pi
收 稿 日 期 ：2009-05-31 修 回 日 期 ：2009-08-13 *基 金 项 目 ： 江 苏 检 验 检 疫 局 科 技 计 划 项 目 （2007KJ03 ）； 江 苏 省 高 校 自 然 科 学 基 础 研 究 面 上 项 目 （07KJB230140 ）；江 苏 省 教 育 厅 指 导 计 划 项 目 （06KJD230211 ）
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China Poultry Vol．31,No．23．2009
不同动物源新城疫病毒感染 不同种属细胞的病变观察*
高以明1，2，张敬友3，王水明2，柯家法3，李超美2，朱雪良2，张 扬3， 严继宁2，黄立业2，任晓进2，吴艳涛4，刘文博4
（1.南京农业大学动物医学院，江苏南京 210095；2.南京出入境检验检疫局，江苏南京 3. 江苏出入境检验检疫局，江苏南京 210001；
（1.College of Animal Medicine，Nanjing Agricultural University，Nanjing，Jiangsu 210095； 2.Nanjing Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau，Nanjing，Jiangsu 210001； 3.Jiangsu Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau，Nanjing，Jiangsu 210001； 4.Key Lab of Animal Infectious Disease of Ministry of Agriculture， Yangzhou University，Yangzhou，Jiangsu 225009）
Abstract：The study was carried out to learn if different strains and isolates of Newcastle disease viruses （NDV） from different hosts and areas could make different cytopathogenic effect（CPE） to different cells. 10 NDV strains（F48E8，La Sota，La
正常的成纤维细胞呈纤维状，平贴于整个培 养 皿 内 表 面 ，而 感 染 强 毒 NDV 株 的 鸡 胚 、 鸭 胚 和鹅胚成纤维细胞变成圆形， 透光性发生变化， 聚集成团，有的形成多个细胞的融合（见图 1、2）， 时间再长，细胞出现崩解和脱落，漂浮于培养液 中（见图 3、4）。 经胰酶处理后的弱毒株 La Sota 和
关键词：新城疫病毒；成纤维细胞；传代细胞系；绿色荧光蛋白；致病性；感染性
Infectivity of NDV from Different Host to Avain Embryo Fibroblasts or Cell Lines from Mammal Animals*
GAO Yiming1，2，ZHANG Jingyou3，WANG Shuiming2，KE Jiafa3，LI Chaomei2，ZHU Xueliang2， ZHANG Yang3，YAN Jining2，HUANG Liye2，REN Xiaojin2，WU Yantao4，LIU Wenbo4
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China Poultry Vol．31,No．23．2009
Hale Waihona Puke Sota-GFP，ZJ1，ZJ1-GFP，JS-4-05-Go，GX-1-05-Ch，JS-1-07-Os，JS-1-07-Du，JS-1-07-Pi） were used to inoculate the embryo fibroblasts cells of chicken，duck，goose or some cell lines from mammal animals，such as PK-15，Dulac，FK81，MDCK，Vero， Hela. The cytopathogenic effects and fluorescence were observed by microscope at different times of post infection. The results showed that virulent viruses could make severe cytopathogenic effects rapidly to the embryo fibroblasts cells of chicken， duck，goose. But the lentogenic viruses treated with trypsin make mild cytopathogenic effects slowly. The virulent viruses could make cytopathogenic effects to cell lines from mammal animals，but there were some differences from the species of the animals. MDCK and FK81 were more sensitive to the cell lines than other cell lines. The cytopathogenic effects caused by lentogenic viruses were not visible. The virus from different hosts and different areas could not be distinguished by the CPE.