烟草转基因操作细则

烟草子房注射法转基因试验
烟草子房注射法转基因试验
邹颉1，余婧1，付强1，李世升2*
【摘要】[摘要] 为了快速获得转基因烟草，对烟株子房注射处于对数生长期的含有外源基因的根癌农杆菌菌液。

结果表明：通过初步的50 mg/L Kana抗性筛选及PCR检测，烟草子房注射法能成功获取转入的外源基因得到转基因烟草。

烟草子房注射法与烟草叶盘转化法等常规转基因方法相比，子房注射法简化了试验过程，缩短了试验周期，提高了试验效率。

【期刊名称】贵州农业科学
【年(卷),期】2013(000)012
【总页数】3
【关键词】[关键词] 转基因；根癌农杆菌；烟草；子房注射
植物基因工程技术已在烟草等作物品种改良及模式植物研究上得到广泛应用。

近几十年来，植物转基因技术已经有了长足的发展，这些技术的成功运用对于基础科学的研究和农业生物技术的发展有着极大的促进作用[1-3]。

目前的转基因技术主要分为两大类，一类是直接将基因导入到植物体内并整合，如早些年的化学诱导法(PEG法)、电激法，新发展起来的基因枪法(通过将目的基因片段和重金属颗粒包被整合，直接通过基因枪轰击植物分生组织获得转基因植物材料)[4-6]。

另一类是以根癌脓杆菌作为介导的遗传转化方法，此方法在目前的应用最为广泛。

根癌农杆菌拥有一套独特的Ti质粒系统，与现有的经过改造的双元载体系统相结合能够方便地将目的基因转入到植物基因组中[7-8]。

通过农杆菌浸染进行转基因是一个相对复杂而繁琐的工作，在此过程中，愈伤的产生以及愈伤分化成整体植株的过程需要相当精确的操作技巧；此外，不同的植物转。

国家烟草专卖局关于重新修订发布《烟草种子管理办法》等四个文件的通知文章属性•【制定机关】国家烟草专卖局•【公布日期】2001.09.28•【文号】国烟法[2001]560号•【施行日期】2001.09.28•【效力等级】部门规范性文件•【时效性】现行有效•【主题分类】专卖、专营正文国家烟草专卖局关于重新修订发布《烟草种子管理办法》等四个文件的通知（国烟法[2001]560号2001年9月28日）各省、自治区、直辖市及深圳、大连市烟草专卖局：现将《烟草种子管理办法》、《全国烟草品种审定委员会章程》、《烟草品种审定办法》、《烟草品种试验管理办法》印发给你们，请遵照执行。

附件：1.《烟草种子管理办法》烟草种子生产经营许可证申请表境外引进烟草种子登记表2.《全国烟草品种审定委员会章程》3.《烟草品种审定办法》4.《烟草品种试验管理办法》附件1：烟草种子管理办法第一章总则第一条为了加强烟草种子管理工作，维护烟草品种选育者和种子生产者、经营者、使用者的合法权益，有效地推广应用优良品种，提高种子质量，推动种子产业化，促进烟草生产的持续发展，依据《中华人民共和国种子法》和《中华人民共和国烟草专卖法》，制定本办法。

第二条从事烟草品种选育、种子生产、经营、使用、进出口和管理工作的单位和个人，必须遵守本办法。

第三条本办法所称烟草种子，是指各种烟草类型的育种家种子、原种和良种。

育种家种子是指育种家育成的遗传性状稳定、特征特性一致的品种或亲本的最初一批种子。

原种是指用育种家种子繁殖的第一代或按原种生产技术规程生产的达到原种质量标准的种子。

良种是指用常规原种繁殖的第一代和杂交种达到良种质量标准的种子。

第四条烟叶种植必须使用由全国烟草品种审定委员会审定(认定)的品种。

第五条国家鼓励烟草育种、引种和繁种工作采用先进技术，提高烟草种子工作的科学技术水平；鼓励品种选育和种子生产、经营相结合，推动种子产业化。

第六条国家建立种子贮备制度。

烟草组织培养实验方案摘要本实验通过配制四种培养基来实现烟草种子萌发，种子苗叶片诱导、分化及植株再生，从而获得课题所需要的基因受体植株。

关键词烟草组织培养前言组织培养不仅是一种植物快速繁殖的手段,同时也是植物改良、种质保存和次生物质生产的理想途径。

烟草是典型的基因工程模式植物,易于进行组织培养,容易得到再生的转化植株。

一实验植物：华烟6号二实验材料：华烟6号种子三实验方法与步骤1．培养基的配制本次实验使用（1）种子萌发培养基：MS培养基+GA30.7mg/L；（2）愈伤组织诱导及其幼芽分化培养基:MS+2,4-D 0.5 mg/L +6-BA 1.0 mg/L；（3）幼芽增殖培养基：MS+6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.2 mg/L；（4）生根培养基：MS+NAA 0.2 mg/L。

上述培养基均附加3%蔗糖，0.8%琼脂，pH5.8，培养温度25±2℃，光照强度2 000 lx。

2. 培养基的灭菌——高压蒸汽灭菌（湿热灭菌法）3. 无菌苗的获得把烟草种子用市售丝袜（或纱布）包好，先分别用75%乙醇或无菌水浸泡30 s，用无菌水洗净表面抑制种子萌发的药物，待洗涤的水清澈透明，然后将烟草种子用70%酒精浸泡1 min, 10%NaClO消毒10 min,经无菌水漂洗后，在超净工作台处（紫外灭菌20～30min）接种于以配置好的（1）培养基,放入(27±1)℃的光照培养架中培养。

光照周期为10 h(8:00~18:00)光照,12 h暗培养。

种子苗具4~5叶时继代扩繁备用。

4. 烟草叶片愈伤诱导及不定芽分化在超净工作台上取上述烟草无菌苗幼嫩叶片1~2片于无菌培养皿中，将叶片切成1.0～1.5平方厘米的小方块，接入（2）中培养。

约2～3d后，叶片外植体卷曲、增厚、膨胀，15d后外植体脱分化形成疏松絮状浅黄绿色的愈伤组织，愈伤组织诱导率为100%。

30d后，从叶片外植体产生的疏松愈伤组织上分化出许多浅黄绿色芽点。

遗传稳定性分析对于转基因植物的商 业化生产和应用具有重要意义。
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实验总结
实验收获与体会
掌握了农杆菌转化法的基本 原理和操作流程。
了解了烟草和拟南芥作为实 验材料的优缺点。
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学会了如何进行抗性筛选和 分子检测验证转基因植株。
培养了实验操作技能和团队 合作精神。
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等方法进行评估。
表型分析对于筛选具有优良性状的转基 因植株具有重要意义。
转化细胞的遗传稳定性分析
转化细胞的遗传稳定性分析是评估转 基因植物遗传物质稳定性的重要步骤 。
一般情况下，经过多次繁殖后，转化 细胞或转基因植株仍能保持稳定的遗 传特性，则认为遗传稳定性较好。
通过连续繁殖转化细胞或转基因植株 ，并定期进行PCR检测和表型分析， 可以观察遗传物质的变化情况。
其他试剂
如抗生素、质粒 DNA等。
农杆菌转化烟草和拟南芥
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将外源基因克隆到农杆菌的质 粒载体上。
将重组质粒转化到农杆菌中。
将农杆菌接种到植物受体材料 上。
在培养条件下培养植物受体材 料，使农杆菌与植物细胞相互
作用并导入外源基因。
基因枪法转化植物细胞
胞，促 进其再生和表达外源 基因。
实验原理
植物基因工程简介
植物基因工程是通过改变植物 的遗传物质来改良植物性状的 一门科学。
它利用基因工程技术将外源基 因导入植物细胞，并在植物细 胞内表达，从而获得具有优良 性状的转基因植物。
植物基因工程的应用范围广泛 ，包括抗虫、抗病、抗除草剂 、提高产量、改良品质等。
农杆菌的特性
农杆菌是一种土壤细菌，属于根瘤菌科。

CoIP protocol From Guo Siyi烟草转化体系将含有正确构建质粒的阳性农杆菌克隆在YEB 液体培养基中培养过夜，到OD600 约 1.5 左右（大约20h），同时摇菌P19，它能有效抑制植物对外源导入载体表达的沉默效应，提高表达量。

然后收集菌体，5000 rpm 5min 常温离心，将菌体用侵染缓冲液（10 mM MES，100 μM AS-乙酰丁香酮，50 mM MgCl2）重悬，用紫外分光光度仪测定OD600 值；根据实验要求将含有不同载体组合的菌液混合，同时在每一个组合中也加入P19，最终使得每种菌液成分的OD600 在0.8 左右；然后将混合的菌液在28 ℃下以200 rpm 的转速再培养至少3 h，然后注射合适大小的烟草叶片。

尽可能多的注射烟草叶片，并标记下注射的叶片及对应区域；之后用保鲜膜封闭，在暗中培养2 d，然后再转入光下培养2-3 d，并取材在荧光显微镜下观察GFP 的荧光已确定烟草叶片中外源载体的表达情况，视情况取材做后续的实验。

免疫共沉淀（CoIP）将VER2，TaGRP2 与不同的标签蛋白融合如FLAG-VER2，TaGRP2-GFP，将该载体转化农杆菌获得阳性克隆，然后共同用农杆菌侵染的方法转化烟草。

至少设定两组样品：即FLAG-VER2/TaGRP2-GFP 以及FLAG-VER2/GFP。

检测目的蛋白是否表达：用Bradford 法测定提取蛋白的浓度，然后用SDS-PAGE 分离蛋白（15-30 μg protein/lane）做Western Blot 用（WB）标签抗体FLAG，GFP 检测融合蛋白是否在烟草中表达。

并根据WB 的结果估算实验组（FLAG-VER2/TaGRP2-GFP）与对照组（FLAG-VER2/GFP）的蛋白相对表达量。

Pre-clear：（所有步骤尽量在冰上进行）取两份30 μL protein A/G beads 到EP 管中放于冰上，用600 μL 的蛋白提取buffer 重悬beads，4 ℃离心1000 g 1 min。

转基因烟草
生科12101班33 黄海燕
关于烟草
烟草属管状花目，茄科一年生或 有限多年生草本植物，基部稍木质 化。花序顶生，圆锥状，多花；蒴 果卵状或矩圆状，长约等于宿存萼。 夏秋季开花结果。主要分布于南美 州、南亚、中国。在许多国家里， 如保加利亚、加拿大、法国等，烟 草仍是用做转基因研究的。现在我 也用烟草做基础研究，但在我国最 主要的是用做一种经济作物。
发展转基因烟草的意义
1,环境净化方面 烟草具有植株大、生长快、吸附性强、 种植范围广等特点，科学家选择烟草治理汞污染，不 仅效率高，而且本身不残留毒素。 2,医疗方面 可以研制防艾滋病等病症的药物 3,科研方面 在科学研究中也有占据烟草作 为模式植物着十分重要的位置
谢谢观赏！
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
转基因烟草在其它领域的运用
1 科学研究方面，作为模式生物进行多方面的转 基因研究
2 环境净化方面 植物修复型转基因烟草
3在医疗方面 生产抗艾滋病病毒药物
在我国发展近况
自1996-1997年起，中国的许多省份都出现了转基 因烟草：主要是用于国内的烟草作物，也进入了国 际贸易。这些转基因烟草的主要特点是：烟草植入 了病菌和黄瓜的抗病菌性，在控制这些疾病方面非 常有效。但农民对种植转基因烟草的信息了解的非 常少。
目录
抗病毒转基因烟草概述 转基因烟草在其它领域的运用
在我国发展近况 发展转基因烟草的意义
抗病毒转基因烟草
病毒病素有烟草“癌症”之称。我国烟区发现 的烟草病毒有许多。其中，分布最广、危害最 重的主要是烟草花叶病毒( TMV) 、黄瓜花叶病 毒( CMV)。因此解决烟草病毒病危害最为有效 的方法就是培育具有抗病毒能力的烟草品种利 用基因工 程手段进行抗病毒育种，也就是我们 所讲的培育抗病毒转基因烟草。

烟草为何转基因？转基因技术除了在玉米、大豆等作物上得到广泛应用之外，在另外一种作物上也得到广泛应用，这种作物就是烟草。

第一种转基因作物就是抗生素耐受烟草。

吸烟有害健康，每年有5百万人因吸烟而死，为什么还要将转基因技术用在烟草上？这完全是一种助纣为虐的行为。

不要着急下结论，看看转基因技术为烟草带来了什么。

上世纪90年代中期，北卡罗林那州立大学的研究员Mark Conkling克隆出尼古丁基因，并成功地种植出低尼古丁甚至无尼古丁的烟草，这种转基因烟草的味道没有改变。

在健康方面受到巨大压力的烟草业马上推广转基因烟草，以表示烟草业在努力降低烟草危害。

烟草业的这种宣传是又一次误导，因为烟草中所含化学成分甚多，其中致癌物就有好几十种，只减低尼古丁含量并不能让香烟安全多少，但这种低尼古丁香烟却有意想不到的效果。

吸烟的问题在于对尼古丁的成瘾性，戒烟的办法之一是用尼古丁贴，但双盲试验发现用这种办法戒烟后复吸率在83%到97%之间，成功率极低。

而低尼古丁香烟使得吸烟者减少烟量，使得一些科学家认为也许可以用低尼古丁香烟来逐渐减少吸烟者对尼古丁的依赖性，从而达到戒烟的目的。

目前受FDA支持，正在进行低尼古丁香烟方面的试验，使用比普通香烟含5%尼古丁的转基因烟草制造的香烟来看看是否能消除对尼古丁的依赖。

想彻底避免香烟的危害，只有完全戒烟并远离二手烟。

由于转基因烟草种植越来越多，美国的反转势力开始要求烟民戒烟，以避免转基因。

这股风还没有吹到反转情绪很大的中国，如果能够通过避免转基因而让一部分烟民戒烟，也许是反转的唯一正面效果。

用转基因技术减少烟草致癌物的研究还在继续进行中，烟草这种作物很容易进行转基因操作，科学家通过转基因技术，为烟草开辟了好几个新的用途。

其一是生物燃料。

目前做生物燃料的原料主要是玉米和大豆，其效率很低，很可能反而导致全球变暖，无法替代石油。

西班牙科学家对烟草的催化硫氧还蛋白进行基因改造，使得烟草叶的淀粉含量增加700%、发酵性糖含量增加500%，使得用烟草叶制作生物燃料的效率大大高于玉米和大豆，有可能使得转基因烟草成为新一代生物燃料的原料，从而使生物燃料真正成为石油的替代品。

烟草良好农业操作规范烟草良好农业操作规范（GAP）第一章总则1.1为规范烟叶生产全过程，保证烟叶田间生产过程中质量和安全性，构建“优质、特色、生态、安全”烟草农业体系，强化社会责任，制订本规范。

1.2烟草良好农业操作规范（Good Agricultural Practices，简称GAP），是以保障烟叶质量及其安全性为核心，注重环境和自然资源保护，注重劳动者健康保护，通过经济的、环境的和社会的可持续发展措施，保持烟区生产生活与烟叶生产的持续健康发展。

1.3重视产地环境保护，加强土壤保育和生态维护，实行清洁生产，在优质、适产的前提下，实现烟叶生产资源节约、环境友好。

1.4注重烟叶安全性，重点关注农药残留、重金属和非烟物质（即不属于烟叶的所有物质）控制。

1.5本规范是烟叶田间生产过程中质量管理和安全控制的基本准则，适用于烟草公司、综合服务型烟农专业合作社及烟草种植主体烟叶生产全过程并以基地单元为单位推行本规范。

第二章产地选择及环境监测2.1根据《中国烟草种植区划》生态适应性区域划分，把基地单元安排在最适宜区或适宜区。

2.2优化基地单元布局，合理选择植烟田块，远离冶金、水泥、化工等厂矿区，避开城镇生活区等污染源，应选择重金属含量低、氯离子含量≤30ppm的区域种烟。

产地环境应符合《烟草产地环境技术条件（NY/T852—2004）》。

2.3开展产地环境监测，基地单元应每5年对空气质量进行一次监测，每3年对土壤质量进行一次监测，每年对灌溉水质量进行监测，确保烟叶生产环境安全。

第三章土壤和水分管理3.1建立基本烟田保护制度，推行等高种植，防止水土流失，实行清洁生产，加强环境保护。

3.2建立以烟为主的耕作制度，合理轮作，提倡烟田冬耕晒垡，推广绿肥种植、增施有机肥、秸秆还田等措施，改善土壤结构，提高和维护土壤地力。

3.3开展土壤肥力和土壤污染情况的监测，实行平衡施肥，测定土壤中镉、砷、铅、汞、铬、铜等六种元素总量和有效性。

转基因烟草环境1102程蕾41113064要点简介背景历史研究具体应用评价简介转基因烟草就是利用转基因技术应用到烟草植物的种植中。

是把吞噬毒素的生物基因嫁接到了烟草植物身上。

这些转基因植物，也称为基因改良植物，因为它们含有两种不同的组织，在实验室炸药的溶液中，这种植物增长很快。

这些植物分解毒素比普通的植物要快。

转基因烟草在吸收TNT污染的功能方面与清除RDX（旋风炸药）方面略有不同。

烟草植物清除TNT基本上是把TNT的分子结构转换成无毒形式，而对于RDX，植物主要是把RDX 逐渐分解，分离出其中的氮元素，然后又把氮当作成长的肥料。

简介转基因烟草，商业上有三种主要的转基因烟草种植：一是中国式的农艺：防病毒和抗虫性。

其次是，维克托烟草在美国和其他国家生产的转基因烟草，具有低尼古丁的特点，再次就是用于提炼药物和烟草的替代产品。

转基因烟草的种植和使用类型决定了所面临的风险因素是不同的。

在许多国家里，如保加利亚、加拿大、法国和印度，烟草仍是用做转基因研究的背景在烟草中使用转基因技术仅是20年前的事情，当时一小部分的细菌基因被融合到烟草中，随后下一代的烟草都继承了这些属性，并在某种类型的烟草中进行了许多小规模的尝试。

全球的转基因作物的面积从1995年开始逐渐增长，到2002年，大约有550到600万烟农种植转基因烟草。

种植商业转基因作物的国家有美国、阿根廷、加拿大、中国、印度、德国等国家，其中美国的转基因烟草份额达到了全球的67%，阿根廷为23%，加拿大为6%，中国为4%。

其中转基因比例最高的是大豆。

种植生物技术的优势有环境优势、农业潜在作物生产、消费者的益处、加工者的利润和第三大世界农业。

在美国40个州种植的转基因作物的产量、净利润和降低害虫方面都取得了显著的成效。

研究作为基因工程研究的模式植物，烟草是进行转基因研究最早，也是转基因种类较多的经济作物。

自1986 年以来，已经将烟草花叶病毒(TMV)，马铃薯Y 病毒(PVY)，马铃薯X 病毒(PVX)，黄瓜花叶病毒(CMV)，苜蓿花叶病毒(AMV)，烟草脆裂病毒(TRV)的外壳蛋白基因，PVY 复制酶基因、CMV 的微卫星RNA，几丁质酶基因、抗菌肽基因、葡萄糖氧化酶、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因(Bt)和蛋白酶抑制剂基因[2]等上百种外源基因转入烟草获得表达，使转基因烟草目的基因种类较为复杂。

• 小量培养农杆菌16-24 h；按1:100转接到培养液(5 mL YEP，100 µM乙酰
丁香酮(Aldrich)，10 mM MES(pH 5.6)，Rif 100 μg/mL，Kan 50 μg/mL） 接种与活化 中，28 °C16-24 h
诱导
• 当菌摇到OD6001.0时，5 000 rpm 10 min收集菌体，用溶液(5 ml 10 mM MgCl2，7.5 μL 100 mM乙酰丁香酮)重悬农杆菌至OD6001.0，室温静置 至少3 h
侵染
• 烟草组培苗叶片切成小块，浸泡在菌液中侵染10min后，用无菌滤纸 吸干叶片表面的菌液，置于共培养培养基（MS+5%蔗糖+乙酰丁香 酮120µmol/L）上（25±2）℃暗培养条件下培养2d。
a
注射法瞬时转化烟草
• 种植本生烟(Nicotianabenthamiana)：25 °C，16 h光照，约一个月后可用； 受体材料 在注射的前一天将烟草浇水并置于黑暗条件下；
• 将拟南芥花蕾倒置于装有花浸染缓冲液的烧杯中，烧杯放置在真空罐中，0.5Mbar抽 转化 真空10 min
• 将拟南芥植株平放在拖盘中，盖上塑料膜，避光培养。1~2 d后去除塑料膜，培养至
培养
种子成熟
a
农杆菌侵染瞬时转化烟草
接种
• 接种含有表达载体的农杆菌GV3101克隆于5 mL YEP液体培养基 (Rif 100 μg/mL，Kan 50 μg/mL)中，28 °C，200 rpm振荡培养过夜
a
操作要点
侵染烟草叶片无菌操作注意事项 抗生素的正确使用及抗生素敏感性实验 新鲜的叶片转化效率高 侵染前去除拟南芥已开花和果荚 侵染后筛选再生植株要注意抑制农杆菌生长 侵染后共培养一般为暗培养，1~2d，使农杆菌繁殖迅速，提高转化效率。

利用烟草花叶病毒瞬时表达目的基因一、实验目的蛋白瞬时表达方法已被用于烟草当中，例如来定位绿色荧光蛋白等标记物标记的目的蛋白的亚细胞位置，或者在不利用转基因植物的条件下生产和诱导大量蛋白。

可利用基因工程改造后的根癌农杆菌来引导目的基因进入烟草叶中进行表达。

二、实验原理烟草花叶病毒(TMV)表达载体30B是一个目前广泛应用的植物病毒表达载体，但用其生产外源蛋白时，必须先将它体外转录成RNA，才能被用来接种宿主植物。

但RNA体外转录费用昂贵、操作复杂。

用农杆菌接种法(a-groinnoculation)接种该病毒载体，即将30B cDNA 置于花椰菜花叶病毒(CaMV)的35启动子和终止子之间，再将整个表达框架插人到农杆菌T-DNA的左边界和右边界之内，构建成质粒p35S-30B，将转人该质粒的农杆菌注射到植物的叶片中，30B cDNA随T-DNA进人植物细胞后，被转录成可自我复制的RNA形式，进而发生系统侵染。

为了检测此接种方式的可行性，绿色荧光蛋白(GFP)报告基因被克隆到p35S-30B中，构建成p35S-30B:GFP，用含有该质粒的农杆菌进行注射操作。

三、实验试剂和仪器1. 带有病毒表达载体的农杆菌菌株(通常由花椰菜花叶病毒35S启动子驱动)2. 健康的烟草(Nicotiana benthamiana)植物(3-4周龄)3. MES / KOH(pH=5.6)4. 氯化镁5. 乙酰丁香酮6. 相应抗性的LB培养基四、实验步骤1、准备激活缓冲液配制母液MgCl2 1 M; MES (pH 5.6) 100 mM; 乙酰丁香酮(Ace)100 mM。

使用时，每1 ml 溶液中加入888 μl无菌水，10 μl MgCl2 1 M，100 μl MES (pH 5.6) 100 mM，2 μl乙酰丁香酮(Ace) 100 mM。

2、挑克隆挑取重组农杆菌单斑接种于含有Kan (50 mg/l) 和Rif (50 mg/l) 抗性的LB 培养基中28℃过夜振荡培养；然后1:100转接到相同抗性的LB培养基中，生长至对数生长期(OD600值约为0.6-0.8)，经6000 rpm离心5 min收集菌体3、制备菌液用含终浓度为10 mM MgCl2，10 mM MES (pH=5.6)，200 μM乙酰丁香酮(Ace)的无菌水重悬浮，调整菌液浓度至OD600=0.5或者根据需要调整；在室温下放置3 h以上。