转基因烟草

烟草转基因研究进展二师兄摘要：在深入分析烟草育种研究现状的基础上，综述了基因工程在烟草转基因育种中的研究进展，在分析了基因工程在烟草遗传育种中应用限制因素的基础上，对其未来发展趋势进行了展望。

关键词: 烟草转基因综述烟草品种是中式卷烟烟叶原料和卷烟品牌发展的物质基础．直接影响到中式卷烟烟叶原料和卷烟产品的品质稳定与提高从中国烟草发展历史来看。

我国每次烟叶生产大变革都是从品种开始近年来．中式卷烟对多样化烟叶原料的需求和特色优质烟叶原料的开发进一步提升了烤烟品种在中式卷烟中的基础地位．现代烟草农业和集约化烟叶生产的迅速发展．更要求品种的多样性、适应性和多抗性。

加之烟叶原料趋于同质化的今天．特色烤烟品种的培育及主栽品种的种植结构引起了人们的高度重视。

1 烟草育种研究现状1．1 品种资源现状烟草引入我国虽然只有几百年的历史．但在如此辽阔的土地上广泛分布．在各种生态环境中经历了数百年不同方向的自然选择和人工有意识选择．已定向发展成一个较为丰富的资源库．也是一个丰富多样的烟草基因库这类资源无论是直接开发利用方面．还是作为一种生物资源丰富遗传多样性方面，都对本行业的长期持续发展起着重要的作用在烟草品种资源考察与收集方面．我国在20世纪50年代进行了一次大规模的农作物品种资源收集工作．共收集烟草品种资源3000多份。

2O世纪70年代末至今．又在湖北神农架等7个重点地区进行了烟草品种资源的补充征集．并从国外引进一批使用价值较高的优良种质我国现已编目保存的烟草种质资源4042份，是世界烟草种质资源收集、保存量最多的国家。

烟草种质资源的遗传多样性包含了烟草属66个种中的37个种．一级库核心种质859份．二级库核心种质446份．为新品种选育工作提供了丰富的遗传材料在种质资源的田间观察、抗性鉴定、烟叶化验分析及质量评价方面，已经对大部分种质的农艺性状、植物学性状进行了鉴定评价，筛选出了一批优质的品种已完成了种质资源的原烟外观质量评价840多份．烟叶化学成分分析l700多份．原烟香吃味评吸900多份．并筛选出大自筋599等一批香吃味好、利用价值高的种质同时．还完成了种质资源的烟草黑胫病等抗性鉴定6000多份，筛选出抗病种质400多份；烟草普通花叶病和黄瓜花叶病的抗性鉴定2000多份．筛选出抗病种质100多份：烟草害虫的抗性鉴定700多份．并筛选出一批抗蚜虫的烟草种质。

烟草为何转基因？转基因技术除了在玉米、大豆等作物上得到广泛应用之外，在另外一种作物上也得到广泛应用，这种作物就是烟草。

第一种转基因作物就是抗生素耐受烟草。

吸烟有害健康，每年有5百万人因吸烟而死，为什么还要将转基因技术用在烟草上？这完全是一种助纣为虐的行为。

不要着急下结论，看看转基因技术为烟草带来了什么。

上世纪90年代中期，北卡罗林那州立大学的研究员Mark Conkling克隆出尼古丁基因，并成功地种植出低尼古丁甚至无尼古丁的烟草，这种转基因烟草的味道没有改变。

在健康方面受到巨大压力的烟草业马上推广转基因烟草，以表示烟草业在努力降低烟草危害。

烟草业的这种宣传是又一次误导，因为烟草中所含化学成分甚多，其中致癌物就有好几十种，只减低尼古丁含量并不能让香烟安全多少，但这种低尼古丁香烟却有意想不到的效果。

吸烟的问题在于对尼古丁的成瘾性，戒烟的办法之一是用尼古丁贴，但双盲试验发现用这种办法戒烟后复吸率在83%到97%之间，成功率极低。

而低尼古丁香烟使得吸烟者减少烟量，使得一些科学家认为也许可以用低尼古丁香烟来逐渐减少吸烟者对尼古丁的依赖性，从而达到戒烟的目的。

目前受FDA支持，正在进行低尼古丁香烟方面的试验，使用比普通香烟含5%尼古丁的转基因烟草制造的香烟来看看是否能消除对尼古丁的依赖。

想彻底避免香烟的危害，只有完全戒烟并远离二手烟。

由于转基因烟草种植越来越多，美国的反转势力开始要求烟民戒烟，以避免转基因。

这股风还没有吹到反转情绪很大的中国，如果能够通过避免转基因而让一部分烟民戒烟，也许是反转的唯一正面效果。

用转基因技术减少烟草致癌物的研究还在继续进行中，烟草这种作物很容易进行转基因操作，科学家通过转基因技术，为烟草开辟了好几个新的用途。

其一是生物燃料。

目前做生物燃料的原料主要是玉米和大豆，其效率很低，很可能反而导致全球变暖，无法替代石油。

西班牙科学家对烟草的催化硫氧还蛋白进行基因改造，使得烟草叶的淀粉含量增加700%、发酵性糖含量增加500%，使得用烟草叶制作生物燃料的效率大大高于玉米和大豆，有可能使得转基因烟草成为新一代生物燃料的原料，从而使生物燃料真正成为石油的替代品。

烟草转基因研究进展二师兄摘要：在深入分析烟草育种研究现状的基础上，综述了基因工程在烟草转基因育种中的研究进展，在分析了基因工程在烟草遗传育种中应用限制因素的基础上，对其未来发展趋势进行了展望。

关键词: 烟草转基因综述烟草品种是中式卷烟烟叶原料和卷烟品牌发展的物质基础．直接影响到中式卷烟烟叶原料和卷烟产品的品质稳定与提高从中国烟草发展历史来看。

我国每次烟叶生产大变革都是从品种开始近年来．中式卷烟对多样化烟叶原料的需求和特色优质烟叶原料的开发进一步提升了烤烟品种在中式卷烟中的基础地位．现代烟草农业和集约化烟叶生产的迅速发展．更要求品种的多样性、适应性和多抗性。

加之烟叶原料趋于同质化的今天．特色烤烟品种的培育及主栽品种的种植结构引起了人们的高度重视。

1 烟草育种研究现状1．1 品种资源现状烟草引入我国虽然只有几百年的历史．但在如此辽阔的土地上广泛分布．在各种生态环境中经历了数百年不同方向的自然选择和人工有意识选择．已定向发展成一个较为丰富的资源库．也是一个丰富多样的烟草基因库这类资源无论是直接开发利用方面．还是作为一种生物资源丰富遗传多样性方面，都对本行业的长期持续发展起着重要的作用在烟草品种资源考察与收集方面．我国在20世纪50年代进行了一次大规模的农作物品种资源收集工作．共收集烟草品种资源3000多份。

2O世纪70年代末至今．又在湖北神农架等7个重点地区进行了烟草品种资源的补充征集．并从国外引进一批使用价值较高的优良种质我国现已编目保存的烟草种质资源4042份，是世界烟草种质资源收集、保存量最多的国家。

烟草种质资源的遗传多样性包含了烟草属66个种中的37个种．一级库核心种质859份．二级库核心种质446份．为新品种选育工作提供了丰富的遗传材料在种质资源的田间观察、抗性鉴定、烟叶化验分析及质量评价方面，已经对大部分种质的农艺性状、植物学性状进行了鉴定评价，筛选出了一批优质的品种已完成了种质资源的原烟外观质量评价840多份．烟叶化学成分分析l700多份．原烟香吃味评吸900多份．并筛选出大自筋599等一批香吃味好、利用价值高的种质同时．还完成了种质资源的烟草黑胫病等抗性鉴定6000多份，筛选出抗病种质400多份；烟草普通花叶病和黄瓜花叶病的抗性鉴定2000多份．筛选出抗病种质100多份：烟草害虫的抗性鉴定700多份．并筛选出一批抗蚜虫的烟草种质。

《黄花苜蓿MfDREB1和MfDREB1s基因转化烟草的研究》篇一一、引言黄花苜蓿作为一种重要的农作物，具有丰富的营养价值和生态价值。

近年来，基因工程技术的不断发展为黄花苜蓿的遗传改良提供了新的途径。

本研究以黄花苜蓿的MfDREB1和MfDREB1s基因作为研究对象，通过基因转化技术将其导入烟草中，以期提高烟草的抗逆性和耐旱性。

二、材料与方法2.1 材料实验材料包括黄花苜蓿、烟草、MfDREB1和MfDREB1s基因等。

其中，黄花苜蓿为实验材料提供基因资源，烟草作为转化对象进行基因工程改造。

2.2 方法2.2.1 基因克隆与表达载体构建通过PCR扩增和序列测定获得MfDREB1和MfDREB1s基因的序列信息，然后构建表达载体。

2.2.2 烟草的遗传转化采用农杆菌介导法将表达载体导入烟草中，通过组织培养和筛选获得转基因烟草。

2.2.3 转基因烟草的鉴定与分析对转基因烟草进行PCR鉴定和RT-PCR分析，验证基因是否成功导入并表达。

同时，对转基因烟草进行抗逆性和耐旱性分析。

三、实验结果3.1 基因克隆与表达载体构建通过PCR扩增和序列测定成功获得了MfDREB1和MfDREB1s基因的序列信息，构建了相应的表达载体。

经测序验证，表达载体中的基因序列与黄花苜蓿中的基因序列一致。

3.2 烟草的遗传转化采用农杆菌介导法成功将表达载体导入烟草中，经过组织培养和筛选，获得了转基因烟草。

PCR鉴定结果显示，转基因烟草中成功导入了MfDREB1和MfDREB1s基因。

3.3 转基因烟草的鉴定与分析RT-PCR分析表明，转基因烟草中的MfDREB1和MfDREB1s基因得到了表达。

抗逆性和耐旱性分析显示，转基因烟草的抗逆性和耐旱性得到了显著提高。

与未转化的烟草相比，转基因烟草在干旱条件下的生长状况更好，叶片颜色更绿，生长速度更快。

四、讨论本研究成功将黄花苜蓿的MfDREB1和MfDREB1s基因导入烟草中，并通过转基因技术获得了转基因烟草。

烟草转基因操作细则烟草无菌苗准备:将烟草种子灭菌放入1/2 MS培养瓶中发芽；然后按2-3株每瓶移植到新的1/2MS培养瓶中一般组培光温条件下生长。

转基因步骤：1 10 mL YEB (YEP) 摇菌过夜（农杆菌菌株GV3101; EHA105 ）；2 离心收集菌液；3 用25 mL激活培养基(液)悬浮；4 在28o C摇3-5 h；5 转入到培养皿；6烟草叶片放到上面培养皿（含菌液的激活培养基）；7 用解剖刀将烟草无菌苗叶片切至0.2-0.5 cm见方；8 在激活培养基中浸泡10 min 左右；9 将叶片取出，置于灭菌纸上吸干菌液；10 将叶片放入共培养基上暗培养3天；然后将叶片用50 mL灭菌水（含一滴吐温和40 μL 头孢）洗4-6次，最后一次用纯灭菌水（不加吐温和头孢）；11 将叶片转到筛选培养基（平板/或培养瓶）上，常规光温条件培养；12 一般2周后有芽（小植株）出现；当小植株长出后，切下小植株转移到生根培养基（培养瓶）上培养。

培养基配方激活培养基：MS (Suc 3%) + 200 μM As，pH5.2 (pH5.8)；共培养基：MS (Suc 3%) + 2 (1)* mg/L 6-BA + 0.05 (0.1) mg/L NAA，pH5.5 (5.8);筛选培养基: MS (Suc 3%)+ 2 (1) mg/L 6-BA + 0.05 (0.1) mg/L NAA，pH5.8，头孢0.5g/L；潮霉素25 μg/mL（卡那霉素100 μg/mL）**；生根培养基：1/2 MS (Suc 3%) [（+ 2 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L NAA，可以不加），pH5.8，头孢0.5 g/L；潮霉素25 μg/mL（卡那霉素100 μg/mL）。

注：* [2 (1) mg/L 6-BA] 按(1)这些后面数据激素比例出愈（苗）率高，但是假阳性比例可能也较高。

**一般来看潮霉素假阳性少，卡那霉素假阳性较多。

第1篇一、实验目的本实验旨在通过分子生物学技术检测转基因烟草植株中目标基因的整合和表达情况，验证转基因植株的遗传稳定性，为后续的转基因烟草的研究和应用提供科学依据。

二、实验材料1. 转基因烟草植株：含有目标基因的烟草再生植株。

2. 实验试剂：DNA提取试剂盒、PCR试剂盒、DNA分子量标准、限制性内切酶、连接酶、T载体、感受态细胞、质粒提取试剂盒等。

3. 实验仪器：PCR仪、凝胶成像系统、离心机、电泳仪、显微镜等。

三、实验方法1. DNA提取- 将转基因烟草植株的叶片剪成小块，使用DNA提取试剂盒提取总DNA。

2. PCR扩增- 设计特异性引物，针对目标基因进行PCR扩增。

- 将提取的DNA作为模板，进行PCR扩增。

3. 电泳检测- 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察扩增条带。

4. 测序验证- 对扩增的特异性条带进行测序，验证其序列与目标基因的一致性。

5. Southern blot检测- 使用限制性内切酶酶切转基因烟草植株DNA和野生型烟草DNA。

- 将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，转移至硝酸纤维素膜上。

- 使用放射性同位素标记的目标基因探针进行杂交。

- 显影后观察杂交信号。

6. Northern blot检测- 提取转基因烟草植株RNA，进行反转录PCR，扩增目标基因mRNA。

- 将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，转移至硝酸纤维素膜上。

- 使用放射性同位素标记的目标基因探针进行杂交。

- 显影后观察杂交信号。

四、实验结果1. PCR扩增- 转基因烟草植株DNA的PCR产物在预期位置出现特异性条带，而野生型烟草DNA没有扩增产物。

2. 测序验证- 测序结果显示，扩增产物序列与目标基因序列一致。

3. Southern blot检测- 转基因烟草植株DNA的酶切产物与探针杂交后，在预期位置出现杂交信号，而野生型烟草DNA没有杂交信号。

4. Northern blot检测- 转基因烟草植株RNA的RT-PCR产物与探针杂交后，在预期位置出现杂交信号，而野生型烟草RNA没有杂交信号。

植物材料：Nicotiana benthamiana
菌种：GV3101
载体：Cam35S-gfp
第一天：
准备菌液，Culture a single colony in liquid LB + 50 mg/L Kanamycin + 60 mg/L Gentamicin
第三天：
转化
准备植物材料
1.无菌烟草材料，生长4-5周，完全展开叶片；
2.切成0.6cm到0.8cm见方叶盘；
3.用重悬液RM重悬离心收集的农杆菌菌体（2500 g，5 min），重悬至OD600=0.5~0.8；
4.将叶盘转入农杆菌重悬液中，28℃侵染30 min；
5.倒掉农杆菌菌液，将叶盘转到固体RM培养基上，覆盖无菌滤纸。

共培养：
在黑暗中25℃培养3天。

洗涤：
共培养后，将叶盘转到一个50ml圆底离心管中，用含有1000 mg/L特美丁RM溶液洗涤3 min，用RM溶液洗两次，每次3分钟。

筛选和分化培养：
1.用滤纸将叶盘表面吸干；
2.将叶盘放置到筛选RM培养基，10个叶盘一个皿；
3.黑暗中培养2周，转移至光下培养；
4.每3周继代一次。

生根
1.将分化愈伤转移至生根培养基；
2.成苗。

RM培养基：（固体加8 g/L Agar）
MS盐
B5 Vitamins
30 g/L 蔗糖
BA 2.0 mg/L
NAA 0.2 mg/L
PH 5.6
筛选培养基：
除上述成分外，加特美丁终浓度300 mg/L，潮霉素50 mg/L。

烟草转基因准备工具：EP管灭菌无菌水Ms培养基75%的酒精（蓝口小瓶）升汞(要回收)1ml枪枪头EP管架计时器一、转基因(1) 无菌条件下，将烟草种子放入EP管中用无菌水冲洗2-3次；(2) 于75%的酒精中浸泡30-60sec；(3) 再用0.1%的升汞处理5min，最后用无菌水冲洗5次；(4) 播种于MS培养基上，培养在杭州师范大学生命与环境科学院植物学重点实验室组织培养室中，暗培养4天。

25℃光照培养20-30天。

MS培养基pH5.8(5) 待烟草苗长至3-5cm时（20-30天），取顶芽放于MS+BA0.2mg/L（壮芽，使其快速成长）培养基上，继代培养。

(6) 继代培养14天后（有小叶片即可），取叶片，大小1cmX1cm，切去叶柄，叶片表面及叶边缘划伤，放入MS+ BA1.0mg/L pH6.0-6.5的预培养培养基上，正面朝下紧贴培养基放置，于黑暗条件下预培养2-3天。

(7) 然后取出预培养的叶片或茎段，放入侵染液中进行侵染。

侵染前一天晚上，摇菌农杆菌2瓶。

将2ml离心管装满菌液，4000rpm离心5min，用悬菌液清洗两次。

以1:10比例（10ml悬菌液放1管1.5ml菌体）放入悬菌液，加入As25mg/L（40ml 中加40ulAs）不断摇晃侵染液，使其与叶片及茎段切口处充分接触，10min后，取出，放于灭过菌的干燥滤纸上吸干菌液；(8) 将叶片及茎段放回到预培养基上，28℃黑暗条件下共培养2-3天，至叶片切口周围有微菌斑形成；(9) 洗菌，取出共培养的烟草叶片及茎段，用添加500mg/LCef的无菌水冲洗5次，第一次放置于摇床摇30min，后面每次5min，以洗去外植体表面的农杆菌；(10) 取出后，用滤纸吸干，转移到烟草诱芽培养基上，诱芽培养基为MS+ BA1.0mg/L + Hyg25mg/L + Cef 500mg/L pH5.8；过2周观察，如果发现不长菌，则降低Cef浓度。

亚细胞定位之烟草转化方法烟草是常见的植物模型，被广泛应用于植物生物学研究中。

研究人员通常通过烟草转化方法，将外源基因导入烟草中，实现对基因的功能研究或产生转基因烟草植株。

烟草转化方法通常包括两个步骤：外源基因构建和烟草转化。

首先，需要构建一个携带外源基因的转化载体。

这个载体通常包含一个启动子、外源基因和终止子。

启动子可以驱动外源基因的转录，终止子可使转录终止。

外源基因可以是一个编码蛋白质的序列，也可以是一个编码RNA或其他功能分子的序列。

构建好转化载体后，接下来可以通过烟草转化方法将其导入烟草中。

烟草转化方法有多种，包括农杆菌介导转化、基因枪法等。

其中，农杆菌介导转化是最常用的方法之一、农杆菌介导转化是利用农杆菌的特性，将外源基因导入烟草细胞中。

首先，需要将转化载体与农杆菌进行共转化，形成转化菌。

接着，将转化菌与烟草叶片进行共同培养，利用农杆菌T-DNA的转移机制，将外源基因导入烟草细胞中。

经过一段时间的培养，将转化的烟草细胞分离培养，最终获得转基因烟草植株。

利用亚细胞定位技术，可以进一步研究转基因烟草植株中外源基因的定位。

常用的方法包括荧光蛋白标记技术和抗体标记技术。

荧光蛋白标记技术可以通过将外源基因与荧光蛋白基因进行融合，使转基因植株产生荧光蛋白标记，从而观察外源基因在细胞内的定位。

抗体标记技术则是将外源基因编码的蛋白质与特异性抗体结合，通过免疫荧光染色等方法观察外源基因的定位。

通过亚细胞定位技术，可以了解转基因烟草植株中外源基因在不同亚细胞位置的分布。

这对于研究外源基因的功能以及其与其他生物分子的相互作用方式非常重要。

此外，亚细胞定位研究也可以为转基因烟草的功能性研究提供重要线索。

总结起来，烟草转化方法是利用烟草作为植物模型，将外源基因导入烟草中的方法。

通过亚细胞定位技术，可以了解外源基因在转基因烟草植株中的定位，进一步研究外源基因的功能和相互作用方式。

烟草转化方法为研究转基因植物提供了重要的工具和方法。

《黄花苜蓿MfDREB1和MfDREB1s基因转化烟草的研究》篇一一、引言近年来，随着分子生物学技术的快速发展，基因转化成为了研究植物抗逆机制及遗传改良的重要手段。

黄花苜蓿作为一种具有较强抗逆性的植物，其MfDREB1和MfDREB1s基因在逆境响应中发挥着重要作用。

本研究旨在通过将这两个基因转化烟草，探究其在烟草中的表达情况及其对烟草抗逆性的影响。

二、材料与方法2.1 材料实验材料包括黄花苜蓿、烟草植物、MfDREB1和MfDREB1s基因、相关酶、载体等。

2.2 方法（1）基因克隆：从黄花苜蓿中克隆出MfDREB1和MfDREB1s基因，并进行序列分析。

（2）载体构建：将克隆的基因连接到表达载体上，构建出可用于基因转化的载体。

（3）烟草转化：采用农杆菌介导法将构建好的载体转化到烟草中，获得转基因烟草。

（4）表达分析：通过RT-PCR等方法检测转基因烟草中MfDREB1和MfDREB1s基因的表达情况。

（5）抗逆性分析：对转基因烟草进行逆境处理，观察其生长状况及抗逆性变化。

三、结果与分析3.1 基因克隆与序列分析成功从黄花苜蓿中克隆出MfDREB1和MfDREB1s基因，并进行了序列分析。

结果表明，这两个基因具有较高的保守性，与已知的DREB家族成员具有较高的相似性。

3.2 载体构建与烟草转化将克隆的基因连接到表达载体上，构建出可用于基因转化的载体。

采用农杆菌介导法将载体转化到烟草中，获得了转基因烟草。

3.3 表达分析通过RT-PCR等方法检测转基因烟草中MfDREB1和MfDREB1s基因的表达情况。

结果表明，这两个基因在转基因烟草中得到了有效表达，且表达量较高。

3.4 抗逆性分析对转基因烟草进行逆境处理，观察其生长状况及抗逆性变化。

结果表明，转基因烟草在干旱、低温等逆境下的生长状况明显优于非转基因烟草，表明MfDREB1和MfDREB1s基因的转化提高了烟草的抗逆性。

四、讨论本研究通过将黄花苜蓿的MfDREB1和MfDREB1s基因转化到烟草中，探究了其在烟草中的表达情况及其对烟草抗逆性的影响。

转基因烟草检测标准转基因烟草是指经过基因工程技术改造的烟草植株，其基因组中携带了外源基因或者对内源基因进行了改造。

随着转基因技术的不断发展，转基因烟草的种植和应用已经成为一个备受关注的话题。

为了保障公众健康和市场秩序，对转基因烟草的检测标准显得尤为重要。

一、转基因烟草检测方法。

1. PCR法。

PCR法是目前应用最为广泛的转基因检测方法之一。

通过PCR技术，可以扩增转基因烟草中特定的外源基因序列，从而进行检测。

该方法具有高灵敏度、高特异性和高效率的特点，能够准确鉴定转基因烟草的存在。

2. 蛋白质检测法。

蛋白质检测法是通过检测转基因烟草中特定的蛋白质来进行鉴定。

这种方法操作简单，且对样品的处理要求较低，适用于大规模的转基因烟草检测。

3. 基因芯片技术。

基因芯片技术是一种高通量的检测方法，可以同时检测多个外源基因的存在。

该技术具有高度自动化和高效率的特点，能够满足大规模样品的检测需求。

二、转基因烟草检测标准制定。

1. 样品采集。

对于转基因烟草的检测，首先需要进行样品的采集工作。

采集样品时要注意避免外源污染，确保样品的纯度和完整性。

2. 检测方法选择。

针对不同的检测目的和需求，可以选择不同的转基因烟草检测方法。

在制定检测标准时，需要明确检测方法的选择和应用范围，确保检测结果的准确性和可靠性。

3. 检测标准制定。

在制定转基因烟草检测标准时，需要考虑到检测方法的灵敏度、特异性、稳定性等因素，确保检测结果能够满足监管和市场需求。

同时，还需要考虑到转基因烟草的种类和用途，对不同类型的转基因烟草制定相应的检测标准。

4. 质控要求。

在转基因烟草检测过程中，需要建立严格的质控体系，确保检测结果的准确性和可靠性。

质控要求包括实验室条件、设备校准、样品处理、数据分析等方面，对每个环节进行严格把控。

5. 结果判定。

针对转基因烟草检测结果，需要制定相应的结果判定标准，明确转基因烟草的存在与否。

判定标准应该具有明确的界限值和判定依据，能够对检测结果进行客观、准确的评定。

烟草转基因操作细则烟草转基因操作细则烟草无菌苗准备:将烟草种子灭菌放入1/2 MS培养瓶中发芽；然后按2-3株每瓶移植到新的1/2MS培养瓶中一般组培光温条件下生长。

转基因步骤：1 10 mL YEB (YEP) 摇菌过夜（农杆菌菌株GV3101; EHA105 ）；2 离心收集菌液；3 用25 mL激活培养基(液)悬浮；4 在28o C摇3-5 h；5 转入到培养皿；6烟草叶片放到上面培养皿（含菌液的激活培养基）；7 用解剖刀将烟草无菌苗叶片切至0.2-0.5 cm见方；8 在激活培养基中浸泡10 min 左右；9 将叶片取出，置于灭菌纸上吸干菌液；10 将叶片放入共培养基上暗培养3天；然后将叶片用50 mL灭菌水（含一滴吐温和40 μL 头孢）洗4-6次，最后一次用纯灭菌水（不加吐温和头孢）；11 将叶片转到筛选培养基（平板/或培养瓶）上，常规光温条件培养；12 一般2周后有芽（小植株）出现；当小植株长出后，切下小植株转移到生根培养基（培养瓶）上培养。

培养基配方激活培养基：MS (Suc 3%) + 200 μM As，pH5.2 (pH5.8)；共培养基：MS (Suc 3%) + 2 (1)* mg/L 6-BA + 0.05 (0.1) mg/L NAA，pH5.5 (5.8);筛选培养基: MS (Suc 3%)+ 2 (1) mg/L 6-BA + 0.05 (0.1) mg/L NAA，pH5.8，头孢0.5g/L；潮霉素25 μg/mL（卡那霉素100 μg/mL）**；生根培养基：1/2 MS (Suc 3%) [（+ 2 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L NAA，可以不加），pH5.8，头孢0.5 g/L；潮霉素25 μg/mL（卡那霉素100 μg/mL）。

注：* [2 (1) mg/L 6-BA] 按(1)这些后面数据激素比例出愈（苗）率高，但是假阳性比例可能也较高。

叶盘法转基因烟草技术实验目的：学习并了解叶盘法转基因烟草的技术流程。

二. 实验原理：土壤中的农杆菌是一种革兰氏阴性菌，能够感染植物的受伤部位。

农杆菌中有一种环形的Ti质粒，Ti质粒最重要的两个区域为T-DNA区和毒性区，T-DNA是Ti质粒上唯一能够整合到植物染色体上的序列，而毒性区上一系列则帮助T-DNA区整合到植物的染色体上。

土壤农杆菌转化植物的常用方法是叶盘法。

这种转基因方法十分简单，一般是将植物的叶片切成小圆片，用农杆菌感染后共培养2-4天，而后转移到加有选择压的分化培养基上分化出芽，在MS培养基上生根后，再生出完整的植株。

三. 试剂及设备1.试剂：MS培养基：配方见“植物的组织培养技术”实验指导Kan：卡那霉素Cb：羧苄青霉素NAA：萘乙酸6-BA：细胞分裂素T1培养基：MS培养基T2培养基：MS培养基+6-BA2.0mg/L+NAA0.5 mg/L+Kan100 mg/L+Cb500 mg/LT3培养基：MS培养基+ Kan100 mg/L+Cb500 mg/L（T2：生长培养基；T3：生根培养基）2.仪器：光照培养箱，恒温摇床，超净工作台，接种器械等四.实验步骤：1 农杆菌培养1）从平板上挑取含有目的基因的单菌落，接种到3 ml YEB 液体培养基中（Str 25 μg/ml、Rif 50 μg/ml、Kan 80 μg/ml）于恒温摇床上27℃，180 rpm 摇培过夜至OD 600 为0.6-0.8。

2）摇培过夜的菌液按1%-2%的比例，转入新配置的无抗生素的YEB 培养基中，在与上述相同的条件下培养6 h左右，OD600 为0.2-0.5 时即可用于转化。

或：将按上述方法培养的OD 600 为0.6-0.8 的菌液，转入无菌离心管中，于室温条件下，5000 rpm 离心10 min，去掉上清液，菌体用1/2 MS液体（pH 5.4-5.8）培养基重悬，稀释至OD600 为0.2 左右，用于转化。

《黄花苜蓿MfDREB1和MfDREB1s基因转化烟草的研究》篇一一、引言黄花苜蓿是一种具有重要经济价值的植物，其在农业生产中发挥着重要的作用。

近年来，通过基因工程技术对黄花苜蓿进行改良已经成为研究热点。

MfDREB1和MfDREB1s基因作为黄花苜蓿中的关键调控基因，在应对环境压力、提高植物抗逆性方面具有重要作用。

本研究旨在通过将这两个基因转化烟草，探究其在烟草中的表达及其对烟草抗逆性的影响。

二、材料与方法2.1 材料本研究所用材料包括黄花苜蓿的MfDREB1和MfDREB1s基因、烟草植株、以及相关分子生物学实验所需的各种试剂和仪器。

2.2 方法（1）基因克隆与载体构建：根据已知的MfDREB1和MfDREB1s基因序列，设计引物并采用PCR技术进行基因克隆。

将克隆得到的基因与表达载体连接，构建成重组表达载体。

（2）烟草转化：采用农杆菌介导的叶盘法将重组表达载体导入烟草植株中，获得转基因烟草。

（3）分子生物学鉴定：通过PCR和Southern Blot等技术鉴定转基因烟草中的外源基因插入情况。

（4）抗逆性分析：对转基因烟草和野生型烟草进行不同环境压力处理，比较两者的生长状况、生理指标等，分析MfDREB1和MfDREB1s基因对烟草抗逆性的影响。

三、实验结果3.1 基因克隆与载体构建成功克隆了黄花苜蓿的MfDREB1和MfDREB1s基因，并将其与表达载体连接，构建成重组表达载体。

经测序验证，插入的基因序列与预期一致。

3.2 烟草转化及分子生物学鉴定采用农杆菌介导的叶盘法成功将重组表达载体导入烟草植株中，获得了转基因烟草。

通过PCR和 Southern Blot等技术鉴定，证实了外源基因已成功插入烟草基因组中。

3.3 抗逆性分析对转基因烟草和野生型烟草进行不同环境压力处理，包括干旱、低温等条件。

结果显示，转基因烟草在各种环境压力下的生长状况明显优于野生型烟草，生理指标也表现出较强的抗逆性。

这表明MfDREB1和MfDREB1s基因能够提高烟草的抗逆性。

2．材料与方法2.1实验材料植物材料：K326烟草种子药品：MS大量元素，MS微量元素，MS铁盐,吲哚乙酸（IAA），6-苄氨基腺嘌呤（6-BA），烟肌醇(B1B6),蔗糖，琼脂，头孢霉素（Cef），羧苄青霉素（Carb），卡那霉素（Kn）、庆大霉素、利福平等；MS培养基(1L):大量元素(20x)50ml、微量元素(100x)10ml、Fe2+(100x)10ml、蔗糖30g、琼脂8g，PH值约为6.0预培养基(1L)：大量元素(20x)50ml、微量元素(100x)10ml、Fe2+(100x)10ml、6-BA(1000x)2ml、B1B6(200x)5ml、甘氨酸(1000x)1ml、琼脂8g，PH值约为6.0。

高温灭菌后加IAA(0.2mg/L)1ml分化培养基(1L)：预培养基的基础上加入头孢霉素2ml，羧苄青霉素1ml，卡那霉素1ml.生根培养基(1L)：1/2MS、IAA 2mg/L、蔗糖30g/L、琼脂5.8g/L，pH=5.8 LB液体培养基(1L)：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCI 10gMS0培养基：为不加琼脂的只含大量元素MS培养基2.3实验方法2.3.1浸染菌液制备将含有目的基因的农杆菌在固体LB培养基上划板，28℃下暗培养两天。

挑取单菌落，接种于5ml含50mg.L-1卡那霉素、50mg.L-1链霉素及50mg.L-1利福平的液体LB培养基中，28℃下振荡培养过夜。

活化过夜的农杆菌，按1:50的比例，稀释到含50mg.L-1卡那霉素的新鲜液体LB培养基中，继续培养至OD600值约为0.5。

取培养物1ml，置于无菌离心管中，12000rpm离心1分钟，弃上清。

加入100ml的MS0培养基，混匀。

2.3.2烟草转化按叶圆盘法转化烟草。

将剪切好的烟草叶盘放置在预培养基上培养1-2天后，置于悬菌液中（MSO悬浮，可以稀释50—100倍）浸泡3-5分钟。

然后取出，用无菌滤纸吸去其表面的液体。

烟草转基因准备工具：EP管灭菌无菌水Ms培养基75%的酒精（蓝口小瓶）升汞(要回收)1ml枪枪头EP管架计时器一、转基因(1) 无菌条件下，将烟草种子放入EP管中用无菌水冲洗2-3次；(2) 于75%的酒精中浸泡30-60sec；(3) 再用0.1%的升汞处理5min，最后用无菌水冲洗5次；(4) 播种于MS培养基上，培养在杭州师范大学生命与环境科学院植物学重点实验室组织培养室中，暗培养4天。

25℃光照培养20-30天。

MS培养基pH5.8(5) 待烟草苗长至3-5cm时（20-30天），取顶芽放于MS+BA0.2mg/L（壮芽，使其快速成长）培养基上，继代培养。

(6) 继代培养14天后（有小叶片即可），取叶片，大小1cmX1cm，切去叶柄，叶片表面及叶边缘划伤，放入MS+ BA1.0mg/L pH6.0-6.5的预培养培养基上，正面朝下紧贴培养基放置，于黑暗条件下预培养2-3天。

(7) 然后取出预培养的叶片或茎段，放入侵染液中进行侵染。

侵染前一天晚上，摇菌农杆菌2瓶。

将2ml离心管装满菌液，4000rpm离心5min，用悬菌液清洗两次。

以1:10比例（10ml悬菌液放1管1.5ml菌体）放入悬菌液，加入As25mg/L（40ml 中加40ulAs）不断摇晃侵染液，使其与叶片及茎段切口处充分接触，10min后，取出，放于灭过菌的干燥滤纸上吸干菌液；(8) 将叶片及茎段放回到预培养基上，28℃黑暗条件下共培养2-3天，至叶片切口周围有微菌斑形成；(9) 洗菌，取出共培养的烟草叶片及茎段，用添加500mg/LCef的无菌水冲洗5次，第一次放置于摇床摇30min，后面每次5min，以洗去外植体表面的农杆菌；(10) 取出后，用滤纸吸干，转移到烟草诱芽培养基上，诱芽培养基为MS+ BA1.0mg/L + Hyg25mg/L + Cef 500mg/L pH5.8；过2周观察，如果发现不长菌，则降低Cef浓度。