细胞96孔板示意图

做實驗將近一年，從丁香園上學到了很多東西，感謝很多戰友給予の幫助，現將我在實驗過程中の一
點兒小小の經驗拿出來和大家分享，希望對種96孔板子の戰友有幫助。

剛開始用96孔板種細胞時細胞總是分布不均勻，第二天就會發現有些地方出現堆積性生長，而還有不少地方細胞則很稀疏，細胞密集の地方因細胞與細胞之間の接觸抑制影響細胞の生長，這樣就很難評價幹預因素對細胞の作用，因此將96孔板種均勻也是進行後續實驗の前提，現將我以前用の老辦法和最後用の新方法比較一下，以讓大家看看各自優缺。

1、老方法：這個是從丁香園上學の，就是種過板子後，用手將96孔板平拿起，左右晃動幾下，然後再前後晃動幾下，不過這種方法5個複孔中總有2-3個孔中細胞分布不均勻，多數情況下是孔の中
間出現成堆分布，為此苦惱了一陣子。

還又一次見一師姐將種好の板子放在搖床上搖了幾分鐘，結果更慘了，細胞全部跑到中間了。

2、新方法：這種方法簡直是太好了，種の很均勻。

先用搶將吹打均勻の細胞吸起來，讓後將槍頭緊貼著孔の一側壁（注意槍頭の尖不要接觸孔底），然後將槍頭中の細胞緩緩の打下去，種好之後千萬不要搖晃板子，直接放到顯微鏡下看就可以了，此方法可以說是100%の有效吧。

希望對大家有幫助。

從6孔板到96空板要細胞分散均勻，先用培養基把細胞稀釋好，再把培養板放在適當の位置，加入細胞時和加入細胞後不移動培養板；如果空中有の地方沒有培養基可吹打，但不要移動培養板，加入細胞後靜置20－30分鐘再移入培養箱。

這樣細胞一般都能長の很均勻。

當然，前提是細胞消化の很好。

96孔板培养和筛选杂交瘤细胞原理下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。

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各种孔板细胞接种量（总结下各种孔板细胞接种量仅供参考）：
培养板细胞接种量生长面积容量细胞数（大约）
96孔板4~5×10 435mm培养皿1×10 6
48 孔板 1.3×10 5 60mm培养皿 2.6×10 6
24孔板 2.5×10 5100mm培养皿7×10 6
12孔板5× 10 5150mm培养皿 1.8×10 7
6孔板 1.2×10 6
细胞瓶面积容量工作体积细胞数
12.5cm225ml 2ml 5×10 5
25 cm250ml 5ml 1×10 6
35 cm275ml 10ml 2×10 6
75 cm2250ml 15ml 4×10 6
150 cm2700ml 40ml 1.1×107
6孔板底面积9.6cm2，加培养液的量2.5ml；
12孔板底面积4.5cm2，加培养液的量2ml；
24孔板底面积2cm2，加培养液的量1ml；
96孔板底面积0.32cm2，加培养液的量0.1ml。

补充：不同孔板所加培养液的液面都不宜太深，一般在2~3mm范围，结合不同孔的底面积就可算出各培养孔的适宜加液量（参考下表）。

若加液量过多会影响气体（氧气）交换，而且在搬动过程中易溢出造成污染。

具体所加细胞密度依实验的目的不同灵活掌握。

注：各种单层生长的细胞在培养皿中长满的细胞数，主要取决于器皿底表面积和细胞体积的大小。

上表以Hela细胞为例给出的可获细胞量仅作参考。

应用指南 ExpiCHO表达系统ExpiCHO 表达系统24 孔和 96 孔深孔板以及微型生物反应器的实验方案Gibco™ ExpiCHO™表达系统将高表达的 CHO 细胞系及优化的培养基和转染试剂相结合，它们协同作用，滴度较 Gibco™FreeStyle™ MAX CHO 表达系统高 160 倍，较 Gibco™ Expi293™表达系统高 4 倍。

ExpiCHO 表达系统的超高产量 (某些蛋白可达 1–3 g/L) 使您可以减小表达规模，与其他瞬时表达技术相比，大大节约了成本。

我们在此介绍了减小系统规模至 24 孔和 96 孔深孔板以及微型生物反应器的实验方案。

96 孔深孔板中的转染材料• Axygen™ 存储微孔板，圆底，96 孔深孔 (Corning，货号：PDW20CS)• AeraSeal™粘性微孔板盖膜，无菌 (E&K Scientific，货号：T896100-S)• Thermo Scientific™紧凑型数字微孔板振荡器 (Thermo Fisher Scientific，货号：88880023) 或其他 3 mm 轨道的微孔板振荡器注：本实验方案需要使用轨道轨道振荡器；直线反应板振荡器无法充分混匀，不适用于表达实验方案。

常规传代1. 按照 ExpiCHO 试剂盒实验方案，传代并扩增ExpiCHO-S™ 细胞，直至细胞密度达到约 4–6 x 106个活细胞/mL。

第 –1 天：分种细胞2. 转染前一天 (第 –1 天)，按照 ExpiCHO 试剂盒实验方案，分种 ExpiCHO-S 细胞至最终密度为 3–4 x 106个活细胞/ mL，使细胞过夜生长。

第 0 天：转染3. 按照 ExpiCHO 试剂盒实验方案，使用新鲜的 ExpiCHO™表达培养基稀释细胞至 6 x 106个活细胞/mL。

4. 96 孔深孔板 (96DWB) 中每孔分装 0.8 mL 细胞用于转染。

96和48孔固相萃取板------适用于所有SPE的应用及高通量筛选96孔和48孔固相萃取板------由高化学稳定性的聚丙烯制造，标准滤片采用含有20µm微孔的聚乙烯制成。

96孔固相萃取柱产品订货指南反相（疏水）填料封尾C18 封尾 C8封尾 C4部件编号WORCEC18105WORCEC1811WORCEC1812WORCEC1813WORCEC08105WORCEC0811WORCEC0812WORCEC0813WORCEC04105WORCEC0411WORCEC0412WORCEC0413填料/ 每孔, mg501002003005010020030050100200300填料封尾C2环己基苯基部件编号WORCEC02105WORCEC0211WORCEC0212WORCEC0213WORCYH105WORCYH11WORCYH12WORCYH13WORPHY105WORPHY11WORPHY12WORPHY13填料/每孔, mg501002003005010020030050100200300正相(亲水)填料硅胶Pharma-Sil® 高表面活性硅胶二醇基氰丙基部件编号WORSIL105WORSIL11WORSIL12WORSIL13WORPHSIL105WORPHSIL11WORPHSIL12WORPHSIL13WORHSSIL105WORHSSIL11WORHSSIL12WORHSSIL13WORDOL105WORDOL11WORDOL12WORDOL13WORCNP105WORCNP11WORCNP12WORCNP13填料/ 每孔, mg5010020030050100200300501002003005010020030050100200300填料Florisil®60-100目Florisil®100-200目, A级氧化铝, 酸性氧化铝, 中性氧化铝, 碱性部件编号WORFLS05WORFLS11WORFLS12WORFLS13WORFLSA05WORFLSA1WORFLSA2WORFLSA3WORALA05WORALA1WORALA2WORALA3WORALN05WORALN1WORALN2WORALN3WORALB05WORALB1WORALB2WORALB3填料/每孔, mg5010020030050100200300501002003005010020030050100200300 离子交换(阴离子)离子交换(阳离子)氨丙基PSA ( N-2 氨乙基 )二乙氨基季铵盐聚亚胺WORNAX105WORNAX11WORNAX12WORNAX13WORPSA105WORPSA11WORPSA12WORPSA13WORDAX105WORDAX11WORDAX12WORDAX13WORQAX105WORQAX11WORQAX12WORQAX13WORPAX105WORPAX11WORPAX12WORPAX135010020030050100200300501002003005010020030050100200300苯磺酸苯磺酸高载量羧酸丙磺酸三乙酸WORBCX105WORBCX11WORBCX12WORBCX13WORBCX1HL105WORBCX1HL11WORBCX1HL12WORBCX1HL13WORCCX105WORCCX11WORCCX12WORCCX13WORPCX105WORPCX11WORPCX12WORPCX13WORTAX105WORTAX11WORTAX12WORTAX135010020030050100200300501002003005010020030050100200300共聚物(多官能固定相)填料氨丙基+ C8 季铵盐 + C8 羧酸+ C8丙磺酸 + C8 部件编号WORNAX205WORNAX21WORNAX22WORNAX23WORQAX205WORQAX21WORQAX22WORQAX23WORCCX205WORCCX21WORCCX22WORCCX23WORPCX205WORPCX21WORPCX22WORPCX23填料/ 每孔, mg50100200300501002003005010020030050100200300填料苯磺酸 + C8氰丙基+ C8环己烷+ C8二醇基+ C18部件编号WORBCX205WORBCX21WORBCX22WORBCX23WORCNP205WORCNP21WORCNP22WORCNP23WORCYH205WORCYH21WORCYH22WORCYH23WORDOL305WORDOL31WORDOL32WORDOL33填料/每孔, mg50100200300501002003005010020030050100200300 共价相聚合物树脂醛基环氧基异氰酸酯硫代丙基WORALD105WORALD11WORALD12WORALD13WOREPX105WOREPX11WOREPX12WOREPX13WORICN105WORICN11WORICN12WORICN13WORTHX105WORTHX11WORTHX12WORTHX1350100200300501002003005010020030050100200300DBX-苯磺酸 + C8DVB-聚苯乙烯二乙烯基苯C18-反相 C18BCX-苯磺酸QAX-季铵盐WORDBX405WORDBX41WORDBX42WORDBX43WORDVB405WORDVB41WORDVB42WORDVB43WORC18405WORC1841WORC1842WORC1843WORBCX405WORBCX41WORBCX42WORBCX43WORQAX405WORQAX41WORQAX42WORQAX435010020030050100200300501002003005010020030050100200300方法开发板说明填料量/每孔, mg 离子交换固定相: NAX, PSA, DAX, QAX, CCX, PCX, BCX 50-300非极性固定相, 封尾: C2,Cn4,Ct4,Ci4,C6,C8,C10,C12,C18,C20,CYH,PHY 50-300 极性固定相: CECNP, CUCNP,DAX, DOL, NAX, PSA, SIL, CUC02 50-300极性和离子交换固定相: CNP, NAX2, QAX2, CCX2, PCX2, BCX 250-300药物分析固定相: BCX2, NAX2, CCX, QAX, CNP, CEC02, CUC02 50-30048孔固相萃取柱• 超过40种不同的固定相选择 • 适于方法开发• 可进行填装和制造的定制 • 具有竞争力的价格 • 全面的技术支持服务• 客户满意保证适用于所有的SPE 应用和高通量筛选• 每孔样品体积可达5mL 。

细胞培养板规格
细胞培养板是用于细胞培养的基本设备，其规格和设计因应用和实验需求而异。

以下是一些常见的细胞培养板规格：
1. 96孔板：这是最常见的细胞培养板规格，通常用于高通量筛选和研究。

每个孔的体积通常为1-2毫升，可以容纳约100,000个细胞。

96孔板的设计使得它可以方便地进行自动化操作，例如使用移液机器人。

2. 24孔板：与96孔板类似，但每个孔的体积更大，通常为3-4毫升，可以容纳约300,000个细胞。

24孔板适用于需要更多培养空间的实验，例如某些类型的药物筛选或毒性研究。

3. 6孔板：每个孔的体积通常为5-10毫升，可以容纳约500,000个细胞。

6孔板适用于需要更多细胞的培养，例如某些类型的药物研究或基因转染。

4. 12孔板：每个孔的体积通常为15-20毫升，可以容纳约1,000,000个细胞。

12孔板适用于需要更多细胞的培养，例如某些类型的组织工程或免疫学研究。

5. 24/48/72/96孔板：这些是具有不同数量的孔的细胞培养板，可以根据实验需求选择不同规格。

这些板通常具有可调节的盖子，以保持培养环境的湿度和气体平衡。

除了以上规格外，还有一些其他规格的细胞培养板，例如66孔板、1536孔板等，这些板适用于特定类型的实验和研究。

在选择细胞培养板规格时，需要考虑实验需求、细胞类型、培养时间、细胞密
度等因素。

细胞铺板实验步骤做细胞生物学实验，细胞铺板大概是我们最常见的一个实验。

但有时候铺得不是很均匀：要么中间密周围稀，要么周围密中间秃顶。

下面为大家分享几点经验。

1、尽量消化细胞分散成单细胞悬液。

对于易于消化的细胞，我一般DPBS清洗一遍，加0.5ml胰酶润洗一遍（25cm2培养瓶或6孔板），弃掉胰酶，37度消化2-3分钟或室温消化5min左右，镜下观察是否细胞消化较为分散。

如果不够，延长消化时间。

2、96孔板一般以100 微升每孔接种，直接用100 微升移液器吸取细胞悬液，沿孔壁（稍离开一点孔底即可，不要离底太高）直接接入，移液器不需完全打到最大，轻轻按下即可，每铺完一行换一次枪头同时轻轻混匀细胞悬液。

都加完后盖上盖子，左手轻轻扶住板的左边，右手轻轻敲击板的右边缘，注意把握力度（我一般轻巧敲三下），太强或次数太多会导致细胞集中成堆，将板顺时针旋转（逆时针效果不好），依次敲击剩余三个边，静置约5分钟，放入37度培养箱。

3、6孔板、12孔板或24孔板，可采用将每个孔加入少量无血清培养基，晃动浸润整个孔底，然后用移液枪吸至第二孔，同样方法浸润孔底，其它孔依此类推，这样整个孔底都是湿润的，细胞悬液会平铺在整个孔底，注意加完细胞悬液后要放工作台静置一下。

这个方法就是有点慢，但操作熟练了也不慢。

也可以采用轻拍的方式，但力度没有96孔板好掌握，效果没有96孔板好。

4、培养瓶里面加好细胞以后(比如传代好/分好细胞以后)，先顺时针摇晃3次，马上逆时针摇晃3次。

然后延X轴Y轴分别水平摇动3次。

放入CO2培养箱后,平放着培养瓶重复延X轴Y轴分别水平摇动3次。

细胞铺板实验步骤 11、铺96孔板：96孔板一般以100 微升每孔接种，直接用100 微升移液器吸取细胞悬液，沿孔壁（稍离开一点孔底即可，不要离底太高）直接接入，移液器不需完全打到最大，轻轻按下即可，没铺完一行换一次枪头同时轻轻混匀细胞悬液。

2、铺24孔板：24孔板一般以500 微升每孔接种，用移液器吸取500微升细胞悬液沿孔壁一边用力吹入板底，使其铺满板底，静置5-10 min，避免晃动，轻轻移至培养箱，尤其在关培养箱门时，切记轻轻关上，不要让培养箱震动而导致细胞扎堆在中间。

24孔板生长曲线绘制：将培养瓶中的细胞弃旧培养液→用3 ml PBS清洗3遍→1 ml胰酶液37℃消化1min→吹打两次收集细胞至离心管中→离心去上清液→2 ml 10% FBS培养液重悬细胞→计数计算、均匀接种细胞（1 ml，2000个/孔）→（每天计数3个孔）吸弃就培养液，用1 ml PBS清洗2遍，200微升胰酶消化2min →PBS吹打2次收集细胞，计数96孔板MTT实验步骤操作：操作步骤1. 接种细胞：用0.08%胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10%胎牛血清的PMI1640培养液配成单个细胞悬液，以每孔103～104个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200ul。

2. 培养细胞：将培养板移入CO2孵箱中，在37℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养。

（培养时间取决于实验目的和要求）3. 呈色：每孔加入MTT溶液（5mg/ml）20ul，37℃孵箱中继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。

对于悬浮生长的细胞，需离心（1000rpm，5min），然后弃去孔内培养液。

每孔加入150ul DMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解。

4. 比色：选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。

以时间为横轴，光吸收值为终轴绘制细胞生长曲线。

（五）、注意事项1．选择适当的细胞接种浓度。

在进行MTT试验前，对每一种细胞都应测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，然后确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间。

2．避免血清干扰，一般选小于10%胎牛血清的培养液进行试验。

3．设空白对照，与试验平行设不加细胞只加培养液的空白对照孔。

最后比色时，以空白孔调零24孔板直径为15.6mm，培养底面积为1.9cm2，孔高2cm。

实验时每孔所加细胞数目及细胞液的体积依你具体实验目的不同可不同。

一般细胞悬液至少需覆盖孔底，总液量不宜超过2mL(约1/2孔高）。

要使加板均匀最关键的是在加样前细胞要充分混匀、分散；其次在加样时要垂直缓慢注入，使细胞悬液由中央向四周蔓开，避免加样时液体在孔内形成涡流及气泡的产生。

不常用96孔板介绍我们在平时实验中，最多应用96孔板，无非是96孔PCR板、细胞培养板和ELISA板，这些常见的我就不一一介绍；今天和大家一起了解一些，比较不常用的96孔微孔板，了解了以后也许能应用上。

有什么问题可交流；QQ：1294004728首先介绍相关参数：96孔聚苯乙烯微孔板*U型底微孔底为圆形，适用于进行凝聚实验；无死角，适用于移取液体；直径：6.94mm,孔高：10.3mm, 板高：14.2mm总体积：323 μl ;工作体积：40-280 μl*V 型底微孔底部为V型，适用于精准取样；适用于存储微量样品。

直径：6.18mm,孔高：10.8mm, 板高：14.1mm总体积：324 μl ;工作体积：40-200 μl*平底底部是水平的，光透底部不会发生偏折，适用于精密光学实验（底部读取信号）；口直径：6.96mm,底直径：6.39mm;孔高：10.9mm, 板高：14.6mm总体积：382 μl ;工作体积：25-340 μl ;底面积：32mm2.*平底/独立柱状孔与孔之间距离大些，独立分开，能最大程度地减少交叉污染；口直径：6.96mm,底直径：6.58mm;孔高：10.9mm, 板高：14.4mm总体积：392 μl ;工作体积：25-340 μl ;底面积：34mm2.* μClear®(软）底为透明，底部厚度为190μm+20μm，自发荧光极小，在激发波长470nm----590nm之间，最大自发荧光值是10100RFU；适用于荧光显微镜技术，偏振光透过板子时只有极少部分去偏振化。

*白色板主要用于自发光分析检测，底物显色（如双荧光素酶报告基因分析）；*黑色板主要用于荧光检测分析，观察带荧光蛋白标签细胞（如绿色荧光检测分析）；*LUMITRACTM 是白色微孔板，主要用于自发光检测分析；*FLUOTRACTM 是黑色微孔板，主要用于荧光检测分析；LUMITRACTM200，FLUOTRACTM200 中结合力板，聚苯乙烯微孔板中结合力比高结合力表面更疏水，故更适用于无极性的蛋白质和多肽，在ELISA实验中具有高度一致性和可重复性。

G418筛选稳定表达细胞系经验总结我做了稳定转染，从G418浓度确定到最后的单克隆化鉴定。

有自己的体会也有其他战友遇到的情况, 和大家分享. 没有总结好的地方，大家补充。

筛选之前确定G418浓度：1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。

2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。

但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。

neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素G418。

在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。

3、汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。

具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。

一个具体试验：3x106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。

理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。

筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。

加药时间和维持浓度1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。

所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。

随着细胞的代谢G418的浓度和活性都会下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。