96孔微量板定量检测细菌生物膜的方法步骤

DL-96Ⅲ细菌测定系统操作规程1.目的规范DL-96Ⅲ细菌测定系统操作规程，保证检验质量。

2.原理细菌测定系统，是对已分离培养出来的细菌、真菌等微生物进行种、属鉴定，并同时测定该菌对各种抗菌药物MIC的专用设备。

细菌测定系统由检测装置、嵌入式控制装置组成，测定系统采用比色、比浊法判定随机体外诊断试剂板微量反应孔阴阳性结果进行检测和分析，并自动生成细菌种类和抗菌药物MIC半定量分析结果。

试剂板由生化反应孔和抗菌药物MIC测定孔组成。

在生化反应孔中加入细菌悬液，经35-37℃孵育，在细菌代谢作用下生化反应直接颜色变化或经加入显色剂后产生颜色变化；抗菌药物MIC采用微量肉汤稀释法，加入还有细菌的MH肉汤培养基，经35-37℃孵育，根据试验孔是否出现浑浊（沉淀）确定细菌是否生长。

测定系统采用比色法对各项生化反应进行结果判定，根据细菌生化反应的概率来完成细菌的鉴定；测定系统通过比浊法对抗生素进行MIC半定量测定分析MIC值。

3.工作环境环境温度：5-40℃相对湿度：≤80% 大气压力：76KPa-106 KPa 电源电压：AC220V±22V，50Hz±1Hz 光照度：避免阳光直射。

4.操作程序4.1 使用本试剂板的基本要求：4.1.1无特殊营养要求的革兰氏阳性菌、革兰阴性菌和真菌等病原菌4.1.2 18-24小时分离培养的单个纯菌落（或纯培养物）。

4.2 随机试剂板的选择：4.2.1 根据待测菌的培养特性、菌落特征、氧化酶实验、触酶试验结果以及革兰染色情况，选择好相应的试剂板。

4.2.2 试剂板的选择DL-96E 、DL-96NE、 DL-96STAPH、DL-96STREP、DL-96FUNGUS4.3 试剂板的接种4.3.1 DL-ZD1浊度仪的校准连接浊度仪电源，仪器运行正常，依次放入调零样品和调幅样品，调节仪器测试分别到达“0”和“100”即可使用。

4.3.2 菌悬液与药敏液的配置菌悬液制备：挑取纯培养单个菌落于稀释液瓶内壁研磨呈细菌悬液，要求如下：DL-96E 、DL-96NE、 DL-96STAPH的菌悬液都制备0.5麦氏单位；DL-96STREP菌悬液制备2麦氏单位；DL-96FUNGUS菌悬液都制备1麦氏单位；药敏液的配置：具体请见细菌测定系统随机体外诊断试剂板使用说明书4.3.3 试剂板的接种与孵育具体请见细菌测定系统随机体外诊断试剂板使用说明书。

食源性克雷伯氏菌的分离鉴定与生物膜形成特性汤纯; 史云娇; 卞欢; 孙芝兰; 刘芳; 朱云龙【期刊名称】《《江苏农业学报》》【年(卷),期】2019(035)005【总页数】6页(P1216-1221)【关键词】新鲜鸭血; 克雷伯氏菌; 生物膜; 胞外多糖【作者】汤纯; 史云娇; 卞欢; 孙芝兰; 刘芳; 朱云龙【作者单位】江苏省农业科学院农产品加工研究所江苏南京 210014; 扬州大学旅游烹饪学院江苏扬州 225127【正文语种】中文【中图分类】TS251.7克雷伯氏菌属细菌(Klebsiella sp.)，是重要的条件致病菌和医源性感染菌，广泛存在于人的肠道和呼吸道中，在人体免疫力低下时，会引发败血症等疾病[1]。

经过临床病理研究和细菌学研究发现克雷伯氏菌肠道感染的可能性远大于呼吸道感染的可能性，现已检测出多起克雷伯氏菌病例，可能与食用地沟油等非正规渠道生产的食品有关[2]。

Hamza等[3]对埃及的5个肉鸡场调查发现，在肉鸡及养殖人员的粪便、饮用水中产碳青霉烯酶的肺炎克雷伯氏菌检出率较高。

韩坤等[4]从水貂中分离得到10株肺炎克雷伯氏菌，其中大部分菌株对多种临床常用药物表现出耐药性，对青霉素类、氨基糖苷类、喹诺酮类、三代头孢菌素类及磺胺类抗生素的耐药性较高，临床治疗十分困难。

同时，克雷伯氏菌属细菌能产胞外多糖[5]，有较强的生物膜形成能力。

生物膜，又称为生物被膜，是微生物有组织生长的聚集体，能够在有生命、无生命的物体表面附着[6]。

在自然界中，大部分微生物以生物膜的形式存在[7]，同时生物膜中大量的黏性基质形成了一个物理屏障，使抗生素和宿主的免疫系统不能对细菌产生有效的攻击[8-9]。

本研究利用结晶紫染色法[10]，以在取血过程中极易被微生物污染的新鲜鸭血[11-13]为样本，定量检测鸭血中优势腐败菌的生物膜形成能力。

以其中1株成膜能力最强的克雷伯氏菌K6为目标菌株，测定该菌7 d内形成的生物膜内菌数及胞外多糖含量，研究其成膜特性，为今后禽体取血加工过程中腐败微生物的控制及该菌生物膜的抑制剂开发提供基础。

SHENTEK®质粒DNA残留检测试剂盒（PCR-荧光探针法）说明书货号：SK030217PL100版本：A/4仅供研究用湖州申科生物技术有限公司⏹试剂盒简介SHENTEK®质粒DNA残留检测试剂盒用于定量检测基因治疗产品中质粒DNA残留的专用检测试剂盒，如CAR-T细胞治疗中慢病毒载体制备相关的质粒DNA。

本试剂盒利用Taqman探针原理，通过各质粒共有DNA序列，如ColE1/pMB1/pBR322/pUC来源的复制子，定量检测样本中质粒DNA的残留。

客户可以事先将质粒DNA序列给本公司技术人员进行确认。

本试剂盒检测快速，专一性强，性能可靠，最低检测限可以达到102copies/μl。

试剂盒配套有质粒DNA定量参考品。

本试剂盒与SHENTEK®宿主细胞残留DNA样本前处理试剂盒配套使用，可准确定量样本中残留的微量质粒DNA。

⏹试剂盒成份表1.试剂盒组份组份装量储存条件Plasmid DNA定量参考品50μl×1管-18℃及以下Plasmid Primer&Probe MIX300μl×1管-18℃及以下，避光qPCR Reaction Buffer850μl×2管-18℃及以下，避光DNA稀释液 1.5ml×3管-18℃及以下IPC MIX150μl×1管-18℃及以下，避光⏹规格：100Reactions。

⏹有效期:规定储存条件下24个月。

⏹适用机型（包括但不限于）ABI PRISM®7500Real-Time PCR SystemCFX96(Bio-Rad)Linegene9600plus（博日）⏹实验所需但试剂盒中未含材料1.5ml无菌离心管96孔qPCR板1000μl，100μl，10μl无菌有滤芯枪头⏹相关设备荧光定量PCR仪1000μl，100μl，10μl移液枪⏹操作过程Plasmid DNA定量参考品的稀释和标准曲线的制备Plasmid DNA定量参考品浓度为1.2ng/μl，通过如下公式换算成拷贝数：2.98×108copies/μl。

微生物学检验菌落总数的测定1 原理微生物活体数量的测定方法，常用平板培养计数法。

它是通过将样品制成均匀的一系列不同稀释度的稀释液，再取一定的稀释液接种，使其均匀分布于培养皿中特定的培养基内，最后根据在平板上长出的菌落数计算出每克（或mL ）样品中的活菌数量。

2 材料和仪器2.1 平皿：φ90mm 。

2.2 无菌锥形瓶：容量250mL ，500 mL 。

2.3 无菌吸管：1mL （具0.01mL 个度）,10mL （具0.1mL 刻度）或微量移液器及吸头。

2.4 灭菌锅。

2.5 恒温培养箱2.6 涂棒。

2.7 酒精灯。

2.8 超净工作台。

2.9 磁力搅拌器。

2.10 漩涡振荡器3 检验程序菌落总数的检验程序见下图。

方法①↙ ↘方法②↘ ↙4 操作步骤4.1 培养基和试剂的配制4.1.1 平板计数琼脂培养基：LB培养基（最常用）牛肉膏5g蛋白胨10g氯化钠5g琼脂20g蒸馏水1LpH 7.0～7.2将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH值，分装锥形瓶中，121℃高压灭菌30分钟。

4.1.2 无菌生理盐水的配制：称取8.5g氯化钠溶解于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌30分钟。

4.2 样品的稀释：4.2.1 固体样品：称取10g固体样品置于盛有90mL无菌生理盐水的无菌锥形瓶中（内装数粒无菌玻璃珠），在旋转式摇床上200r/min充分振荡30min，制成1：10的样品均液，即10-1稀释液。

4.2.2用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品均液1mL（吸取前需要摇匀1：10稀释液），缓慢加入盛有9mL无菌生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不能触及稀释液面），用漩涡振荡器振荡，混合均匀，制成1：100的样品稀释均液。

4.2.3按照4.2.2操作程序，制备10倍系列样品稀释液，每递增稀释一次，换用一次1mL无菌吸管或吸头。

4.2.4 根据对样品活菌数量的估计，选择3~4个适宜稀释度的样品均液（比如10-6，10-7，10-8，10-9稀释液）。

标准操作规程（SOP）——一、目的微量中和试验是一种敏感性高、特异性强的血清学方法，用于测定血清中的病毒特异性中和抗体水平。

中国国家流感中心的所有技术人员，必须按照本文件相关的操作规程，进行流感/禽流感微量中和抗体检测实验，以确保实验的准确性。

二、范围适用于中国国家流感中心的所有技术人员进行流感/禽流感微量中和抗体检测。

三、责任进行流感/禽流感微量中和抗体检测的技术人员需严格按照规定进行操作。

四、程序（一）生物安全要求H5，H7亚型高致病性禽流感病毒，H2N2亚型流感病毒的操作需要在生物安全3级（BSL-3）实验室中进行。

其余流感病毒的操作需要在生物安全2级（BSL-2级）实验室中进行。

操作人员必须严格按照相应实验室的要求做好个人防护。

（二）材料1．中和反应实验材料（1）病毒：一般采用接种鸡胚尿囊腔后收获的流感/禽流感病毒液，在-70℃中保存，并且注意避免反复冻融。

进行中和试验之前，需先进行病毒滴度（TCID50）的滴定。

具体步骤如下，1）病毒的稀释：可采取对数或者半对数稀释的方法。

以下介绍半对数稀释法。

取1管冻存病毒尿囊液，用病毒培养液进行1:100稀释。

第一列4个孔每孔加入146μL 1:100稀释过的病毒液，其它各列每孔加入100 μL 病毒培养液。

然后用多道加样器从第一孔吸46μL 至第二孔，做系列半对数稀释，使之成为10－2、10－2.5、10－3、10－3.5……10－7。

每孔含有100μL 病毒液。

2）每孔加入100μL MDCK 细胞悬液（1.5×104细胞/孔），37℃，5%CO 2培养箱孵育18～22h 。

每一滴度作平行4孔。

3）细胞固定、ELISA 操作如下述。

4）OD 值 〉2倍MDCK 细胞对照OD 值判定为阳性5）病毒滴度计算见组织细胞半数感染量滴定SOP 。

（2）血清样品：包括待检血清、阳性及阴性血清对照。

如果待检血清有可能需要多次检测，则需将待检血清进行小量分装，-20℃至-70℃保存均可，避免多次反复冻融。

YT 鉴定使用YT鉴定板提供94个生化测试反应来鉴定/特征化一系列酵母菌。

A—C行测定是颜色，以A1孔作为参照孔。

D—H行测定的是浊度，以D1孔作为参照孔。

鉴定板培养24，48，或/和72h，形成特定图谱，读取获得鉴定结果。

注意事项：1 用纯化后的菌落2 用特定的培养基，最好转接2代3 无菌操作，避免污染4 尽量用一次性玻璃器皿5 使用前预热接种用无菌水和鉴定板至室温6 校正浊度仪，配制特定浓度范围的菌悬液7 biolog的化合物包含对光和温度敏感的成分。

鉴定板孔颜色变为深褐色表明碳源也变质。

一些孔显示黄色或粉红色是正常的。

8 鉴定板测试的是活体细胞的代谢特性，一些菌在受到一些压力选择，如温度，PH，渗透压即使几秒也会失去代谢活力。

为得到最好的结果，一定确保细胞有活性，操作时也要注意。

无菌水自己制备无菌水，在无菌间将其转入biolog提供的相同的规格的玻璃管中。

（20ml 容量，20×150mm），每管放入12-15ml无菌水测试步骤1 在BUY培养基上26℃培养待鉴定的酵母菌。

凡能用YT鉴定板鉴定的菌都可以在该条件下培养生长。

2 样品准备及观察特征利用湿法制备（水片法）或革兰氏染色（如果需要的话）来确认待鉴定菌株是酵母菌。

转到BUY培养基培养，最好培养两代。

细胞需要新鲜培养，平板培养基上培养时间为24-48h如果菌量较少不足以接种鉴定板，多接几块平板，培养24-48h3 接种准备以装有空白无菌水玻璃管调100%T透光率用标准比浊管校正，应为47%T制备特定浓度菌悬液接种上鉴定板，不要操作20min，每孔100ul4 培养放于26℃培养鉴定板将板放入一个密闭的塑料袋或其他盒中，加入浸湿的纸团或毛巾，用以保持湿度，避免在培养过程中使鉴定板中菌悬液因蒸发而减少影响结果。

培养鉴定板24，48或72h，直到得到鉴定结果。

结果A1孔作为A-C行的参照孔，D1孔作为D-H行的参照孔。

以590nm处峰值用来分别测试A-C行的颜色变化，D-H行的浊度变化。