鸡胚1、尿囊腔接种2、绒毛尿囊膜接种3、卵黄囊等接种方式资料

篇一：鸡胚培养法鸡胚培养法（病毒分离培养）鸡胚是发育的机体，适合许多人类和动物病毒及立克次体的生长增值，常用于痘类病毒、粘液病毒、和疱疹病毒的分离、鉴定、抗原准备、疫苗生产以及病毒性质等方面的研究。

鸡胚培养病毒，常用的接种途径包括绒毛尿囊膜，尿囊腔、羊膜腔以及卵黄囊接种四种。

根据不同病毒，不同实验目的以及不同来源的标本，选择不同的途径接种鸡胚进行培养，即可达到分离培养病毒和传代病毒的目的。

本片主要介绍尿囊腔和羊膜腔两种接种途径在病毒分离培养和传代中的应用。

鸡胚的接种方法、孵育及收获一、仪器和器材spf鸡卵或鸡胚、二级生物安全柜、孵卵箱或恒温箱、检卵灯、照蛋灯、开卵钻、卵盘、1ml、1次注射器、医用胶布、液体石蜡、无菌镊子、巴氏吸管、15 ml无菌离心管、试管架、96孔微量反应板、加样槽、移液器、75%酒精、生理盐水等。

二、鸡胚的孵育应选择保存温度在100左右，时间不超过10天，卵壳薄而色浅的鸡卵，用于鸡胚的孵育。

特别脏的鸡卵需用清水清洗，用布擦干后孵育，干净的鸡卵不必做任何处理。

将鸡卵置于380c---390c孵卵箱，在孵卵箱底层盛水器中放入干净自来水，以保证鸡胚发育的湿度，病保持良好的通风，孵育至第四天，于检卵灯上检查鸡胚受精与否及发育情况。

受精鸡卵可见清晰地血管小团和发育的鸡胚迹象，似蜘蛛壮，未受精鸡卵仅能看见模糊的卵黄黑影，无鸡胚迹象。

在孵育过程中，应随时对鸡胚进行检查，淘汰濒死或已经死亡的鸡胚。

若在恒温箱里孵育鸡胚，则应在恒温箱底层放入装满水的广口容器，并从孵育的第3天起，每天180度转到鸡胚1—2次，是鸡胚发育匀称。

也可直接订购孵育9—11日龄的鸡胚。

如何判断鸡胚存活状态：1胎动：于检卵灯下可见活胎有明显的自然运动，但胎龄大于14天的胚胎，胎动不明显，甚至无胎动，死胎则无任何胎动，胎发红似出血样，有的呈现黑快。

2血管：活胚可见清晰地血管，卵壳较薄者还可见血管的搏动。

死胎血管模糊，成淤血带或淤血块。

室端 3）用钢锥在气室中央锥 一 小孔
4） 用注射器吸取病毒悬液，沿气室端所穿小
孔垂直刺入3cm，注入0.1-0.5ml病毒液。
5）用熔化的石蜡封孔，置孵卵箱内继续孵育，
每天翻卵1-2次，24h内死亡者废弃。
方法二：
1）2）同一 3）将卵横放在卵座上， 胚胎位置向下。在卵长 径的1/2处用碘酊和酒 精消毒。 4）用钢锥打一小孔，将针头刺入约1.5cm， 注入病毒液0.1-0.5ml 5）用熔化的石蜡封孔，置孵卵箱内继续孵
十二、收毒
收毒前将鸡胚直立放置于4℃冰箱半小时以上， 冻死胚胎，防止出血。 根据接种途径的不同，收获相应的材料
1、绒毛尿囊膜接种 收获接种部位绒毛尿囊膜
2、尿囊腔接种 收获尿囊液（5-8ml）
3、卵黄囊接种 收获卵黄囊或胚体
4、羊膜腔接种 收获羊水（0.5-1ml）
4、将注射器沿小孔插入0.5-1.0cm，注入
0.1-0.2ml接种物
5、用石蜡封口，并置孵卵箱中孵育，每天翻
卵并检卵一次，24h内死亡者废弃。
十一、NDV接种鸡胚后对鸡胚的影响
NDV以尿囊腔接种于9-10日龄鸡胚，强毒株 在30-60h死亡，弱毒株3-6d死亡。死亡的鸡胚 以尿囊液含毒量最高，胚胎全身出血，以头部、 足趾、翅膀出血尤为明显。
卵黄 在胚胎发育早期供给鸡胚营养。
卵白 在胚胎发育晚期供给鸡胚营养。
材料
1、鸡胚 10日龄
2、病毒 鸡新城疫病毒（NDV） 3、照蛋灯 4、打孔器 5、石蜡 6、注射器 7、蛋座 8、酒精棉球、碘酊棉球
鸡胚的选择
最好是来自SPF鸡群，以降低母源抗体的影响 受精卵的壳最好是白色的
受精卵必须新鲜，保存在5-20℃不要超过10天，

接种方法：
选 10 － 12 日龄鸡胚检卵后，标出气室边界和胚胎 位置。用碘酒消毒鸡卵钝端（气室上方）的蛋壳，在 气室上方靠近胚胎侧的卵壳上钻一孔，钻孔区再次用 碘酒消毒。用无菌眼科小剪子沿钻孔周围剪去少许， 开一小窗，勿损伤内层壳膜，经小窗向气室内滴入一 滴无菌液体石蜡。将卵置照卵灯上，可清楚地看到胚 胎的位置。将注射器瞄准胚胎的腭下胸前，刺入后注 入0.1－0.2ml接种物。用沾有碘酒通过火焰的小块胶 布将窗口封上。接种后的受精卵根据接种的病毒在 33℃、35℃或37℃的条件下孵育48－72小时。
第三天
胚长0.55cm，胚重20mg， 尿囊开始长出，胚的位 置与蛋的长轴垂直，开 始形成前后肢芽，出现5 个脑胞的原基，眼的色 素开始沉着，有35对体 节，照蛋时，可见胚和 伸展的卵黄囊血管形似 蚊子，俗称“蚊虫珠”；
第4天
胚长0.77cm，胚重50mg， 孵黄囊血管包围蛋黄达 1/3，肉眼明显看到尿囊， 羊膜腔形成，胚和蛋黄 分离，由于中脑迅速生 长，胚胎头部明显增大， 舌开始形成，照蛋时蛋 黄不容易转动，胚与卵 黄囊血管形似蜘蛛，俗 称小蜘蛛；
病毒分离培养
方法
应
用价值ຫໍສະໝຸດ 存 在 问 题自身带病毒； 有的接种后不敏感； 动物饲养问题 敏感病毒谱窄 设备技术要求条件高
应用最早； 动物 方法简便； 接种 结果易于观察 鸡胚 来源客观，易于管理，带 培养 病毒机会少；多途径接种 细胞 应用广泛，敏感病毒谱广 培养
鸡胚培养法的优点：
1. 它的组织分化程度低，可选择适当途径 接种，病毒易复制，感染病毒的膜和液体 含大量病毒。 2. 是个整体，有神经血管的分布及脏器的 构造。 3. 来源充足，操作简单，通常是无菌的， 对接种的病毒不产生抗体。

鸡胚培养前言：鸡胚培养法是用来培养某些对鸡胚敏感的动物病毒的一种培养方法，用牛痘病毒（vaccinia virus）和鸡新城疫病毒（Newcastle-disease virus）接种鸡胚。

牛痘病毒适宜于在绒毛尿囊膜上生长，经培养后，产生肉眼可见的白色痘疱样病变，似小结节或白色小片云翳状。

鸡新城疫病毒适宜接种在尿囊腔和羊膜腔内，生长后，鸡胚全身皮肤出现出血点，以脑后最显著。

基本原理鸡胚培养法是用来培养某些对鸡胚敏感的动物病毒的一种培养方法，此方法可用以进行多种病毒的分离、培养，毒力的滴定，中和试验以及抗原和疫苗的制备等。

鸡胚培养的技术比组织培养容易成功，也比接种动物的动物来源容易，无饲养管理及隔离等的特殊要求，且鸡胚一般无病毒隐性感染，同时它的敏感范围很广，多种病毒均能适应，因此，是常用的一种培养动物病毒的方法。

器材牛痘病毒液，鸡新城疫病毒液；白壳受精卵（自产出后不超过10天，以5天以内的卵为最好）；孵卵器，检卵灯，齿钻，磨壳器，钢针，蛋座木架，注射器，2．5%碘酒，70%酒精，镊子，剪刀，封蜡（固体石蜡加 1/4凡士林，溶化），灭菌培养皿，灭菌盖玻片等。

操作步骤1．准备蛋胚孵育前的鸡卵先用清水以布洗净，再用干布擦干，放入孵卵器内进行孵育（37℃，相对湿度是45—60%），孵育三日后，鸡卵每日翻动1—2次。

孵至第4日，用检卵灯观察鸡胚发育情况，未受精卵，只见模糊的卵黄黑影，不见鸡胚的形迹，这种鸡卵应淘汰。

活胚可看到清晰的血管和鸡胚的暗影，比较大一些的可以看见胚动，随后每日观察一次，将胚动呆滞或没有运动的、血管昏暗模糊者，即可能是已死或将死的鸡胚，要随时加以淘汰。

生长良好的蛋胚一直孵育到接种前，具体胚龄视所拟培养的病毒种类和接种途径而定。

2．接种1）绒毛尿囊膜接种（a）将孵育10—12天的蛋胚放在检卵灯上，用铅笔勾出气室与胚胎略近气室端的绒毛尿囊膜发育得好的地方。

（b）用碘酒消毒气室顶端与绒毛尿囊膜记号处，并用磨壳器或齿钻在记号处的卵壳上磨开一三角形或正方形（每边约5—6mm）的小窗，不可弄破下面的壳膜。

五、孵育
1. 孵卵箱内的温度应保持在37.5-38.5℃ 孵卵箱内的温度应保持在37.5 37.52. 相对湿度：50%-60% 相对湿度：50%3. 必须保证具有充 分的新鲜空气流 通，特别是在孵 天以后。 化5-6天以后。 4. 从孵育后第3天 从孵育后第3 开始， 开始，每天翻卵 一次。 一次。
（二）绒毛尿囊膜接种 主要用于痘V和疱疹V的分离和增殖。 主要用于痘V和疱疹V的分离和增殖。 方法一： 方法一： 1. 取10-12日龄鸡胚，画出气室部，消毒。 10-12日龄鸡胚，画出气室部，消毒。 日龄鸡胚 2. 在气室端的卵壳上开一1.5×1.5cm的口 在气室端的卵壳上开一1.5 1.5cm的口 1.5× 3. 用灭菌眼科镊子撕去一 小片内壳膜 4. 滴入接种物 5. 用胶布或透明胶纸封闭 切口
4. 用注射器吸取病毒悬液，沿气室 用注射器吸取病毒悬液， 端所穿小孔垂直刺入3cm 3cm， 端所穿小孔垂直刺入3cm，注入 0.1-0.5ml病毒液 病毒液。 0.1-0.5ml病毒液。 5. 用熔化的石蜡封孔，置孵卵箱内 用熔化的石蜡封孔， 继续孵育，每天翻卵1 继续孵育，每天翻卵1-2次，24h 内死亡者废弃。 内死亡者废弃。
十一、 十一、试验报告作业
1. 常用的鸡胚接种方法有哪些? 常用的鸡胚接种方法有哪些? 2. 简要说明鸡胚的结构及各部分结构的功能。 简要说明鸡胚的结构及各部分结构的功能。 3. 用鸡胚来进行病毒的培养要注意哪些问题? 用鸡胚来进行病毒的培养要注意哪些问题? 4. 如何区分无精卵、死胚、活胚？ 如何区分无精卵、死胚、活胚？ 5. 用于病毒培养的系统主要有哪些？ 用于病毒培养的系统主要有哪些？
用橡皮乳头紧贴于气室中央小孔上吸气用橡皮乳头紧贴于气室中央小孔上吸气造成气室内负压使卵窗部位的绒毛尿造成气室内负压使卵窗部位的绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室此时可见滴囊膜下陷而形成人工气室此时可见滴于壳膜上的生理盐水迅速渗入

一、实验目的1. 掌握鸡胚接种病毒的方法和步骤。

2. 了解病毒在鸡胚中的生长和繁殖情况。

3. 学习病毒分离和培养的基本原理。

二、实验原理鸡胚接种是一种常用的病毒分离和培养方法。

病毒接种于鸡胚后，能够在鸡胚中繁殖，从而便于观察和分析病毒的生物学特性。

本实验主要采用尿囊腔接种法，将病毒接种于鸡胚尿囊腔内，观察病毒在鸡胚中的生长和繁殖情况。

三、实验材料1. 实验动物：9-11日龄的鸡胚。

2. 实验试剂：新城疫病毒悬液、生理盐水、碘酒、酒精、消毒棉球等。

3. 实验仪器：照蛋器、无菌手术刀、镊子、注射器、剪刀、平皿等。

四、实验方法1. 鸡胚准备：取9-11日龄的鸡胚，用碘酒和酒精消毒鸡胚蛋壳，用手术刀在鸡胚气室处划一小孔，用注射器吸取适量新城疫病毒悬液。

2. 尿囊腔接种：将鸡胚置于卵盘上，气室端向上，用注射器将病毒悬液注入鸡胚尿囊腔内，注入量约为0.1-0.2ml。

3. 孵育：将接种后的鸡胚放入37℃孵卵箱中孵育48-72小时。

4. 观察：定期观察鸡胚的生长发育情况，记录死亡、畸形等现象。

5. 病毒分离：取出死亡鸡胚，无菌操作下取出尿囊液，进行病毒分离和培养。

五、实验结果1. 接种后，部分鸡胚出现死亡现象，死亡时间集中在接种后24-48小时。

2. 死亡鸡胚的尿囊液中检测到新城疫病毒。

3. 成活鸡胚生长发育正常，未出现明显异常。

六、实验讨论1. 鸡胚接种是一种简单、有效的病毒分离和培养方法，适用于多种病毒的研究。

2. 尿囊腔接种法是一种常用的鸡胚接种方法，适用于新城疫病毒、流感病毒等多种病毒。

3. 本实验结果表明，新城疫病毒能够在鸡胚中繁殖，为新城疫病毒的研究提供了有力支持。

七、实验结论1. 鸡胚接种是一种简单、有效的病毒分离和培养方法。

2. 尿囊腔接种法适用于新城疫病毒等多种病毒的分离和培养。

3. 本实验成功分离和培养了新城疫病毒，为新城疫病毒的研究提供了有力支持。

八、实验心得1. 实验过程中，无菌操作至关重要，需严格按照无菌操作规程进行。

2、手工接种方法
单孔接种：在胚蛋气室的中心位置打一 小孔，垂直刺入针头2cm,注入接种物，封孔， 放孵化器孵化。 双孔接种：在离气室0.3~0.5cm无大血 管处作一标记，作为接种孔的位置， 在气室 和标记处各打一个孔，自接种孔注入接种物， 封上 两个孔，放入孵化器孵化。
绒毛尿囊膜 气 室
卵膜
羊膜腔
卵黄的收获：打开气室，撕开内壳膜，用镊 子夹出卵黄膜，放入灭菌平皿中，也可以 将整个卵黄物倒入平皿中，选取卵黄囊。* 2、照胚：接种后的温度一般设置于36.537℃，不翻蛋，根据产品的不同选择孵化 的时间和照胚的时间，一般2~7天。照胚前 要检查孵化器的温度、湿度是否正常。
然后再照胚，照蛋灯从气室部位向下照，死胚 发白发亮，血管脱落或血管变细，活胚发红， 蛋体布满血管，可见到活动的鸡胚。绒毛尿 囊膜接种的鸡胚，绒毛膜上可见明显的斑点。 根据产品的要求，留下所要的死胚、活胚， 及时取出并做好标记，放入0~4℃冷库，冷 却4~24h,准备收获。
鸡 胚
卵黄囊 尿囊腔 卵 白
尿囊腔鸡胚接种图

尿囊膜接种
羊膜鸡胚接种图
卵黄囊鸡胚接种图
3、蛋胚消毒 常用的消毒方法： 喷雾消毒、表面擦拭消毒脱 碘的消毒方法、浸泡消毒法。 喷雾消毒：将消毒剂喷于蛋胚表面的消毒方法。 表面擦拭消毒： 用4%的碘酒擦拭蛋壳接种 部位和气室部位，在用75%的酒精脱碘的消 毒方法。 浸泡消毒：将胚蛋浸泡在消毒液中的消毒法。
【操作技能】手工接种 常用物品的准备：注射器、锥子、止血钳、碘 酒棉、酒精棉、酒精灯、 喷壶、废弃缸、冰 袋、种毒，稀释液、白蜡。 操作步骤: 按要求取出适龄的胚蛋，画接种点， 进行表面消毒。在胚蛋的接种部位和气室部 位打孔，绒毛尿囊膜接种要做人工室。 安装连续注射器，调节使用刻度，排出空气。 在胚蛋的接种部位接种。

病毒的鸡胚培养
（一）实验目的 （二）实验原理 （三）实验器材 （四）实验方法 （五）实验作业
（一）实验目的
1.了解鸡胚培养有哪几种常用的接种方法。 2.掌握鸡胚尿囊腔接种培养鸡新城疫病毒的操作技术
。
（ 实二验）室培实养验病原毒常理使用动物接种和鸡胚培养两种方
法，而鸡胚培养更为常见。一般而言，禽病毒病大 部分可经鸡胚分离病毒，其他动物病如犬瘟热也可 经鸡胚分离病毒。
（五）实验作业
1.用鸡胚培养病毒，在选用鸡胚时应注意什么问题？ 2.绒毛尿囊腔内接种在培养和收毒过程中应注意哪些
问题？
鸡胚接种技术是养禽业中一种相对新的疫苗接种方法 。这种方法就是对孵化后期的鸡胚接种某些活的病毒 疫苗。这些病毒疫苗不会对孵化率产生不利的影响， 通过这种方式接种疫苗后孵出的雏鸡具有免疫保护力 。
（三）实验器材
1.鸡胚：要选择SPF鸡胚或低母源抗体的鸡胚。从 实践看，法氏囊炎病毒对抗体相当敏感，所以要 用无母源抗体的鸡胚；而新城疫病毒、禽流感病 毒等可抵御母源抗体的作用而得以繁殖致死鸡胚 。
法氏囊病毒的分离
取疑似感染病毒的法氏囊，称重，按1:5（w/v）加入 生理盐水，研磨，-20℃，反复冻融2次；每次冷冻时 间以研磨物结冰为准；
将冻融物转入离心管中，3000转/分，离心5分钟，将 上清取出，使用无菌滤器过滤
2.接种
鸡胚接种的方法有几种：
绒毛尿囊腔内接种
★★
绒毛尿囊膜接种
羊膜腔接种
1.鸡胚胎2.羊膜腔3.绒毛尿囊膜4.羊膜
卵黄囊内接种
选择6-8日龄的鸡胚 ，照蛋检查，划出气 室和胎位，并以气室 向上竖立在蛋托上， 气室端的蛋壳经消毒 后以打孔器钻一小孔 ，将注射针头刺过小 孔，沿着卵的纵轴刺 入约3cm，然后注入 0.2ml的病毒接种液 ，用氧化锌胶布及石 蜡封口后放回孵化器 中培养。

这些病毒被接种到尿囊腔后，可在内皮细胞中复制，
复制的病毒被释放到尿囊液中，因此，在尿囊液中喊 与大量的病毒。
鸡胚接种技术
——鸡胚的接种途径和方法
✪
卵黄囊接种：
这些大的病原体能在卵黄囊的内皮细胞中快速生长。
用于虫媒病毒、衣原体及立克次体等的分离和繁殖，
鸡胚接种技术
——鸡胚的结构与生理 ✪ 鸡胚的发育过程：Day 3
鼻、腿、翅开始形成，器官出现。 尿囊开始长出，胚胎的位置与蛋的长轴垂直。 胚胎与延伸的卵黄囊血管形似蚊子。
鸡胚接种技术
——鸡胚的结构与生理 ✪ 鸡胚的发育过程：Day 4
尿囊和羊膜腔形成。 卵黄体积继续增大，卵黄囊血管包围卵黄近1/3。 胚胎与卵黄囊血管形似蜘蛛。
主要用于分离和繁殖在绒毛尿囊膜上产生斑点状和痘 可在绒毛尿囊膜上滴定这些病毒，通过产生斑和痘的 数目来计算感染性病毒颗粒的数目。 还可用于抗体滴定，因为斑和痘数目减少的程度与抗 体浓度有关。
鸡胚接种技术
——鸡胚的接种途径和方法
✪
尿囊腔接种：
应和传代培养。
用于流感病毒、流行性腮腺炎病毒和新城疫病毒的适
✪ 卵黄囊
主要营养的存储场所，在胚胎发育早期供给鸡胚营养
✪ 卵白
在胚胎发育晚期供给鸡胚营养
鸡胚接种技术
——鸡胚的孵育和检查
✪ 受精鸡卵的选择
接种病毒的受精鸡卵应未感染已知病毒或其它微生
物，最好来自无特定病原体(Specified Pathogen
Free, SPF)鸡群。 受精卵的壳最好是白色的，利于检卵灯观察鸡胚的 发育情况。 受精卵必须新鲜，保存在5~20℃不超过10天。
鸡胚接种技术
——鸡胚的孵育和检查

尿囊膜贴在卵壳内壁上，用镊子夹住将其撕脱下来即
可。
胚胎：消毒、打开气室卵壳后，用镊子撕破卵壳膜和
绒毛尿囊膜，夹起胚胎，用剪刀剪断卵黄带，将胎儿
放灭菌容器内即可。
8.鸡胚接种注意事项
（1）接种材料一般都应按每毫升1000ＩＵ或μg加入 青、链霉素。
（2）接种位点应避开鸡胚、血管和胚头，以免针头 刺伤鸡胚而造成接种后的损伤性死亡。
实验一 鸡新城疫油乳剂灭活苗的制备技术（一）
新城疫病毒可以在鸡胚中大量增殖，收获的鸡胚
尿囊液中即含有新城疫活病毒，将收获的尿囊液经过
灭活，并加入佐剂，便制成了新城疫灭活疫苗。
目的和要求：
1.掌握鸡胚的孵化过程和鸡胚的接种途径、接 种方法； 2.掌握新城疫病毒在鸡胚尿囊腔的增殖过程， 掌握接毒和收毒的方法。
头约1cm左右。
4.病料接种：
若用鸡胚分离、培养病毒，则应选9～12日龄之
间的发育鸡胚。许多病毒，特别是大多数禽病毒都能
在鸡胚或鸭胚中生长繁殖。接种时应先在照蛋器下检 查鸡胚是否健康、活泼，并划出气室和接种部位。然 后严格消毒接种部位和气室（先用碘酊消毒，再用 70%酒精消毒），用打孔器打孔后，每胚接种处理好
水瓶中，使两种抗生素在生理盐水中的含量均
达到1000-2000 IU(μg)/ml。将注射用生理盐
水3-4ml注入一瓶新城疫Ⅳ系弱毒疫苗中，稀释。
3.照蛋定位 ： 接种前应在照蛋器下检查鸡胚，挑出死胚 和弱胚。对所有健康胚应先用红铅笔画出气室 位臵，再于胚胎侧画出接种位点（进针点）， 接种点应避开大血管，靠近气室边缘处，离胚
此法适用于马立克氏病毒、披膜病毒、衣
原体及立克次氏体的分离、培养。接种方法：
气室端蛋壳消毒后，在气室中央打一小孔，用

（四）收获病毒
鸡胚为活的有机体，因此要严格无菌操作， 同时动作要仔细，以免造成物理死亡。接种 后24小时内死亡应不计结果。
病 毒 的 鸡 胚 培 养 法
刘映乐
1911年 Rous首先将鸡胚应用于Rous肉瘤病 毒的培养 1938年 Cox应用卵黄囊培养立克次氏体
鸡胚培养法的优点：
1. 组织分化程度低
2. 有神经血管的分布及脏器的构造
3. 来源充足，操作简单 4. 胚体通常无菌
5. 对接种的病毒不产生抗体
鸡胚培养法的缺点：
（三）接种途径
尿囊腔接种
该途径一般用于病毒的（流感、新城鸡瘟病毒 和腮腺炎）适应和传代。
尿囊腔接种
卵黄囊接种
该途径主要用于抗病毒（流感）的药物实验。
羊膜腔接种
该途径主要用于临床材料（如患者的鼻洗液及咽 漱液）的病毒分离。
绒毛尿囊膜接种
该途径主要用于病毒滴定、中和试验和药物实验。
1. 病毒通常不能使鸡胚产生特异性的感染指征。 2. 常规饲养方式的不足
3. 培养病毒的种类有限
鸡胚的结构与生理
鸡胚由三个胚层发育而来，即外胚层，中胚
层和内胚层，它们构成了胚胎的组织与器官
鸡 胚 培 养 的 病 毒 接 种（一）活胚检查 Nhomakorabea1.血管
2.胎动 3.绒毛尿囊膜
（二）实验材料
鸡受精卵, 照蛋灯, 打孔器或剪刀, 蛋盘, 无菌注 射器和针头, 消毒酒精, 酒精灯, 石腊 病毒毒种用生理盐水稀释备用

鸡胚培养法（病毒分离培养）鸡胚是发育的机体，适合许多人类和动物病毒及立克次体的生长增值，常用于痘类病毒、粘液病毒、和疱疹病毒的分离、鉴定、抗原准备、疫苗生产以及病毒性质等方面的研究。

鸡胚培养病毒，常用的接种途径包括绒毛尿囊膜，尿囊腔、羊膜腔以及卵黄囊接种四种。

根据不同病毒，不同实验目的以及不同来源的标本，选择不同的途径接种鸡胚进行培养，即可达到分离培养病毒和传代病毒的目的。

本片主要介绍尿囊腔和羊膜腔两种接种途径在病毒分离培养和传代中的应用。

鸡胚的接种方法、孵育及收获一、仪器和器材SPF鸡卵或鸡胚、二级生物安全柜、孵卵箱或恒温箱、检卵灯、照蛋灯、开卵钻、卵盘、1ml、1次注射器、医用胶布、液体石蜡、无菌镊子、巴氏吸管、15 ml无菌离心管、试管架、96孔微量反应板、加样槽、移液器、75%酒精、生理盐水等。

二、鸡胚的孵育应选择保存温度在100左右，时间不超过10天，卵壳薄而色浅的鸡卵，用于鸡胚的孵育。

特别脏的鸡卵需用清水清洗，用布擦干后孵育，干净的鸡卵不必做任何处理。

将鸡卵置于380C---390C孵卵箱，在孵卵箱底层盛水器中放入干净自来水，以保证鸡胚发育的湿度，病保持良好的通风，孵育至第四天，于检卵灯上检查鸡胚受精与否及发育情况。

受精鸡卵可见清晰地血管小团和发育的鸡胚迹象，似蜘蛛壮，未受精鸡卵仅能看见模糊的卵黄黑影，无鸡胚迹象。

在孵育过程中，应随时对鸡胚进行检查，淘汰濒死或已经死亡的鸡胚。

若在恒温箱里孵育鸡胚，则应在恒温箱底层放入装满水的广口容器，并从孵育的第3天起，每天180度转到鸡胚1—2次，是鸡胚发育匀称。

也可直接订购孵育9—11日龄的鸡胚。

如何判断鸡胚存活状态：1胎动：于检卵灯下可见活胎有明显的自然运动，但胎龄大于14天的胚胎，胎动不明显，甚至无胎动，死胎则无任何胎动，胎发红似出血样，有的呈现黑快。

2血管：活胚可见清晰地血管，卵壳较薄者还可见血管的搏动。

死胎血管模糊，成淤血带或淤血块。

3绒毛尿囊膜发育界限：生活良好的胚胎可见密布血管的绒毛尿囊膜，与胚胎的另一面形成良好的界限须将上面三个方面结合起来进行观察，如果胚胎活动呆滞或不能主动地运动，血管模糊扩张，或折断沉落，绒毛尿囊界限模糊，则可判断胚胎濒死或已经死亡。

病毒的鸡胚接种技术目的要求掌握鸡胚培养病毒的接毒和收毒方法，明确鸡胚培养病毒的应用。

仪器及材料受精卵、恒温箱、照蛋器、接种箱、蛋架、一次性注射器（1～5ml）、中号镊子、眼科剪和镊子、毛细吸管、橡皮乳头、灭菌平皿、试管、吸管、酒精灯、试管架、胶布、蜡、锥子、锉、煮沸消毒器、消毒剂（5%碘酊棉、75%酒精棉、5%石炭酸或3%来苏儿）、新城疫Ⅰ系或Ⅳ系疫苗。

方法与步骤（尿囊接种为例）1．选择9～12日龄的健康鸡胚，最好是SPF鸡胚。

为便于照蛋观察，以来航鸡蛋或其他白壳蛋为好。

选好后用孵化箱孵化，要注意温度、湿度和翻蛋。

孵化最低温度为36℃，一般为37.5℃，相对湿度为60%。

每日最少翻蛋3次。

健康鸡胚：照蛋时可见清晰的气室、血管及鸡胚的活动。

2．病毒材料的处理怀疑污染细菌的液体材料：加抗生素（青霉素1000IU和链霉素1000μg/ml）置室温1h或4℃冰箱12～24h→高速离心，取上清液→细菌滤器滤过除菌若用新城疫Ⅰ系或Ⅳ系疫苗，则无菌操作用生理盐水将其稀释100倍。

3．照蛋以铅笔划出气室、胚胎位置及接种的位置，标明胚龄及日期气室朝上立于蛋架上。

4．消毒先碘酊后酒精，由内向外呈同心圆状消毒5．打孔用灭菌小锥子在在气室中心或远离胚胎侧气室边缘，避开大血管进行打孔，孔径以1ml注射器针头容量刺入为宜。

6．注入病毒材料用一次性1ml注射器吸取新城疫病毒液垂直或稍斜插入气室，刺入尿囊，向尿囊腔内注入0.1～0.3ml。

7．封孔并继续孵化注射后，用熔化的石蜡封孔，置温箱中直立孵化3～7d。

孵化期间，每6h照蛋一次，观察胚胎存活情况。

弃去接种后24h内死亡的鸡胚，24h以后死亡的鸡胚应置0～4℃冰箱中冷藏4h或过夜（气室朝上直立），一定时间内不能致死的鸡胚也放冰箱冻死。

8．收毒收毒原则：（1）先冷藏再收毒。

（2）接种什么部位，收集什么部位。

（3）固液分开收集。

（4）无菌收集。

（5）冷冻保存。

收毒方法：无菌操作轻轻敲打并揭去气室顶部蛋壳及壳膜，用灭菌镊子夹起并撕开或剪开气室中央的绒毛尿囊膜，然后用灭菌吸管从破口处吸取尿囊液，注入灭菌青霉素瓶或试管内。