铁皮石斛内生细菌的分离和初步鉴定
摘要：以野生药用植物铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）为研究
对象，采用无菌操作技术分离到内生细菌23株，其中来源于根、茎、叶的分别
为7株、8株、8株。通过形态学观察和染色等，初步鉴定了铁皮石斛内生细菌
具有7个属，包括土壤杆菌属（Agrobacterium）、芽孢杆菌属（Bacillus）、泛菌
属（Pantoea）、乳杆菌属（Lactobacillus）、梭菌属（Clostridium）、黄杆菌属
（Flavobacterium）、葡萄球菌属（Staphylococcus）。研究丰富了我国细菌资源，
为铁皮石斛内生菌资源的开发利用提供了理论依据。
关键词：铁皮石斛；内生细菌；分离；鉴定
铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）为兰科石斛属药用植物，
主要分布在我国云南、浙江、广西、贵州等地区。铁皮石斛具有抗肿瘤、抗辐射、
抗血小板凝集、增强机体免疫力等功效，是我国传统的名贵中草药[1]。随着需
求量的日益增加，野生铁皮石斛被无序采集，自然资源日趋减少，部分种类已濒
临灭绝。植物内生菌作为一种重要的微生物资源，是植物微生态系统的重要组成
部分，也是新型天然活性物质的重要来源之一[2]。然而，在我国药用植物开发
和利用中，对内生菌的研究相对较少，目前已研究涉及的药用植物内生菌只有
300余种，这相对于我国丰富的药用植物资源（11 146种）还相差很远。因此，
开展我国药用植物内生菌研究，特别是其生物多样性和化学多样性研究是非常必
要的。目前，关于铁皮石斛内生菌多样性的研究已有报道[3-6]，但仅限于其内生
真菌的研究。研究采用形态学鉴定方法，系统分离铁皮石斛内生细菌，为丰富我
国细菌资源和促进铁皮石斛保护性开发利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物来源 新鲜健康野生铁皮石斛于2011年10月采自浙江天台山，保
持整棵植株的完整性带回实验室，4 ℃保存，24 h内处理。
1.1.2 培养基 NA培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨5 g，葡萄糖2.5 g，氯化钠5
g，琼脂16 g，去离子水1 000 mL；分离培养基：每毫升NA培养基中加入100 IU
两性霉素B，用于内生细菌分离纯化。NB培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨5 g，葡
萄糖2.5 g，氯化钠5 g，去离子水1 000 mL；半固体培养基：牛肉膏1.8 g，蛋
白胨4 g，葡萄糖20 g，酵母浸出液1.3 g，NaCl 3 g，Na2HPO4 1 g，MgCl2 0.05
g，FeSO4·7H2O 0.05 g，琼脂为5 g，去离子水1 000 mL，用于穿刺培养[7]。
1.2 方法
1.2.1 内生细菌的分离纯化 铁皮石斛植株用清水冲洗干净后，选取适量根、
茎、叶，在75%乙醇中浸泡30 s，再置于2%次氯酸钠中5～10 min（根和茎消
毒10 min，叶消毒6 min），用无菌水冲洗4次后，在无菌条件下将根和茎切为
0.5 cm长的小段，叶切为0.5 cm × 0.5 cm的小片。选取根、茎、叶各10小段（片）
作为铁皮石斛供试组织材料接入分离培养基中，在37 ℃培养箱中恒温培养7 d。
每天定时检查内生细菌长出情况，及时挑取切口处新长出的细菌菌落，并转移到
NA培养基中，纯化培养直至获得单一纯菌株。最后，将获得的纯菌株转接到
NA培养基，37 ℃培养箱中培养10 d，供观察鉴定和保藏。同时，用最后一次
漂洗供试材料的无菌水涂布于分离培养基平板上作为对照，同样条件下培养观
察，确保样品表面彻底消毒，保证分离到的菌株确实是内生细菌[8-10]。
1.2.2 内生细菌的初步鉴定 内生细菌的初步鉴定参照文献[11，12]的方法进
行。
1）菌落形态观察。将纯菌株接到NA培养基中培养，每天定时观察，记录
每个菌落的大小、形状、颜色、含水状态、菌落透明度、边缘情况以及菌落形成
速度等，同时观察记录液体培养过程中菌落性状，观察其在试管中的生长部位，
得出其对氧的需求情况。
2）革兰氏染色。取干净载玻片，滴一滴去离子水，用接种针挑取菌龄为20
h的菌苔少许，均匀涂布在载玻片上，风干固定；用含结晶紫的混合染液染色约
1 min后水洗；碘液作用约1 min水洗，吸干；用95%乙醇或丙酮乙醇溶液脱色
至无色（约30 s）；用番红液染色5～6 min后水洗，风干；镜检。
3）荚膜染色。采用湿墨水法进行荚膜染色，菌龄72 h，操作步骤为：加一
滴墨水于洁净的载玻片上，挑取少量菌体与其混合均匀；盖上盖玻片，取一张滤
纸放在盖玻片上，轻轻按压以吸去多余的混合液；仔细观察，若背景灰色，菌体
较暗，菌体周围呈现明亮的透明圈，即为阳性，说明有荚膜；反之则为阴性，表
示无荚膜。
4）穿刺培养。将按上述配置好的半固体培养基灭菌后，待其冷至50 ℃左
右，用无菌移液管转入试管中，培养基约占管体的1/3，并将其置于试管架中，
待其冷却后，将NB培养基中培养24 h后的菌体用接种针蘸取菌液，迅速插入
半固体培养基试管中，并迅速取出接种针，此过程要求动作迅速，不拖沓。穿刺
培养细菌可用于厌氧性或兼性厌氧性细菌的培养，根据细菌自穿刺部位的扩散状
况来了解细菌的运动性能。
5）芽孢染色。将菌龄为48 h的细菌固定在载玻片上，滴加5%孔雀绿染液，
用酒精灯火焰加热至染液冒蒸汽时开始计时，约维持8～10 min，加热过程中要
随时添加染色液，保持湿润，切勿让标本干涸；待玻片冷却后用水轻轻地冲洗，
直至流出的水中无染色液为止；再用番红液染色5 min后水洗，晾干或吸干水分，
镜检，如呈绿色，表明有芽孢存在，如呈红色，表示没有芽孢。2 结果与分析
2.1 铁皮石斛内生细菌分类鉴定
通过系统分离纯化，从铁皮石斛中共获得内生细菌菌株23株，其中来源于
根、茎、叶的分别为7株、8株、8株。通过形态学观察和染色等，初步鉴定了
铁皮石斛内生细菌属于7个属，包括土壤杆菌属（Agrobacterium）、芽孢杆菌属
（Bacillus）、泛菌属（Pantoea）、乳杆菌属（Lactobacillus）、梭菌属（Clostridium）、
黄杆菌属（Flavobacterium）、葡萄球菌属（Staphylococcus），表明铁皮石斛内生
细菌具有一定的生物多样性。铁皮石斛内生细菌的种类及其主要特征见表1，土
壤杆菌和泛菌为分离频率较高的优势菌种，而黄杆菌和葡萄球菌的分离率较低，
其中黄杆菌仅在铁皮石斛叶子中存在。
2.2 铁皮石斛内生细菌种类分布情况
铁皮石斛内生细菌种类分布情况见表2。表2结果表明，铁皮石斛的茎、叶
和根中含有不同种类和数量的内生细菌，根中含有内生细菌菌株7株，属于5
个属；茎中有内生细菌8株，属于4个属；叶中含有内生细菌8株，属于5个属。
在分离到的铁皮石斛内生细菌中，泛菌属和土壤杆菌属的数量最多，各5株，其
次为芽孢杆菌属4株，而黄杆菌属数量最少，仅有1株。铁皮石斛内生菌虽然普
遍存在于其所有营养器官中，但也表现一定的宿主特异性，如梭菌存在于所有的
营养器官中，而黄杆菌只存在叶中；根中没有葡萄球菌，茎中没有泛菌和乳杆菌，
叶不存在土壤杆菌和芽孢杆菌。
3 小结与讨论
铁皮石斛内生细菌含有较丰富的生物多样性，具有有一定的组织、宿主差异
性。研究不但丰富了我国细菌资源，而且为铁皮石斛内生细菌的生物活性物质筛
选和开发铁皮石斛资源提供了基础理论依据。同时，建议在药用植物内生菌生物
多样性研究之前，必须确定合适的采样方法，除采集新鲜、健康植株外，还应扩
大采样数量和采样地点，这样内生菌的种类可能还会增加[13]。关于铁皮石斛内
生细菌的种名还需要采用分子生物学手段和生理生化试验来确定，如16 S rRNA
序列分析等，这些工作还有待进一步研究。
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