痢疾杆菌分离与鉴定培训

痢疾杆菌的生物危害评估概述细菌性痢疾(简称菌痢)是由志贺氏菌引起的一种急性肠道传染病，主要临床表现为全身中毒症状、腹痛、腹泻、里急后重、脓血便、黏液便等。

全球每年志贺氏菌感染人次估计为1.65亿。

发达国家发病率约为1.8-6.5/10万。

我国目前菌痢的发病率仍显著高于发达国家，2003年的监测数据显示菌痢全国发病率39.4／10万。

细菌性痢疾在我省分布极为广泛，历年来其发病率居各种法定传染病前列。

1979年发病率最高达到1601.10/10万，1983年后发病率逐年下降。

2002、2003年发病率分别为40.16/10万、47.07/10万。

病死率从1951年以来明显下降，到1967年以后一直稳定在0.19%以下，2002、2003年病死率分别为0.08%、0.12%。

我省细菌性痢疾发病以农民、学生和散居儿童为主。

1.病原微生物1.1 分类与生物学特性志贺菌属（Shigella）又称痢疾杆菌，为革兰氏染色阴性的兼性厌氧菌，无鞭毛及荚膜，不形成芽胞，无鞭毛、不具动力。

在普通培养基中生长良好，分解葡萄糖，产酸不产气。

大多数志贺菌不分解乳糖，但宋内志贺菌能迟缓发酵乳糖。

根据生化反应与抗原结构的不同，志贺菌分为4群。

A群为志贺氏菌群，有12个血清型；B群为福氏菌群，有16个血清型；C群为鲍氏菌群，有18个血清型；D型为宋内氏菌群，仅有1个血清型。

各群痢疾杆菌在菌体裂解时均释放出内毒素，但产生外毒素的能力各种群差异很大，其中以志贺氏痢疾杆菌产生外毒素的能力最强，故临床症状较为严重。

1.2病原微生物的来源痢疾杆菌主要随病人及带菌者的粪便排出体外，污染食物、水、生活用品或手,经消化道使人感染。

痢疾杆菌亦可通过苍蝇污染食物而传播。

1.3病原微生物在外界的抵抗力志贺氏菌的最适宜的生长温度为37℃，不耐热及干燥，阳光直射即有杀灭作用，加热60℃10分钟即死亡；但耐寒能力强，在阴暗潮湿及冰冻环境下能生存数周，在蔬菜、瓜果、腌菜中能生存1～2周。

一、引言细菌性痢疾（Bacillary dysentery）是一种常见的肠道传染病，由志贺菌属细菌引起，主要通过粪-口途径传播。

为了提高我们对细菌性痢疾的认识和防治能力，我们组织了一次细菌性痢疾实训活动。

本次实训旨在了解细菌性痢疾的病原学、流行病学、临床表现、诊断及防治措施，现将实训总结如下。

二、实训内容1. 病原学实训中，我们学习了志贺菌属细菌的分类、生物学特性、致病机制等。

志贺菌属细菌分为A、B、C、D四群，其中A群、B群、C群主要引起人类感染，D群主要引起动物感染。

志贺菌属细菌具有侵袭力、毒素、菌毛等致病因素，通过破坏肠道黏膜屏障，引起炎症反应。

2. 流行病学细菌性痢疾的流行病学特征包括：传染源、传播途径、易感人群。

传染源主要是患者和带菌者，主要通过粪-口途径传播，如饮用污染的水、食用未洗净的蔬菜水果等。

易感人群包括儿童、老年人、免疫力低下者等。

3. 临床表现细菌性痢疾的临床表现包括：发热、腹痛、腹泻、里急后重、脓血便等。

重症患者可出现中毒性休克、呼吸衰竭等严重并发症。

4. 诊断细菌性痢疾的诊断主要依据临床表现、流行病学史和实验室检查。

实验室检查包括粪便常规、粪便培养、血清学检测等。

5. 防治措施细菌性痢疾的防治措施包括：控制传染源、切断传播途径、保护易感人群。

（1）控制传染源：对疑似患者和确诊病例实行隔离治疗，加强粪便管理，对污染的物品进行消毒。

（2）切断传播途径：加强饮用水、食品卫生管理，普及卫生知识，提高个人卫生习惯。

（3）保护易感人群：加强免疫力低下者的防护，开展疫苗接种。

三、实训收获1. 提高了我们对细菌性痢疾的认识，了解了其病原学、流行病学、临床表现、诊断及防治措施。

2. 学会了细菌性痢疾的实验室检测技术，如粪便常规、粪便培养等。

3. 增强了团队合作意识，提高了应对突发公共卫生事件的能力。

4. 培养了严谨求实的科学态度，为今后的工作打下了坚实基础。

四、实训不足与建议1. 实训过程中，部分同学对细菌性痢疾的病原学、流行病学知识掌握不够扎实，建议在今后的实训中加强理论知识的讲解和复习。

粪便中病原菌的分离培养与鉴定[摘要]目的：从粪便中分离、培养和检测病原菌，对于临床治疗及预后调查有一定的价值。

粪便标本中常见的病原菌有志贺氏菌属、致病性大肠杆菌、弧菌属、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等，各种正常菌群含量甚多，仅以染色性和形态无法分辨是否为病原菌。

此次我们主要分离培养并鉴定粪便标本中的大肠埃希菌和痢疾志贺菌[3]。

方法：本文利用伊红美蓝平板培养后的菌落特征，再提纯培养细菌进行革兰染色镜检、动力实验、生化反应。

可鉴定粪便标本中的病原菌。

[关键词]革兰染色大肠埃希菌志贺菌分离培养鉴定1.实验材料与仪器1.1标本：粪便标本1.2培养基：普通琼脂平板、伊红美蓝平板、营养琼脂斜面培养基、营养肉汤液体培养基、半固体琼脂培养基1.3试剂：细菌干粉培养基革兰染色法[1]试剂【结晶紫、碘酒、95%乙醇、稀释复红】、糖发酵管【乳糖、葡萄糖】、褔氏志贺菌诊断血清。

1.4仪器：接种环、接种针、酒精灯、试管架、恒温培养箱、显微镜、蒸馏水、玻片缸、消毒液、1‰新洁尔灭、灭菌平皿、刻度吸管、吸水纸、橡皮筋。

2.实验过程2.1细菌的分离与培养细菌分离培养：伊红美蓝平板分区划线分离（5区）。

无菌操作取粪便标本于固体平板培养基上，采用分区画线分离法培养细菌。

于37℃培养24小时，从而分离出单个菌落。

2.2细菌群体生长特征的观察观察形成菌落的大小、形状、边缘、表面、色素。

粪便标本在伊红美蓝平板上，有紫黑色、淡粉红色两种菌落。

紫黑色菌落具有金属光泽、大而隆起、不透明，菌落直径2～3mm。

淡粉红色菌落，半透明，直径1～2mm。

2.3细菌纯培养粪便标本在伊红蓝平板上，有紫黑色，粉红色两种菌落。

分别挑选这两种菌落在斜面培养基上接种标记，在37℃培养24h。

2.3.1斜面接种法选择平板上相同的菌落数多的、典型的、容易挑取的单菌落在平皿底部玻璃上，画个大圈选择菌落，右手拿接种环通过火焰烧灼灭菌，再用灭菌的接种环套住菌落，轻刮取菌，将其伸入代接斜面试管底部，轻轻向上划线，接接种环退出斜面试管，再用火焰烧管口，并在火焰边将试管塞塞上，观察斜面培养基。

项目10：标本中未知细菌的分离和鉴定【目的要求】熟悉临床标本中常见的病原性细菌的分离鉴定方法。

【实验内容】一、脓汁、咽拭子等标本中病原性细菌的分离与鉴定（一）标本采集1．脓拭子：用无菌棉签蘸取患处深部脓液或分泌物少许，置入无菌空试管内，送检。

2．痰拭子：用消毒容器收集病人痰液，用无菌棉签挑取脓稠痰块，置入无菌空试管内，送检。

3．咽拭子：嘱病人把口张大，用压舌板压住舌根，用无菌棉签迅速蘸取咽部分泌物，置入无菌空试管内，送检。

4．血标本：疑为败血症患者，在严格无菌操作下，静脉采血，床旁直接加入含50ml的肉汤瓶内，立即摇匀后送培养。

5．脑脊液：对疑似流脑患者，作腰椎穿刺取脑脊液，立即行直接床旁接种(送检过程中应注意保温)。

6．尿道、阴道分泌物：对可疑淋病患者，男性可从尿道取材，取材时导尿管应进入尿道1cm～2cm，如为刚排尿，应等待1h左右；女性则可以从宫颈口取分泌物，当内窥器插入宫颈口后应稍等片刻，再旋转取出，取材应立即送检，不可放置冰箱。

（二）分离鉴定程序待检标本可直接做涂片染色检查鉴定，必要时可做分离培养、生化反应及致病性鉴定。

常见的致病性球菌检查程序如下。

直接涂片、革兰染色、镜检（形态、排列、染色性）脓、痰、咽拭子分泌物、脑脊液观察菌落性状、溶血性、色素血琼脂平板→↑挑取可疑菌落生化反应血液、穿刺液→肉汤培养基纯分离致病性测定↓药敏试验如培养液混浊时可涂片、染色、镜检（三）常见临床标本的检查方法1．脓拭子在脓汁中除了球菌外，也有杆菌存在，例如革兰阳性的有炭疽杆菌、白喉杆菌、结核杆菌、枯草杆菌等，革兰阴性的有大肠杆菌、绿脓杆菌、变形杆菌等，此外尚可有真菌、放线菌、螺旋体等。

【材料】（1）标本：脓拭子（2）培养基：血琼脂平板（3）兔血浆、白色滤纸片、无菌生理盐水、载玻片【方法】脓汁→革兰染色→镜检↓↑血琼脂平板→观察菌落形态及溶血情况↓致病力试验(1)将脓拭子作革兰染色，镜检(先作培养再涂片以免污染)。

模拟粪便中伤寒沙门菌的分离与鉴定肠杆菌科（Enterobacteriaceae）细菌是一大群生物学性状相似的革兰阴性杆菌，常寄居于人及动物的肠道内，亦存在于土壤、水和腐物中[1]。

多数是非致病菌或条件致病菌，少数为致病菌。

其生物学性状相似，但生化反应，抗原构造有差异，故可据此将它们进行分类、鉴定。

粪便中肠道菌的分离与鉴定对于临床病原学诊断具有重要意义。

1.材料与方法1.1 材料1.1.1模拟粪便、普通琼脂平板培养基、SS平板培养基、葡萄糖微量发酵管、乳糖微量发酵管、尿素酶微量管、醋酸铅培养基微量管、蛋白胨水培养基、吲哚试剂、半固体培养基、伤寒诊断血清、37℃恒温培养箱等。

1.2 方法1.2.1细菌分离培养取模拟粪便标本分区划种于SS平板培养基，置37℃培养箱培养18~24h后，观察结果，并对分离所获的菌落的细菌进一步鉴定。

1.2.2 细菌的生化反应挑取可疑菌落（无色菌落）的细菌，分别接种于葡萄糖微量发酵管、乳糖微量发酵管、尿素酶微量发酵管、醋酸铅培养基微量管、蛋白胨水培养基、半固体培养基，置37℃培养箱培养18~24h后观察结果。

1.2.3 血清学鉴定取伤寒诊断血清和生理盐水滴于玻片上，再取可疑菌分别与伤寒诊断血清和生理盐水混匀，观察有无凝集现象。

2.结果2.1细菌分离培养 SS平板上分离出两种不同性状菌落，一种为圆形、凸起、湿润、边缘整齐、表面光滑的无色透明菌落，直径约1~2mm，另一种为圆形凸起、湿润、边缘整齐、表面光滑的红色菌落，直径约2~3mm。

2.2 细菌生化反应和血清学鉴定所分到的两种不同性状菌落的生化反应、动力学试验、血清学鉴定结果见表1表1可疑菌的生化反应、动力试验和血清学检查结果双糖铁葡萄糖乳糖尿素 H2S 靛基质动力血清学可疑菌—/+ H2S+ + —— + — + +3.结果分析和讨论在肠杆菌科中，志贺菌、沙门菌等致病菌不发酵乳糖，其他大部分非致病肠道杆菌可分解乳糖，故在SS平板上无色半透明小菌落为可疑致病菌落[2]。

痢疾杆菌鉴定方法痢疾杆菌是引起急性肠炎的致病菌，主要通过粪口传播。

为了准确鉴定痢疾杆菌，需要进行一系列实验室检测。

目前常用的痢疾杆菌鉴定方法包括传统培养方法、分子生物学方法以及免疫学方法。

传统培养方法是最常用的痢疾杆菌鉴定方法之一。

首先，从患者的粪便样本中提取病原体。

然后，将样本接种于含有选择性培养基的琼脂平板上，常用的选择性培养基有SS（亚硫酸亚铁）琼脂、Hektoen琼脂和XLD（肠杆菌选择琼脂）等。

痢疾杆菌具有特殊的生化反应，能够切分乳糖，产生硫化氢，而不产生气体。

这些特征可以用于初步鉴定病原体。

此外，还可以进行酸碱试纸检测以确定菌株的产酸性。

分子生物学方法是一种快速、准确的痢疾杆菌鉴定方法，采用PCR（聚合酶链反应）技术。

这种方法通过扩增病原体的特定基因片段来进行鉴定。

常用的PCR 引物可以选择目标基因，如16S rRNA基因、VirF基因和ipaH基因等。

将提取的基因组DNA作为模板，在特定的温度下，将引物与DNA模板结合，然后逐渐升温，在模板DNA复制的每个周期中，每个引物将扩增DNA的特定区域。

通过电泳和染色剂检测扩增产品的大小和形状，可以判断是否存在痢疾杆菌。

免疫学方法是一种直接鉴定痢疾杆菌的方法，通过检测特定抗原或抗体来识别病原体。

可以使用ELISA（酶联免疫吸附试验）或荧光抗体技术来检测病原体。

这种方法可以使用特异性抗体与痢疾杆菌的抗原结合，然后通过添加酶标记物来检测结合的复合物。

根据酶标记物的活性，可以使用选择性底物来检测复合物。

除了以上方法外，还有一些其他的鉴定方法可以用于痢疾杆菌的鉴定，如质谱法、DNA测序法等。

这些方法有各自的优点和局限性，在不同的实验室和临床情况下可以选择适合的方法进行痢疾杆菌的鉴定。

总的来说，痢疾杆菌的鉴定是通过一系列实验室检测来完成的，在临床和流行病学研究中具有重要的意义。

传统培养方法是最常用的鉴定方法，但是需要较长的时间和繁琐的步骤。

分子生物学方法和免疫学方法则具有快速、灵敏和准确的特点，逐渐成为痢疾杆菌鉴定的主流方法。

痢疾杆菌在ss培养基特征痢疾杆菌（Shigella）是一种引起痢疾的致病菌，其主要特征在于其生长和产生的变化在SS培养基上可以被观察到。

本文将详细介绍痢疾杆菌在SS培养基上的特征。

SS培养基是一种选择性富集培养基，用于分离和培养带有硫代硫酸盐还原酶（H_2S）的肠道致病菌。

痢疾杆菌是一种产生H_2S的革兰阴性菌，因此可以在SS培养基上生长并表现出一些特征。

痢疾杆菌在SS培养基上的特征主要包括以下几个方面：1. 形态特征：痢疾杆菌是一种短小的革兰阴性杆菌，通常呈现为不规则的短杆状或弧形状，大小约为0.5-0.8微米宽，1.5-3微米长。

2. 营养要求：痢疾杆菌是一种嗜好厌氧菌，对氧气敏感。

因此，在SS培养基中，通常会添加一定的还原剂（如铁离子）以提供适宜的环境。

3. 菌落形态：痢疾杆菌在SS培养基上形成典型的菌落特征。

初次培养时，菌落呈现为透明或乳白色，边缘清晰，直径约为1-2毫米。

随着培养时间的延长，菌落逐渐变为暗黑色或暗绿色，呈现出金属光泽。

4. 硫化物产生：痢疾杆菌是一种能够产生硫化物的菌株。

在SS培养基中，痢疾杆菌可以利用培养基中的硫代硫酸盐还原酶将硫代硫酸盐还原为硫化物，产生黑色沉淀物。

这是痢疾杆菌在SS培养基上的一个显著特征。

5. 反应pH：痢疾杆菌在SS培养基上的生长和产生变化与反应pH 有关。

在SS培养基的酸性条件下，痢疾杆菌可以较好地生长和产生硫化物。

因此，SS培养基的pH值通常在7.2左右，以促进痢疾杆菌的生长和硫化物的产生。

总结起来，痢疾杆菌在SS培养基上的特征主要包括形态特征、营养要求、菌落形态、硫化物产生和反应pH等方面。

通过观察和分析这些特征，可以对痢疾杆菌进行初步的鉴定和检测。

此外，SS培养基还可用于筛选和富集其他产生H_2S的肠道致病菌，对于相关疾病的诊断和防控具有重要意义。

免疫培养—凝集法快速检出痢疾杆菌的试验目的建立免疫培养-凝集法的快速检出痢疾杆菌方法，为疫情流行病学调查处理和患者早期诊断治疗提供病原学依据。

方法将经大肠杆菌吸附后的福氏和宋内氏混合抗血清加入GN增菌肉汤培养液中，混匀后滴加于玻片凹处，再将离心沉淀后的粪便样品上清液接种于该培养液中，放入湿盒37℃培养4～6h，取出并肉眼观察玻片凹处培养液中的凝集菌团，凡发现一个凝集菌团即为阳性。

每份样品以常规细菌培养法做平行试验。

吸取凝集菌团并以细菌培养法进行验证试验。

结果共检测111份菌痢和腹泻患者粪便样品，免疫培养-凝集法检出阳性41份，检出率为36.9%，与细菌培养法检出阳性的符合率达89.2%，两种检测方法的一致性为优（Kappa=0.763）。

凝集菌团被证实为痢疾杆菌占82.9%。

结论免疫培养-凝集法具有操作简便、快速、特异性好和敏感性高的优点，在疫情调查处理和患者的早期诊断治疗中具有一定意义。

标签：免疫培养-凝集法；细菌培养；痢疾杆菌细菌性痢疾是常见多发传染病，快速检出病原菌对控制疫情和早期诊断治疗患者具有十分重要意义。

本文采用免疫培养-凝集法，在实验室研究的基础上，检测111份菌痢患者和非菌痢患者粪便样品，现将方法和结果报告如下：1 实验材料1.1 菌种F1a、F2a、F3a、F4a、F5、F6型福氏痢疾杆菌和宋内型痢疾杆菌，来自湖南省疾病预防控制中心和慈利县疾病预防控制中心检验室保存的菌株。

1.2 抗痢疾杆菌免疫血清的制备：按文献[1]用家兔分别制得F1a、F2a、F3a、F4a、F5、F6型和宋内氏七个型的免疫血清。

试管凝集效价F1-F6均为1：3200，宋内氏为1：6400。

用4株大肠杆菌（正常人粪便中分离出）的混合菌液（>30亿/ml）吸收2次，除去非特异性抗体，吸收后特异抗体效价为1：1200，实验时用稀释度为1：20。

1.3 GN增菌肉汤培养液、甘油缓冲盐水保菌液和SS培养基按常规法配制。