原位移植肿瘤模型的制作

裸鼠人肝癌原位移植耐药模型的建立的开题报告【开题报告题目】裸鼠人肝癌原位移植耐药模型的建立【研究背景】肝癌是常见的恶性肿瘤之一，严重危害人类健康。

目前，肝癌可通过手术、化疗、放疗等综合治疗。

然而，由于肝癌细胞的异质性和基因突变等因素，导致治疗效果仍不尽如人意。

因此，开展肝癌治疗的研究非常必要，尤其是建立一种有效的肝癌耐药模型。

【研究目的】本研究旨在建立一种裸鼠人肝癌原位移植耐药模型，以此用于开展肝癌治疗药物的筛选和耐药机制的研究。

【研究内容】本研究主要包括以下内容：1.采用原位移植方法建立裸鼠肝癌模型，采用人肝癌细胞原位移植至裸鼠肝脏；2.通过连续药物选压，筛选出耐药肝癌细胞株；3.建立肝癌细胞原位移植耐药模型，并研究耐药机制；4.对耐药肝癌细胞株进行化学治疗药物筛选。

【研究方法】本研究采用原位移植法建立模型，连续药物选压筛选出耐药肝癌细胞株。

建立肝癌细胞原位移植耐药模型，并通过实时荧光定量PCR、Western blotting等手段进行耐药机制研究。

在耐药肝癌细胞株中，筛选可逆转耐药的化学治疗药物。

【研究意义】本研究将建立一种裸鼠肝癌原位移植耐药模型，以此作为研究肝癌治疗药物的筛选平台和耐药机制研究的手段。

通过研究耐药机制，并对耐药肝癌细胞株进行化学治疗药物筛选，有望为肝癌的治疗提供有力的参考和帮助。

【研究进展】目前，已通过原位移植法建立裸鼠人肝癌模型，连续药物选压成功筛选出耐药肝癌细胞株，正在进行建立耐药模型，并研究耐药机制的工作。

【研究预期成果】本研究预期能够建立一种裸鼠肝癌原位移植耐药模型，并研究耐药机制。

在此基础上，筛选出可逆转耐药的化学治疗药物，为肝癌的治疗提供新的思路和方法。

【研究周期和预算】本研究周期为2年，预算总共10万元。

包括实验室耗材费、动物实验费、仪器设备购置和维护费、研究人员工资和报酬等。

人非小细胞肺癌裸鼠原位种植转移模型的建立实验具体步骤及方法将表达GFP的质粒pRNAT-U6/Neo转染人肺腺癌细胞A549，G418筛选获得稳定表达GFP细胞，对比转染前后细胞的生长活性和成瘤性。

将转染后细胞原位种植裸鼠预定标准处死。

HE染色和免疫组化检测转移灶的位置和数目。

利用KODAK IS2000MM系统检测肿瘤播散情况。

一、实验材料准备1. BALB/c nu/nu裸鼠40只，雄性，4-6周龄，体重18-20 g，无特定病原体(SPF)级饲养。

2. 肺腺癌细胞株A549，用含10%小牛血清的RPMI 1640培养基(美国Gibcobrl公司)，5% CO237℃培养，常规传代。

3. 质粒和筛选药物质粒pRNAT-U6/Neo(美国Genscript公司)，携带Neomycin耐药基因供筛选，在CMV启动子控制下编码cGFP作为转染标记物。

G418(美国Promega公司)800 μg/ml初筛后200 ug/ml维持筛选。

二、细胞的转染1. 哺乳动物磷酸钙转染系统(美国Promega公司)，按照操作指南将质粒pRNAT-U6/Neoo转入A549细胞，转染后24~48 h荧光显微镜下观察转染效率。

2. 后培养液内加G418筛选获得稳定转染。

3. 利用平板克隆形成试验测定细胞克隆形成率>10%后，有限稀释法获得表达GFP阳性细胞。

4. 1月后收获转染细胞，常规传代培养，培养液中加G418(200 ug/ml)维持筛选。

5. 测定转染后A549细胞增殖动力学指标，对比转染前后A549细胞生长曲线，检测转染后细胞的生长活性是否受转染的影响。

6. 待细胞增殖达一定数量后，裸鼠皮下注射转染前后细胞，记录成瘤时间，用公式V=1/2x长x宽计算肿瘤体积，对比转染前后两组裸鼠的瘤体大小以检测成瘤性是否有差别。

三、人肺腺癌A549裸鼠原位种植模型的建立1. 取转染后细胞，用不含血清的RMPI 1640培养液冲洗2次并调整细胞最终浓度为5x106/0.2 ml备用。

小鼠肝癌原位移植模型的建立及其意义的研究项亮亮;侯杰;王婕;焦成斌【摘要】目的:探讨用肝癌H22细胞建立小鼠肝癌原位移植模型.方法:将肝癌H22细胞注入小鼠腹腔内,建立异位移植模型;抽取腹水中癌细胞接种于小鼠肝实质内,建立原位移植模型.结果:移植后10d可扪及肿瘤生长,模型成功率94.4％;晚期自发转移率79.4％,腹水产生率35.3％,无自发消退;移植瘤保持甲胎蛋白(AFP)、异常凝血酶原(DCP)高分泌及γ-氨基酰转氨酶(γ～GT)同工酶阳性的特点;模型平均自然生存期28d.结论:小鼠肝癌原位模型成功率高,易于制作,生物学特征符合模拟人类肝癌在体内发生发展的全过程,可成为今后人类研究肝癌的重要动物模型.【期刊名称】《黑龙江医药科学》【年(卷),期】2015(038)006【总页数】2页(P48-49)【关键词】肝癌;H22细胞;原位移植模型;小鼠【作者】项亮亮;侯杰;王婕;焦成斌【作者单位】佳木斯大学附属第一医院普外二科,黑龙江佳木斯154003;佳木斯大学附属第一医院普外二科,黑龙江佳木斯154003;佳木斯大学附属第一医院普外二科,黑龙江佳木斯154003;佳木斯大学附属第一医院普外二科,黑龙江佳木斯154003【正文语种】中文【中图分类】R735.7肝癌是世界范围内常见的恶性肿瘤之一，因其发病率高、恶性程度高、死亡率高，素有“癌中之王”的称号[1]。

目前已有大量研究为肝癌临床的治疗提供基础依据，而肝癌动物模型一直是肝癌临床与基础研究工作的重要工具。

目前有关人肿瘤转移模型大多是用裸大鼠、裸小鼠,动物肿瘤则多数是用Wistar或SD大鼠建立的,而用小鼠建立原位肿瘤移植模型国内外报道较少。

小鼠作为一种更经济，易饲养，易获得的实验研究载体，在发挥其普遍应用性方面有着重大的作用。

小鼠肝癌原位移植模型作为一种新型的动物模型是否能更好地模拟人肝癌在体内发生、发展、侵袭及转移的过程，本实验将研究报道如下。

卵巢肿瘤原位移植动物模型的建立刘艺杰;段刚;段萍;卢晓声;梅洁;华莹;吕杰强【摘要】目的:建立能够模拟临床肿瘤发展过程的卵巢癌动物模型.方法:将处于对数生长期的人卵巢癌细胞株SKOV3 (2× 106个/只)、A2780多水平细胞数(2×106个/只、5×106个/只、1×107个/只、1.5×107个/只和2×107个/只)裸鼠皮下注射,A2780(1.5×107个/只)腹腔注射.取SKOV3第3代连续传代皮下瘤组织进行裸鼠右侧卵巢包膜下移植.结果:卵巢癌细胞株SKOV3皮下注射、组织块原位移植成瘤率均100％.原位移植卵巢癌裸鼠6～8周时剖腹探查见局部形成较大包块,与周围组织发生粘连,腹腔暗红色血性积液伴脏器广泛性转移,淋巴结转移.卵巢癌A2780细胞株多水平细胞数皮下注射均未成瘤;腹腔注射8周时剖腹探查见腹腔内生成2～3 mL无色澄清腹水,双侧卵巢增大,脾脏明显增大,未能发现任何腹腔瘤块.结论:成功建立了临床转移模式的SKOV3卵巢癌肿瘤细胞原位移植动物模型；卵巢癌A2780细胞接种未能成瘤,可能是因其对宿主体内非特异性免疫反应较敏感.%Objective:To establish an animal model with ovarian carcinoma to simulate the clinical tumor development. Methods: Human ovarian carcinoma cell lines SKOV3 and multi-level A2780 in exponential phase of growth were inoculated subcutaneously in nude mice,A2780 cells were also inoculated intraperitoneally. The third generation of SK0V3 subcutaneous tumor was transplantated below the capsule of the right ovary. Results:Subcutaneous inoculations of human ovarian carcinoma SKOV3 cells and orthotopic transplantations of SKOV3 subcutaneous tumor both succeeded in all mice. Six to eight weeks after orthotopic transplantations,tumors invasion into surrounding tissues wereobserved,as well as dull red effusion with peritoneal metastasis and lymph node metastasis. The subcutaneous inoculation of multi-level cell linesA2780 all failed in tumor formation. Eight weeks after A2780 cells were injected in intraperitoneal cavity,2-3 mL colorless ascites appeared,o-varian and spleen grew obviously,but tumor was not detected. Conclusions: The SKOV3 orthotopically transplantated animal model was successfully established. The inoculation of A2780 cell lines failed in tumor formation,possibly due to their sensitivities to non-specific immunity in the host.【期刊名称】《国际妇产科学杂志》【年(卷),期】2012(039)004【总页数】4页(P373-375,封3)【关键词】卵巢肿瘤;癌;模型,动物;原位移植;淋巴转移【作者】刘艺杰;段刚;段萍;卢晓声;梅洁;华莹;吕杰强【作者单位】325000 温州医学院附属第二医院妇科;南方医科大学南方医院影像中心;325000 温州医学院附属第二医院妇科;325000 温州医学院附属第二医院妇科;325000 温州医学院附属第二医院妇科;325000 温州医学院附属第二医院妇科;325000 温州医学院附属第二医院妇科【正文语种】中文卵巢癌为女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，起病隐匿，但缺少能早期发现的敏感而特异的诊断方法；转移复发率高，且在治疗过程中易对化疗药物产生耐药性，死亡率极高，已跃居妇科恶性肿瘤的首位［1］。

人胃癌完整组织块裸鼠原位种植高转移模型的建立实验具体步骤及方法人胃腺癌SGC27901 细胞株，裸鼠皮下注射(2x106/L 细胞悬液) ，成瘤后反复传代形成实体瘤，以第6 代瘤源为组织材料，打开腹腔，通过生物胶粘贴法用OB 医用生物胶将瘤块粘贴在裸鼠胃壁胃大弯血管分布稠密处；待荷瘤鼠出现衰竭体征濒临死亡时处死解剖检查。

一、皮下种植瘤模型的建立和传代BALB/c nu/nu 裸鼠24 只，雄性，6 周龄，体质量18～20 g，SPF 级条件下饲养。

人胃腺癌细胞株SGC-27901，2x106/L 细胞悬液裸鼠皮下注射，成瘤后反复传代形成实体瘤，本组瘤源为第6代。

二、人胃癌组织块裸鼠原位种植模型的建立1. 实验动物术前禁食12 h，氯胺酮50 mg/kg 腹腔麻醉，常规消毒，选择左侧正中旁切口进腹，暴露胃壁，在胃大弯处近胃窦旁用1 mL无菌空针头划破胃壁浆肌层，用无齿镊将破损处向内推压，使局部胃壁形成凹龛，植入1 块瘤组织块，并在瘤表面滴上1 滴OB 生物胶(由广州白云医用胶公司提供) ，使其覆盖瘤组织表面, 约40 s 凝固后将胃壁回纳入腹腔，0 号丝线缝合腹膜及皮肤，关腹。

2. 整个过程严格遵循无菌操作。

3. 所有模型动物无麻醉意外，SPF 级饲养。

4. 术后1 周内，死亡2 只。

5. 定时观察所有裸鼠全身状况、运动情况、腹部体征。

6. 当荷瘤鼠出现明显消瘦、弓背、精神萎靡等衰竭体征时，脱颈椎处死解剖，取原位瘤体、肿大淋巴结、胸腹腔内脏器、收取腹水。

7. 所取标本以10% 甲醛固定，石蜡包埋、切片，H-E 染色，作组织病理学检查。

8. 实体瘤细胞染色体鉴定。

注意事项体外实验虽然能在一定程度上反映胃癌细胞的运动能力和侵袭能力，但是不能完全替代体内胃癌转移的器官环境及转移效果，因此体内移植模型成为肿瘤实验研究的主要方法。

以往多是皮下移植，但可能因皮下纤维包膜的包绕致转移较少。

近年研究表明，肿瘤细胞株原位种植裸鼠体内不能完全表达肿瘤的生物学特性，而完整组织块原位移植可显著提高转移率。

人卵巢癌裸鼠卵巢原位移植瘤模型的构建詹光熙;彭书敏;美丽古丽·莫合买提;郭晓青【摘要】To build a suitable animal ovarian cancer model in vivo,so as to study the mechanism of its progression.Lentivirus transfection technology was used to build a green fluorescent protein (GFP) marked EOC cells model:SKOV3 (human ovarian serous carcinoma cell lines) and ES-2 (human ovarian clear cell carcinoma cell lines).After isoflurane anesthesia,4-6 week old BALB / C (nu / nu) nude female,back into the abdominal cavity from the median longitudinal incision.Micro multipoint injection method was used to transplant suspension cell model in one side ovary;Night OWL vivo imaging system was used to dynamically observe the growth and metastasis of xenografts in nude mice.Nude mice were dissected at 4-6 weeks after transplantation,the ovarian and metastatic tissues were stained with HE.Both SKOV3 and ES-2 GFP positive cell model was successfully constructed with ovarian orthotopic xenograft.nude mice did not lead to surgical death,the success rate of orthotopic transplanted tumor model in nude mice was 100％.The in vivo imaging system can dynamically monitor the growth of a transplanted tumor in nude mice by detecting the fluorescence intensity and range of GFP.SKOV3 cell model was built-in ovarian canceer and metastatic tissues,HE staining pathological features consistent with human ovarian serous adenocarcinoma;ES-2 cell model was built-in ovarian cancer and metastatic tissues,HE staining pathological features consistent with humanovarian clear cell carcinoma.it can be concluded that inhalation of isoflurane anesthesia,middle of the back vertical incision into the abdominal cavity,micro multipoint injection of GFP-carrying EOC cell model,can be successfully constructed dynamic observation of ovarian orthotopic transplantation tumor in nude mice animal models.This animal model is similar to the biological characteristics of human ovarian cancer and is suitable as an in vivo model to study the development of human ovarian cancer.%为探讨人卵巢癌进展机制的相关研究,构建适宜的体内动物模型.采用慢病毒转染技术,构建稳定过表达绿色荧光报告基因(GFP)的人EOC细胞模型:SKOV3(人卵巢浆液性腺癌细胞株)和ES-2(人卵巢透明细胞癌细胞株);异氟烷吸入麻醉4-6周龄BALB/C(nu/nu)雌性裸鼠,从裸鼠背部正中纵切口进入腹腔,显微多点注射法分别将细胞模型悬液,移植于裸鼠的单侧卵巢,每组6只裸鼠;NightOWL 活体成像系统动态观察裸鼠移植瘤生长和转移情况;移植术后4-6周解剖裸鼠,取卵巢和转移瘤组织行HE染色.结果显示,携带GFP的EOC细胞模型SKOV3和ES-2,均可成功构建裸鼠卵巢原位移植瘤模型,裸鼠未发生手术原因死亡,成功率均100％;活体成像系统通过检测GFP的荧光强度和范围,能够动态监测裸鼠移植瘤生长情况;SKOV3细胞模型构建的卵巢癌和转移瘤组织,HE染色观察病理特征符合人卵巢浆液性腺癌;ES-2细胞模型构建的卵巢癌和转移瘤组织,HE染色观察病理特征符合人卵巢透明细胞癌.由此可知,异氟烷吸人麻醉、从背部正中纵切口进入腹腔、显微多点注射法移植携带GFP的EOC细胞模型,能成功构建可动态监测的裸鼠卵巢原位移植瘤动物模型;该动物模型与人卵巢癌生物学特征类似,适宜作为研究人卵巢癌演变进展的体内模型.【期刊名称】《石河子大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2017(035)005【总页数】6页(P574-579)【关键词】卵巢癌;裸鼠;卵巢原位移植瘤模型;显微多点注射法【作者】詹光熙;彭书敏;美丽古丽·莫合买提;郭晓青【作者单位】石河子大学医学院,新疆石河子,832003;石河子大学医学院,新疆石河子,832003;石河子大学医学院,新疆石河子,832003;同济大学附属第一妇婴保健院,上海200040【正文语种】中文【中图分类】R711.75卵巢癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤 [1]，早期往往缺乏典型临床症状，且没有灵敏的标志物和筛选手段，约超过70%的病人在被确诊时已是疾病晚期，其5年生存率不到30%，极易发生侵袭、转移等生物学特性是导致其预后差、死亡率高的主要因素之一[2]。

裸小鼠脑胶质瘤原位移植瘤模型的建立及磁共振成像研究王舒楠，张伟国，陈金华，马长锁，赵丽(第三军医大学大坪医院野战外科研究所放射科，重庆400042)摘要：目的建立裸鼠脑胶质瘤原位移植瘤模型并进行MR扫描，摸索扫描的最佳参数，探讨1.5T磁共振在检测裸鼠颅内成瘤的可行性，为下一步实验奠定基础。

方法SHG-44细胞传代培养后，用微量注射器吸取肿瘤细胞悬液直接穿刺接种，在肿瘤细胞接种后第15天行1.5T MR扫描，裸鼠麻醉后置于小动物线圈采集图像并利用影像工作站测量体积。

而后取脑组织做病理切片，计算体积后行HE及CD34染色，与MRI图像进行对比分析。

结果除去围手术期死亡2只裸鼠外，剩余的13只裸鼠在MR增强序列图像上均能见到肿瘤，成瘤率达100%，且位置同组织切片相一致。

在MR 图像上测得的肿瘤体积为（29.41±10.95）mm3，组织切片测得的肿瘤体积为(26.57±9.70) mm3，二者无显著性差异（P＞0.05）但具有明显的相关性（r=0.985，P ？）。

肿瘤微血管丰富，且主要集中在肿瘤的边缘。

结论采用微量注射器直接建立裸鼠胶质瘤原位移植瘤模型简单便捷，成瘤率高。

1.5T 磁共振能活体检测裸鼠脑胶质瘤成瘤情况，并能进行一定的功能成像，是动态监测裸鼠胶质瘤发生发展的有效途径。

关键词：裸鼠；胶质瘤；磁共振成像；原位移植Estabilshment of human glioma orthotopic model in nude mice and monitored by 1.5T magnetic resonance imagingWang Shu-nan, Zhang Wei-guo, Chen Jin-hua, Ma Chang-suo, Zhao Li（Department of Radiology, Daping Hospital, The Third Military Medical University, Chongqing 400042, China）Abstract：Objective To establish the model of human glioma orthotopic implantation in nude mice，and investigate 1.5T magnetic resonance in the detection of transplanted tumor. Methods The glioma cell line SHG-44 was cultured in vivo. The glioma cells were injected into nude mice brain using micro-syringe to form glioma. Fifteen days later, nude mice were scaned by 1.5T MR with animal-coil to detect the tumor. Tumor volume was measured in AW4.3 imaging workstation. Then take brain tissue biopsy done with HE staining and CD34 staining. Tumor volnme was measure under microsope to evaluated the relativity with the dates in MR imagings. Results Two nude mice were dead in perioperative, the other thirteen mice survive and be detected tumor in bran by MR scanning with contrast injected. The location in MRI isconsistent withthat in tissue section. Tumor volume is 29.41±10.95mm3measured by MRI and is 26.57±9.70mm3 measured under microsope. There is no significant difference（P＞0.05）but significant correlation（r =0.985）. Conclusion It is easy and convenient using micro-syringe directly to establish the human glioma orthotopic implantation model in nude mice. 1.5T MR can detect the tumor in mouse brain in vivo, and to carry out certain functional imaging. 1.5T MR is an effective way to dynamic monitor the occurrence and development of glioma in nude mice.Key word：Nude mice；Glioma；Orthotopic implantation；Magnetic resonance imaging胶质瘤是脑内最常见、浸润性最强的一种原发性脑肿瘤，临床治疗效果差，病死率很高。