westernblot试验操作指南

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目录

目录 ................................................................................ 1

一、总蛋白的提取 .................................................................... 2

1 试验类型和蛋白类型 .............................................................. 2

2 样品组织类型 .................................................................... 3

3 蛋白表达峰度判断 ................................................................ 4

4 总蛋白提取的基本步骤 ............................................................ 4

4.1 细胞样品总蛋白的提取操作步骤 ................................................ 5

4.2 组织样品总蛋白的提取操作步骤 ................................................ 5

二、总蛋白 BCA 定量 ................................................................ 6

三、 SDS-PAGE 凝胶电泳 ............................................................ 7

四、转膜 ............................................................................ 8

五、信号增强剂处理膜 ................................................................ 9

六、封闭、一抗孵育、二抗孵育 ........................................................ 9

1 封闭 ........................................................................... 9

2 一抗孵育 ....................................................................... 9

3 二抗孵育 ...................................................................... 13

七、曝光显色 ....................................................................... 14

八、灰度分析 ....................................................................... 15

九、抗体及相关溶液配制 ............................................................. 15

1 抗体 .......................................................................... 17

2 相关溶液配制表 ................................................................. 17蛋白表达研究系列之 Western Blot 试验操作指南 2

蛋白检测相对于 DNA/RNA 的检测来讲要困难许多， Western Blot 作为蛋白检测的经典方 法短时间内仍然无法被取代。 Western Blot 的原理并不复杂，网上有很多这方面的材料，这 里不作过多的介绍。虽然原理、操作并不复杂，但做好 Western Blot 、得到满意的图片并非 易事。其操作过程中涉及到：蛋白提取、电泳、转膜、杂交、显色、抗体的选择、试剂的选 择、设备应用等诸多内容，其中每一个环节的差错对最后的试验结果都会产生不小的影响， 最终导致试验失败。很多同学都在抱怨自己的 Western Blot 没有信号、目的条带太弱、杂带 太多、条带弯曲、泳道中有涂抹状背景等诸多问题，大部分情况都会最终把矛头指向抗体， 认为这个抗体质量不好。 抗体质量肯定会对试验产生相当重要的影响， 但绝不是全部。 你的 操作方法可能是对的，但，是否合理、是否适合你的试验要求，你可能未必了解。我们课题 组 Western Blot 的任务量极重（每年 ECL 的用量都在 5L 以上），课题组里面的一些同学总 是在不停的问我关于条件优化的问题， 我不可能为每一个人找到问题的关键点， 因此， 写一 份关于 Western Blot 的系统性材料非常有必要，希望你们可以针对自己的问题，自我分析、 自我解决，这样也能锻炼你们独立解决问题的能力。

一、总蛋白的提取

总蛋白作为 Western Blot 试验的原始材料，可以说是试验的根基。蛋白提取不好、提取 效率差、试剂选取不合理，后面的试验就基本不用做了，肯定会发生没有信号、信号弱、背 景高、泳道中有涂抹状背景等问题。做试验之前这些信息需要考虑和查询： （ 1）试验类型；

（2）目的蛋白类型； （3）样品组织类型； （ 4）蛋白表达峰度判断。

1 试验类型和蛋白类型

（ 1）如果是 IP 试验，样品的蛋白提取务必使用碧云天的 Western 及 IP 细胞裂解液（货号：

P0013）。HaiGene的超强RIPA裂解液虽然能有效的裂解样品，但其成分对后续分离蛋白复 合物有影响。如果是细胞核内的蛋白研究，样品裂解 30min后，放置到超生破碎仪上 30〜

50W，工作4s,间隙6s,超声5次。这样能有效的将细胞核裂解，并打碎基因组 DNA和

RNA，有两个目的：第一，碧云天的 Western及IP细胞裂解液对细胞核有一定的裂解能力，

但并不能完全裂解细胞核, 通过超声可将细胞核完全裂解, 从而释放更多的核蛋白, 这样后 续检测能获得更高的灵敏度；第二,细胞核中的蛋白总是与基因组 DNA 结合在一起,如果

不将 DNA 打碎,核蛋白仍然跟基因组 DNA 结合在一起,样品离心过程中,容易发生基因 组 DNA- 蛋白复合物大分子沉淀,从而丢失这部分核蛋白,通过超声将 DNA 打碎后,彻底

释放核蛋白,从而获得更多的目的蛋白。

（2）如果是单纯的 Western Blot 试验，使用 HaiGene 的超强 RIPA 裂解液（货号： C2501） 和

Benzonase 核酸酶（货号： C2001 ）。这个 RIPA 裂解液裂解能力更强，可获得更多的总蛋 白，它可以完全裂解细胞核、线粒体，并可提取到更多的膜蛋白。 如果后续杂交的蛋白有细 胞核、线粒体和膜蛋白，则务必使用这个 RIPA裂解液，它能提取到很多 Western及IP细胞

裂解液提取不到的蛋白。 但使用HaiGene的超强RIPA裂解液必须要使用 Benzonase核酸酶， 这个酶能迅速降解基因组 DNA 和 RNA ，从而使样品不粘稠 （粘稠的样品， 在胶孔上样时将 很困3

难），还能提高总蛋白提取效率（尤其是核蛋白） 。 总结：根据试验类型和目的蛋白的表达定位情况， 选取合适的裂解液， 确定是否需要超声处 理即可。

2 样品组织类型

我们组的样品就两种：细胞和动物组织。

（1）先说一下细胞样品的处理，细胞样品由于很纯、都是单个细胞，容易裂解，处理非常 容易。可能遗漏点在凋亡（或死亡）的那部分悬浮细胞。 Western Blot 试验要求细胞至少 6

孔板一孔（融合度 85%）,最好2〜3孔，这样细胞量比较足。当然也要看蛋白的表达峰度 情况，蛋白表达峰度低的可用一个 25cm2 培养瓶的细胞。 细胞于胰酶消化、 终止后， 8000rmp

离心5〜10min （1.5ml EP管），留底部细胞团块，加入 1ml PBS，不重悬底部细胞，只是冲 洗一下EP管，再离心2min。倒掉PBS,用移液器将剩余 PBS吸取干净，再加入40〜50 M PBS 重悬细胞*1，加入150 M裂解液*2，裂解细胞就可以了。对于做凋亡研究或通路分析的试验， 千万不要忽视凋亡或死亡的那部分细胞， 也许想要的信息就在这里面。 所以培养上清液里面， 离心收集这部分细胞，把它加入到处理的贴壁细胞里面。处理方法：将培养上清液 8000rpm

离心后 100MlPBS 重悬加入到胰酶消化、终止后的溶液中就可以了。

*1 有同学问为什么要加 PBS 再重悬细胞？细胞用 PBS 可很快吹散，便于后面裂解液充分发 挥作用，使得提取效率更高，要是直接加入裂解液的话， 细胞容易聚团不能充分裂解， 会造 成不同 EP 管中的样品提取效率存在差异，从而使得总蛋白浓度存在差异。在起始细胞数量 相差不多的情况下， 总蛋白浓度近似， 后续做内参杂交时几乎是一致的， 减少了内参杂交的 重复次数。实践证明，这样的总蛋白样品可以不需要使用 BCA 进行再定量均一化处理。

*2

150 M裂解液用量是可以满足大部分试验的，细胞少的话可使用 100 M，多则可使用200 M

甚至 300Ml ，自己可把握。

（2 ）组织样品。不管是新鲜组织还是冻存组织，处理方法是相同的。冻存的组织于 -80C保

存的话， 5 年内是没有问题的。不过不要反复冻融，因此采样的时候要求必须分装于 1.5ml

的EP管中，每管放置300〜500mg,足够2〜3次的提取试验即可。 对于柔软的组织 （肝脏、 肾脏、脑、肌肉等） ，可使用电动组织研磨器研磨，骨骼、皮肤、血管等富含胶原等硬类组 织还是使用液氮下研钵处理最好。 柔软的组织使用研钵处理会更好， 总之还没有什么方法能

超过液氮下研磨这个方法。 组织样品由于富含的细胞类型往往比较多， 采集部位稍有差异就 会造成待研究细胞数量上的差别， 这为后续定量带来了一定的误差。 实践证明组织样品相比

较细胞样品来讲， 更难以得到理想的目的条带。 具体原因未知， 但应该与混杂的细胞类型有 绝对