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WesternBlot快速实验攻略概要

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Western Blot 快速实验攻略

一、 Western Blot 实验原理

蛋白免疫印迹 (Western Blot , WB 是将蛋白质经电泳分别后转移到膜上 ,而后利

用抗体进行检测的技术。完好的 WB 流程 ,以下列图所示 ,包括样本制备、 SDS-PAGE 、转膜、抗体联合、蛋白检测等 5

个大步骤。

二、试剂准备

1. 各种缓冲液

1 电泳缓冲液 :10xTris-Glycine-SDS 电泳缓冲液 (20319ES76 2电转缓冲

液 :Western Blot 电泳电转通用缓冲液 (20329ES03 3蛋白上样缓冲液 :5Xsds-PAGE 蛋白上样缓冲液 (20315ES05 4其余缓冲液 :PBS , TBST 2. 样本制备

1 细胞裂解液 :RIPA (20101ES60,或 20115ES60,或 20114ES60 2蛋白酶克制

剂 :PMSF (20104ES03 3.蛋白定量

1 蛋白定量试剂 :BCA 蛋白定量试剂盒 (20201ES76 4.蛋白电泳

1 预制胶 :4-20%梯度预制胶 , 12 孔 (36214ES10

2 蛋白 marker :三色预染蛋白分子标准 (10-245kDa (20352ES76 5.转膜与关闭 1

膜 (自备

2 膜上蛋白检测 :丽春红染色液 (36221ES60 3膜的关闭 :BSA , 无 IgG (36103ES25

6. 抗体孵育

1 抗体 :内参抗体、一抗、二抗 (例 :30101ES10, 30401ES10, 34101ES60

2 检测试剂 :ECL 化学发光超敏显色试剂盒 (36208ES60

三、实验步骤

1. 样本制备

1 融解 RIPA 裂解液 ,混匀。取适合量的裂解液 ,在使用前数分钟内加入 PMSF ,

使 PMSF 的最后浓度为 1mM 。

2 贴壁细胞 :去除培育液 ,用 PBS 、生理盐水或无血清培育液洗一遍。依照 6 孔板每孔加入 150-250μL裂解液的比率加入 裂解液。用枪吹打数下 ,使裂解液和细胞充足接触。细胞充足裂解后应无没有显然的细胞积淀。

悬浮细胞 :离心采集细胞 ,用手指把细胞使劲弹散。依照 6 孔板每孔细胞加入150-250μL裂解液的比率加入裂解液。再 用手指轻弹以充足裂解细胞。充足裂解后

应没有显然的细胞积淀。假如细胞量许多 ,必要分装成 0.5-1 106× 个细胞 /管 ,而后 再

裂解。

组织样本 :依照每 20mg 组织加入 150-250μL裂解液的比率加入裂解液。用玻璃匀浆器匀浆 ,直至充足裂解。

3 充足裂解后 , 10000-14000g 离心 3-5min ,取上清 ,即可进行后续的 PAGE 、

Western 和免疫积淀等操作。

【注】 :RIPA 裂解液的裂解产物中常常会出现一小团透明胶状物 ,属正常现

象。该透明胶状物为含有基因组 DNA 等复合 物。在不检测和基因组 DNA 联合特别密切的蛋白的状况下 ,能够直接离心取上清用于后续实验 ;假如需要检测和基因组结 合特别密切的蛋白 , 则能够经过超声办理打坏打散该透明胶状物 , 随后离心取上清用于后续实验。 假如检测一些常有的转录 因子 ,比如 NF-kappaB 、 p53

等时 ,往常不用进行超声办理 ,就能够检测到这些转录因子。

2. 蛋白定量

1 配制 BSA 标准品系统

标准品稀释液为蛋白样品的溶解液 , 原则上蛋白样品在什么溶液中 , 标准品也宜用什么溶液稀释。 但也可用 0.9%的 NaCl 或 1 ×PBS 进行稀释。 BSA 标准品系统配制可参照下表。

表 1BSA 标准品系统配制 (微孔板检测 ,线性范围 20-2000μg/mL *

Vial 稀释液体积 ( μ L2mg/mLBSA体积 ( μ LBSA终浓度 ( μ

g/mL

A 01002000

B 25751500

C 50501000

D 12575750

E 15050500

F 35050250

G 37525125

H 395525

I 40000=Blank

* 如用比色皿检测 ,每管需加 100μ L标准品 ,按 3 个重复计算 ,每个浓度起码需配制 300μL。

2 各取 25μL标准品和待测样品加入到微孔板中。

3 每孔加入 200μ LBCA工作液 ,振荡 30s 充足混匀。盖上微孔板 , 37℃ 孵育

30min 。

4 冷却到室温 ,在酶标仪上的 540-595nm 波长范围处检测吸光度 ,此中 562nm 波

长为最正确。

5 依据 BSA 标准品的吸光度 (减去标准品中空白孔的 OD 值即最后的读数 ,绘制标准曲线 (X-蛋白浓度 ug/mL; Y- 最后 的 OD562nm

。依照标准曲线和样品的稀释倍数计算样品蛋白浓度。

3. 蛋白电泳

1 剪开包装拿出预制胶 ,撕去胶板底端橙色胶纸 ,将预制胶固定在电泳槽中 ,内槽加满 tris-glycine 电泳缓冲液 ,外槽液面 低于内槽 5-10mm ,双手按住梳子左右部位将其安稳迟缓 (必定要慢 ,不然会将胶齿拔断或拔歪拔出。

2 在室温或不超出 37℃ 的水浴中溶解 5 ×SDS-PAGE 上样缓冲液。水浴溶解后

立刻室温寄存。

3 依照每 4μL蛋白样品加入 1μ l5 × SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液的比率 ,混淆蛋白样品和 5 ×SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液。

4 100℃ 或开水浴加热 3-5min ,以充足变性蛋白 ,以后冷却至室温备用。

5 在每个样品孔中上样 20-40 μg蛋白 ,并在 1 个孔中上样蛋白 marker ,盖上电泳槽盖 ,翻开电源 ,介绍使用低压 100V ,跑 15min ,以后换高压 150V 跑 ,往常电泳至蓝色染料抵达胶的底端处邻近即可停止电泳。

6 电泳后拿出胶板 ,用镊子或小螺丝刀沿左右两板间的空隙将两板别开 ,掰开两板 ,将胶拿出 ,弃去塑料板 ,此时蛋白会

从凝胶上慢慢扩散 ,所以不要保留在凝胶里 ,要快速进行下一步的转移操作。

4. 转膜与关闭

1 将胶浸于预冷的转膜缓冲液中均衡 5min 。 (假如检测小分子蛋白质 ,可省略

该步骤 ,因小分子蛋白简单扩散 。

2 依照胶的大小剪取膜和滤纸 6 片,放入预冷的转膜缓冲液中均衡 10min ,如用

PVDF 膜,需参照说明书 ,先用纯甲醇浸 泡 1-2min ,再孵育于预冷的转膜缓冲液中。(膜的选择μm孔径 ,用于一般蛋白 ; 0.2 μm孔径 ,用于分子量小于 20kD 蛋白 ;

0.1 μm孔径 ,用于分子量小于 7kD 蛋白。

3 装置转移三明治 :海绵 /3 层滤纸 /胶 /膜 /3 层滤纸 /海绵 ,每层放好后 ,用试管赶

尽气泡。

4 将转移槽置于冰浴中 , 放入三明治 , 膜凑近阳极 , 胶凑近阴极 , 加入转移缓冲液 ,

插上电极 , 100V , 1h (电流约为 0.3A 。

5 转膜结束后 ,切断电源 ,拿出膜。

6 将膜淹没在 5mL 丽春红染色液中 ,置于轨道摇床上室温染色 5~10min 或更长 ,

直待膜上显示出蛋白条带。注 :假如没有 出现染色条带 ,则表示转膜失败 ,可能需要从头转膜或从头上样电泳。

7 冲洗 :拿出膜 ,用蒸馏水 , PBS 或许其余适合溶液冲刷至背景清楚后摄影 ,大体冲刷 2~3次 ,每次 5min 。

8 脱色 :将膜放到 0.1N NaOH 溶液漂洗 5min ;倒去洗脱液 ,再重复一次。

9 冲洗 :再用蒸馏水冲洗膜 2~3 次,每次 5min 。

10 将膜置于 25mL 关闭缓冲液中 ,在室温下孵育 1 小时。 11 用 5mL TBST 清洗

三次 ,每次 15min

。

5. 抗体孵育与检测

1 将膜和一抗 (依照产品应用介绍稀释度置于 10mL 一抗稀释缓冲液中在 4 °C 下

孵育留宿并时时轻轻晃动。 2 用 5mL TBST 清洗三次 ,每次 15min 以去除残留的一

抗。

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Western Blot快速实验攻略

Western Blot快速实验攻略

WesternBlot快速实验攻略

一、WesternBlot实验原理

蛋白免疫印迹（WesternBlot，WB）是将蛋白质经电泳分离后转移到膜上，然后利用抗体进行检测的技术。完整的WB

流程，如下图所示，包含样本制备、SDS-PAGE、转膜、抗体结合、蛋白检测等5个大步骤。

二、试剂准备

1.各类缓冲液

1）电泳缓冲液：10xTris-Glycine-SDS电泳缓冲液（20319ES76）

2）电转缓冲液：WesternBlot电泳电转通用缓冲液（20329ES03）

3）蛋白上样缓冲液：5Xsds-PAGE蛋白上样缓冲液（20315ES05）

4）其他缓冲液：PBS，TBST

2.样本制备

1）细胞裂解液：RIPA（20101ES60，或20115ES60，或20114ES60）

2）蛋白酶抑制剂：PMSF（20104ES03）

3.蛋白定量

1）蛋白定量试剂：BCA蛋白定量试剂盒（20201ES76）

4.蛋白电泳

1）预制胶：4-20%梯度预制胶，12孔（36214ES10）

2）蛋白marker：三色预染蛋白分子标准（10-245kDa）（20352ES76）

5.转膜与封闭

1）膜（自备）

2）膜上蛋白检测：丽春红染色液（36221ES60）

3）膜的封闭：BSA，无IgG（36103ES25）6.抗体孵育

1）抗体：内参抗体、一抗、二抗（例：30101ES10，30401ES10，34101ES60）

2）检测试剂：ECL化学发光超敏显色试剂盒（36208ES60）

三、实验步骤

1.样本制备

1）融解RIPA裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。

2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。按照6孔板每孔加入150-250μL裂解液的比例加入

裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。细胞充分裂解后应无没有明显的细胞沉淀。

悬浮细胞：离心收集细胞，用手指把细胞用力弹散。按照6孔板每孔细胞加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。再

western blot 简要实验流程

western blot 简要实验流程

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Western Blot实验简述：从样本到信号的蛋白质检测之旅

Westernblot实验操作详细步骤

Westernblot实验操作详细步骤

Westernblot实验操作详细步骤

1.样本制备：

a.收集细胞或组织样本并加入提取缓冲液，破碎细胞或组织以释放蛋白质。

b.用超声波破碎机或搅拌器处理样本，使其彻底破碎。

c.避免加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂以防止蛋白质的降解。

2.蛋白质分离：

a.将样本加入离心管中，并用高速离心分离细胞碎片和细胞核。

b.收集上清液，其中包含溶解的蛋白质。

3.蛋白质浓度测定：

a. 使用BCA或Bradford等方法测定提取的蛋白质浓度。

b.根据需要调整蛋白质浓度，以确保每个样本使用相同的蛋白质量。

4.准备SDS-凝胶：

a.准备解聚凝胶和浓缩凝胶以进行垂直电泳。

b.根据需要选择合适的胶百分比和凝胶组装器。

c.制备足够的凝胶和凝胶缓冲液。

5.蛋白质电泳：

a.将蛋白质样本加入加载缓冲液，并在煮沸过程中使其变性。

b.将蛋白质样本加载至凝胶槽中。 c.根据需要在凝胶中加入预定分子量标记物，以便于蛋白质分子量的确定。

d.以恒定电流进行电泳，直到预定分子量标记物到达所需位置。

6.蛋白质转膜：

a.选择合适的膜材料（例如聚偏氟乙烯或硝酸纤维素）。

b.用蛋白质转膜装置将凝胶上的蛋白质转移到膜上。

c.确保膜与凝胶完全贴合，并尽量避免气泡的产生。

7.阻塞和抗体孵育：

a.将膜放入含有5%非脂奶粉或1%牛血清蛋白的TBST缓冲液中进行阻塞。

b.在蛋白质靶向抗体中稀释贮存液，并使用适当的稀释倍数进行孵育。

c.将膜和抗体一起放入摇床或孵育箱中，在适当的温度下进行孵育。

8.洗涤：

a.用TBST缓冲液洗涤膜以去除未结合的抗体。

b.进行3至5次洗涤，每次洗涤持续5到10分钟。

9.二次抗体孵育：

a.将膜放入稀释过的二抗溶液中进行孵育。

b.孵育时间和温度根据抗体种类和需求进行调整。

10.再洗涤： a.用TBST缓冲液进行大约3至5次洗涤。

b.确保彻底洗涤以去除未结合的二抗。

11.信号检测：

蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项

蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项

蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项

1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)

可以使用适当的裂解液。 收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。BCA法。

2. 电泳(Electrophoresis)

(1) SDS-PAGE凝胶配制

(2) 样品处理

在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。

100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。

(3)电泳 i. 清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。

ii. 灌胶与上样

（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。）

（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。）