western试验步骤

western-blot实验方法

1、试剂耗材的准备：

（1）转膜缓冲液（48 mM Tris-HCl，39 mM 甘氨酸，0.037% SDS，20%甲醇）：

（2）10 × 丽春红染液：

（3）TBS 缓冲液：

（4）TBST 缓冲液（含20%Tween20 的TBS 缓冲液）：

（5）封闭液（含5%脱脂奶粉的TBST 缓冲液）：

（6）一抗、二抗及抗体稀释液：参照说明书，以封闭液或TBST 进行稀释。

（7）底物显色液

ECL，4℃ 避光保存，现用现配。

（8）显影液和定影液

用水稀释10 - 20 倍于铝盒中，可多次使用。室温避光存放。

2、实验步骤：

（1）蛋白样品制备：用细胞裂解液抽提蛋白，并测蛋白浓度。 （2）取1 mg 蛋白进行SDS-PAGE。

（3）转膜：（转膜缓冲液4 ℃ 预冷备用，冷却装置于- 80 ℃ 冰箱冷冻备用）。

（4）将2 张海绵垫、2 张滤纸、转膜夹子及玻棒浸泡在盛转膜缓冲液的铝盒中。

（5）戴上手套，剪一张与凝胶尺寸相近的PVDF 膜（83 mm × 75 mm），左上角剪一缺口作为标记，浸泡在盛有20 mL 甲醇的平皿中约15 sec，直到膜变半透明。用纯水冲洗膜2 次。浸泡在盛转膜缓冲液的铝盒中。

（6）SDS-PAGE 结束后，小心地剥下两块凝胶，一块用于考马斯亮兰染色观察电泳情况，另一块浸泡在转膜缓冲液中预平衡。海绵垫、滤纸、PVDF 膜及凝胶的预平衡时间在15 min

- 1 hr 之间。

（7）将转膜夹子打开，使黑的一面保持水平。按照海绵垫、滤纸、凝胶、膜、滤纸和海绵垫的先后顺序铺垫，制备凝胶转移夹层。将膜与凝胶对齐。用玻璃棒赶走气泡。

（8）将夹子夹起来，扣紧，小心不要移动内层。放入电转槽中。使夹子的黑面对槽的黑面，夹子的白面对槽的红面。

（9）将电转槽放在冰水盒中。将预冻的冷却装置放入槽内。 缓慢倒入约650 mL转膜缓冲液。

（10）盖好盖子，接上电源。根据蛋白分子量来调节工作电流，一般使用100 V（350mA），转移60 - 90 min。

western blot

（以17KD的H3K9me2蛋白为例）

准备：

（1）电转液：称3.03 g Tris碱， 14.5 g Glycine，加入200 ml甲醛，溶解后加双蒸水定容至1000 ml，4 oC保存。（电转液最好现用现配，但是我咨询过的几个实验室同学，一般是重复使用3-4次的，当然电转液最好每周重新配，即使还没用到3-4次）.

（2） 5×电泳缓冲液：称15.1g Tris碱， 94 g Glycine，5.0 g SDS， 定容至1000 ml，4oC保存。使用时用双蒸水稀释成1×电泳缓冲液。

（3）封闭液：称1.5 g脱脂奶粉，加入30ml TBST充分溶解，现用现配。

（4） 10×TBS 缓冲液：称24.2g Tris碱，80 g NaCl， 加入800 ml双蒸水，整PH到7.6，定容至1000 ml。

（5）1×TBS缓冲液：100ml 的10×TBS 缓冲液，加入0.5mlTween20,再加双蒸水定容至1000ml。

1.细胞总蛋白的提取：（提前开4℃离心机，水浴锅调到100℃，裂解液、PMSF和上样缓冲液取出放在冰盒里溶解）

取出细胞，弃去培养液，加3 ml 4℃预冷的PBS。平放轻轻摇动洗涤细胞，然后弃去洗液，将把细胞消化下来，加入PBS重悬，将悬液移到1.5ML的进口EP管内。加入含PMSF的裂解液（提前按100：1的裂解液：PMSF（100 mM）配好混匀于冰上备用，第一次做可按六孔板一孔加100ul,10cm的培养皿加400ul这个量试试，以后可视蛋白浓度来增减裂解液的量），摇匀置于冰上，超声15min后，取出于4℃下12000 rpm 15min,取上清液。分装出20ul的蛋白用来测蛋白质浓度，余下的蛋白加入5×上样缓冲液（加入的蛋白与5×上样缓冲液的比例为：使最终5×上样缓冲液稀释为1×，例如蛋白360ul, 5×上样缓冲液90ul），100℃煮5-10min,待冷却，放到-80℃保存（可保存一个月）。 2.BCA法测蛋白浓度

Western Blot操作全过程

一， 收蛋白

a（如果要收集死细胞）

1. 取冰，将4°C离心机提前降温。

2. 将死细胞收集到离心管：孔板内的细胞用PBS洗1-2遍，用适量的胰酶消化，用离心管内的原培养液将孔板内细胞吹打下来，收集到离心管，室温离心1000rpm，5min。

3. 弃上清，将离心管倒扣在滤纸上，尽量吸尽残留上清。

4. 视细胞量的多少加入细胞裂解液。（1×Cell Lysis Buffer：PMSF=100：1，1×Cell Lysis Buffer，PMSF-20°C保存。PMSF常温易降解，拿出时间不得超过30min，必须放置冰上。）

5. 冰上裂解15min，将裂解液转移至EP管离心，4°C，12000rpm，15min。

6. 小心将上清转移至另一EP管，记下吸取的量。如：100μL。

7. 将收集好的蛋白保存与—20°C。（可长期保存）

b （如果不收集死细胞）

1．弃上清，孔板PBS洗1-2遍，吸尽PBS。在孔板中视细胞量的多少加入相应细胞裂解液。（同上）

2．冰上裂解15min，用细胞刮在孔板里将细胞刮刮。（不同的孔不能用同一个刮子，刮前用水冲洗，擦干。）

3．将裂解液转移至EP管离心，4°C，12000rpm，15min。

4．小心将上清转移至另一EP管，记下吸取的量。 5．将收集好的蛋白保存与—20°C。（可长期保存）

二， 测蛋白浓度

BCA法（或者按照自己的试剂盒说明操作）

1. 需96孔板，测蛋白浓度的A液，B液，标准蛋白，要测的样品蛋白。

2. 按要测的样品蛋白的数量来配AB液，每孔需AB混合液80μl（A：B=50：1）。例：有5个样品，加上5个标准蛋白和空白对照。共有11个孔。则A液取11×80=880μl，B液取880÷50=17.6两液混匀，加入96孔板，每孔80μl。然后加入标准蛋白及样品蛋白4μl。（标准蛋白先配好浓度125，250，500，1000，2000）

Western Blot方法（western blot试验）是western blot。 它是分子生物学，生物化学和免疫遗传学中的常用实验方法。 它的基本原理是为通过凝胶电泳处理过的具有特定抗体的细胞或生物组织样本着色。 通过分析着色的位置和深度，可以获得有关特定蛋白质在被分析的细胞或组织中表达的信息。

Western Blot的原理和步骤Western Blot是将蛋白质转移到膜上，然后使用抗体对其进行检测。对于已知的表达蛋白，可以将相应的抗体用作检测的第一抗体，对于新基因的表达产物，可以将融合部分的抗体用于检测。

Western Blot是检测单细胞蛋白表达的最佳方法。 conocollal应该是表达蛋白在细胞中定位的首选，并且应考虑免疫沉淀进行蛋白相互作用。首先，Western Blot的原理Western Blot与Southern或Northern杂交相似，但是Western Blot使用聚丙烯酰胺凝胶电泳，检测的对象是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”使用标记的第二抗体。

通过PAGE分离的蛋白质样品被转移到固体载体（例如硝酸纤维素膜）上，该固体载体以非共价键的形式吸附蛋白质，并且可以使通过电泳分离的多肽类型及其生物学活性保持不变。固体载体上的蛋白质或多肽用作抗原，与相应的抗体反应，然后与被酶或同位素标记的第二抗体反应，并通过底物显色法检测通过电泳分离的特定靶基因表达的蛋白质成分。放射自显影。该技术也广泛用于检测蛋白质表达。