当前位置：文档之家 › Westernblot实验技术

Westernblot实验技术

  • 格式：doc
  • 大小：237.00 KB
  • 文档页数：8

Western blot试剂配制

1. 30%丙烯酰胺：

29.2g丙烯酰胺

用温热（利于溶解双丙烯酰胺）的去离子水（超纯水）溶后定容到100ml，过滤后于棕色瓶中储存

0.8gN, N’-亚甲双丙烯酰胺

注意：丙烯酰胺和双丙烯酰胺在贮存过程中缓慢转变为丙烯酸和双丙烯酸，这一脱氨基反映是光催化或碱催化的，故应核算溶液的pH值不超过7.0。这一溶液置棕色瓶中贮存于4℃，每隔几个月须重新配制。

小心：丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤。

2. 10%SDS：

称5gSDS，超纯水溶解后，定容到50ml。贮存液保存于室温。

3. 10%AP（过硫酸铵）：

称1gAP，溶于8ml超纯水中，定容到10ml，小量分装（250ul/管）保存于-20℃，

过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基，每次使用均要用新鲜的。

4. 1.5MTris-HCl：

称18.2gTris（Mr=121.14）加50ml超纯水溶解后，用浓HCl调pH值8.8，定容到100ml。

5. 0.5MTris-HCl：

称3gTris（Mr=121.14）加25ml超纯水溶解后，调pH值6.8，定容到50ml。

6. TEMED (N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)：

TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。 一旦加入TEMED，立即开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。

7. 10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液【10×（25mMTris+0.25M+0.1%SDS）】pH8.3

30.3g Tris

15.15g Tris

187.65g Glycine 溶于超纯水中，定容到1000ml 93.825g Glycine 5×缓冲液

10g SDS 5g SDS

8. 2×SDS上样缓冲液：2×（50mMTrispH6.8+2%SDS+10%甘油+0.1%溴酚蓝+50mMβ-巯基乙醇）loading buffer

10ml 0.5M Tris-HCl (pH6.8)

2g SDS

10ml 甘油 超纯水定容到50ml。

0.1g 溴酚蓝

5ml β-巯基乙醇

9. Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶溶液

溶液成分 总体积

5ml 总体积

10ml 总体积

15ml 总体积

20ml 总体积

25ml 总体积

30ml

6%

水 2.6ml 5.3ml 7.9ml 10.6ml 13.2ml 15.9ml

30%丙烯酰胺 1.0ml 2.0ml 3.0ml 4.0ml 5.0ml 6.0ml

1.5MTris(pH8.8) 1.3ml 2.5ml 3.8ml 5.0ml 6.3ml 7.5ml 10% SDS 0.05ml 0.1ml 0.15ml 0.2ml 0.25ml 0.3ml

10%过硫酸胺 0.05ml 0.1ml 0.15ml 0.2ml 0.25ml 0.3ml

TEMED 0.004ml 0.008ml 0.012ml 0.016ml 0.02ml 0.024ml

8%

水 2.3ml 4.6ml 6.9ml 9.3ml 11.5ml 13.9ml

30%丙烯酰胺 1.3ml 2.7ml 4.0ml 5.3ml 6.7ml 8.0ml

1.5MTris(pH 8.8) 1.3ml 2.5ml 3.8ml 5.0ml

6.3ml 7.5ml

10% SDS 0.05ml 0.1ml 0.15ml 0.2ml 0.25ml 0.3ml

10%过硫酸胺 0.05ml 0.1ml 0.15ml 0.2ml 0.25ml 0.3ml

TEMED 0.003ml 0.006ml 0.009ml 0.012ml 0.015ml 0.018ml

10%

水 1.9ml 4.0ml 5.9ml 7.9ml 9.9ml 11.9ml

30%丙烯酰胺 1.7ml 3.3ml 5.0ml 6.7ml 8.3ml 10.0ml

1.5MTris(pH 8.8) 1.3ml 2.5ml 3.8ml 5.0ml 6.3ml 7.5ml

10% SDS 0.05ml 0.1ml 0.15ml 0.2ml 0.25ml 0.3ml

10%过硫酸胺 0.05ml 0.1ml 0.15ml 0.2ml 0.25ml 0.3ml

TEMED 0.002ml 0.004ml 0.006ml 0.008ml 0.01ml 0.012ml

12%

水 1.6ml 3.3ml 4.9ml 6.6ml 8.2ml 9.9ml

30%丙烯酰胺 2.0ml 4.0ml 6.0ml 8.0ml 10.0ml 12.0ml

1.5MTris(pH 8.8) 1.3ml 2.5ml 3.8ml 5.0ml 6.3ml 7.5ml

10% SDS 0.05ml 0.1ml 0.15ml 0.2ml 0.25ml 0.3ml

10%过硫酸胺 0.05ml 0.1ml 0.15ml 0.2ml 0.25ml 0.3ml

TEMED 0.002ml 0.004ml 0.006ml 0.008ml 0.01ml 0.012ml

15%

水 1.1ml 2.3ml 3.4ml 4.6ml 5.7ml 6.9ml

30%丙烯酰胺 2.5ml 5.0ml 7.5ml 10.0ml 12.5ml 15.0ml

1.5MTris(pH 8.8) 1.3ml 2.5ml 3.8ml 5.0ml 6.3ml 7.5ml

10% SDS 0.05ml 0.1ml 0.15ml 0.2ml 0.25ml 0.3ml

10%过硫酸胺 0.05ml 0.1ml 0.15ml 0.2ml 0.25ml 0.3ml

TEMED 0.002ml 0.004ml 0.006ml 0.008ml 0.01ml 0.012ml

10. Tris-甘氨酸 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳5% 浓缩胶溶液

溶液成分 总体积 3ml 总体积 4ml 体积 5ml 体积 6ml 体积 8ml

水 1.7ml 2.25ml 2.8ml 3.37ml 4.53ml

30%丙烯酰胺 0.5ml 0.67ml 0.83ml 1.0ml 1.3ml

0.5MTris(pH 6.8) 0.76ml 1.0ml 1.26ml 1.5ml 2.0ml

10% SDS 0.03ml 0.04ml 0.05ml 0.06ml 0.08ml 10%过硫酸胺 0.03ml 0.04ml 0.05ml 0.06ml 0.08ml

TEMED 0.003ml 0.004ml 0.005ml 0.006ml 0.008ml

脱色液：300ml甲醇+100ml冰乙酸+600ml水

考马斯亮蓝染色液：每100ml脱色液中加0.25g考马斯亮蓝R-250，过滤

11. 1×电转液：（25mMTris，192mMGlycine，20%甲醇）

14.4g Gly

3.03g Tris 定容至1000ml

200ml 甲醇

12. 10×TBS（pH7.4）

NaCl：80.06g

溶解后，调pH值为7.4，定容到1000ml

Tris： 24.23g 13. 0.5%丽春红染液：

称0.5g丽春红，加1ml冰醋酸，超纯水定容到100ml

14. TBST缓冲液（含0.05%Tween-20 的TBS缓冲液）：

1×TBS 995ml+5ml 10% Tween-20=1000ml

15. 封闭液（含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液）：

1.5g脱脂奶粉溶解在30ml TBST缓冲液中。4℃存放，恢复室温后使用，一次性使用，一定用新鲜的。

16. 抗体稀释均用封闭液

（4.1NHP：1：500； 4.1GHP：1：1000； 4.1R19：1：1000； 4.1BU2：1：1500）

Western blot细胞解决方法

一，细胞计数法：

1、细胞用胰酶消化收集以后，PBS洗两次，除去培养基中的胎牛血清（胎牛血清对凝胶分离有很大影响）。

2、细胞重悬于适量的PBS中后进行细胞计数（选择合适的PBS量，在保证上样足够细胞的同时保证裂解的效果）。 1-1.5×106个细胞需加100ul 2×SDS上样缓冲液。

3、根据加入的PBS的量加入等量的2*loading buffer，振荡混匀后煮样，2*5min。

4、12023/min离心5min后上样。

3、离心，将PBS吸干净，直接按细胞数量加入适当的1*loading buffer，振荡混匀后煮样，2*5min。

4、12023/min离心5min后上样。（使细胞碎片沉下）

二，蛋白提取定量

具体方法见试剂盒说明书

Western blot实验流程

1， 细胞的准备

2， 蛋白的提取及定量

3， SDS聚丙烯酰胺凝胶的灌制

1）装好电泳装置，按顺序灌胶（分离胶在下层，浓缩胶在上层）

在一小烧杯中按所需丙烯酰胺浓度配制一定体积的分离胶溶液，分离胶灌完后用水封使其平整，大约20min后水与胶面之间有一条折射线，将水到出并用吸水纸吸干，此时便可配制浓缩胶，浓缩胶灌好后立即插上梳子（要平稳避免产气愤泡）。约30min后即可使用。

合集下载

westernblot原理及步骤

westernblot原理及步骤

蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。

原理：

与Southern或Northern杂交方法类似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

步骤：

Western Blot与Southern印迹杂交或Northern印迹杂交方法类似，Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品(跑PAGE 胶的原理你懂吧~~~)，转移到固相载体（硝酸纤维素膜NC膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变（这个过程就是转膜）。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

Western blot实验步骤

Western blot实验步骤

western blot

（以17KD的H3K9me2蛋白为例）

准备：

（1）电转液：称3.03 g Tris碱， 14.5 g Glycine，加入200 ml甲醛，溶解后加双蒸水定容至1000 ml，4 oC保存。（电转液最好现用现配，但是我咨询过的几个实验室同学，一般是重复使用3-4次的，当然电转液最好每周重新配，即使还没用到3-4次）.

（2） 5×电泳缓冲液：称15.1g Tris碱， 94 g Glycine，5.0 g SDS， 定容至1000 ml，4oC保存。使用时用双蒸水稀释成1×电泳缓冲液。

（3）封闭液：称1.5 g脱脂奶粉，加入30ml TBST充分溶解，现用现配。

（4） 10×TBS 缓冲液：称24.2g Tris碱，80 g NaCl， 加入800 ml双蒸水，整PH到7.6，定容至1000 ml。

（5）1×TBS缓冲液：100ml 的10×TBS 缓冲液，加入0.5mlTween20,再加双蒸水定容至1000ml。

1.细胞总蛋白的提取：（提前开4℃离心机，水浴锅调到100℃，裂解液、PMSF和上样缓冲液取出放在冰盒里溶解）

取出细胞，弃去培养液，加3 ml 4℃预冷的PBS。平放轻轻摇动洗涤细胞，然后弃去洗液，将把细胞消化下来，加入PBS重悬，将悬液移到1.5ML的进口EP管内。加入含PMSF的裂解液（提前按100：1的裂解液：PMSF（100 mM）配好混匀于冰上备用，第一次做可按六孔板一孔加100ul,10cm的培养皿加400ul这个量试试，以后可视蛋白浓度来增减裂解液的量），摇匀置于冰上，超声15min后，取出于4℃下12000 rpm 15min,取上清液。分装出20ul的蛋白用来测蛋白质浓度，余下的蛋白加入5×上样缓冲液（加入的蛋白与5×上样缓冲液的比例为：使最终5×上样缓冲液稀释为1×，例如蛋白360ul, 5×上样缓冲液90ul），100℃煮5-10min,待冷却，放到-80℃保存（可保存一个月）。 2.BCA法测蛋白浓度

westernblot原理及步骤 2

westernblot原理及步骤 2

westernblot原理及步骤

Western blot原理及步骤。

Western blot（简称WB）是一种常用的蛋白质分析技术，通过检测特定蛋白在混合物中的存在和量来研究蛋白质的表达和功能。它是一种通过特异性抗体对蛋白质进行识别和检测的方法，具有高灵敏度和高特异性的特点。本文将介绍Western

blot的原理及步骤，希望能对初学者有所帮助。

一、原理。

Western blot的原理基于蛋白质的电泳分离和免疫检测。首先，待检样品经过SDS-PAGE凝胶电泳分离，然后将蛋白质转移到聚丙烯酰胺膜（PVDF）或硝酸纤维素膜上。接下来，膜上的蛋白质与特异性的一抗结合，再与二抗结合，形成特定的免疫复合物。最后，通过化学发光或染色等方法检测蛋白质的存在和量。

二、步骤。

1. 样品制备。

将待检样品加入SDS-PAGE样品缓冲液，并在100℃水浴中煮沸5分钟，使蛋白质变性。然后冷却至室温，并离心去除沉淀物。

2. 凝胶电泳。

将样品加载到SDS-PAGE凝胶孔中，进行电泳分离。根据蛋白质大小选择合适的分离凝胶浓度和电泳条件。

3. 转膜。

将凝胶中分离的蛋白质转移到PVDF或硝酸纤维素膜上，通常使用半干法或湿法转膜。

4. 封闭。 将转膜浸泡在牛血清蛋白（BSA）或非脂奶粉的封闭缓冲液中，阻断非特异性结合位点。

5. 抗体孵育。

将特异性的一抗加入封闭转膜的缓冲液中，孵育一定时间，使一抗与目标蛋白结合。

6. 洗涤。

用洗涤缓冲液洗涤转膜，去除未结合的一抗。

7. 二抗孵育。

将与目标蛋白特异性结合的二抗加入转膜的缓冲液中，孵育一定时间，形成特异性的免疫复合物。

8. 洗涤。

用洗涤缓冲液洗涤转膜，去除未结合的二抗。

9. 检测。

通过化学发光或染色等方法检测蛋白质的存在和量，最终得到Western blot结果。

总结。

Western blot技术是一种重要的蛋白质分析方法，具有高灵敏度和高特异性的优点。掌握其原理及步骤对于科研工作者来说至关重要，希望本文能够对初学者有所帮助。

westernblot详细图解详细版.docx

westernblot详细图解详细版.docx

精选 Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。

经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

实验材料 蛋白质样品

试剂、试剂盒 丙烯酰胺 SDS Tris-HCl β-巯基乙醇

ddH2O 甘氨酸 Tris 甲醇 PBS NaCl KCl

Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰 乙酸 脱脂奶粉 硫酸镍胺 H2O2 DAB试剂盒

仪器、耗材 电泳仪 电泳槽 离心机 离心管 硝酸纤维素膜 匀浆器 剪刀 移液枪 刮棒

实验步骤 一、试剂准备

1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。

2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0

ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。

3. 转膜缓冲液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；

精选 SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。

4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2

g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O至1000 ml。