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世界科学技术—中医药现代化★专题讨论：中药资源研究的前沿技术〔World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica〕收稿日期：2010-06-02修回日期：2010-06-12*国家自然科学基金面上项目（30970307）：叶绿体全基因组条形码鉴定方法研究，负责人：陈士林。
**联系人：林小涵，在读博士研究生，主要研究方向：生药学，E-mail ：lxhlena@ ；李西文，博士，主要研究方向：中药资源可持续利用，E-mail ：xwli@ 。
摘要：本文在总结植物叶绿体基因组测序研究进展基础上，提出了药用植物叶绿体基因组测序的策略，对物种的选择，测序平台的确定，生物信息学工具的综合分析应用，样品提取、分析及检测等技术环节进行了深入讨论。
关键词：药用植物叶绿体全基因组测序策略doi:10.3969/j.issn.1674-3849.2010.03.027叶绿体相关研究在过去的数十年取得了巨大成就，尤其在利用基因序列研究叶绿体的起源、结构、进化、正反向遗传学、叶绿体基因工程等方面取得了重大进展[1~3]。
随着大规模测序技术的不断发展，特别是二代测序技术的应用，极大推动了叶绿体基因组的深入研究。
目前，已有170多个物种的叶绿体全基因组序列在NCBI 发布(/genomes/genlist.cgi?taxid=2759&type=4&name=Eukary -otae%20Organelles ），但多数物种为农作物或经济作物，药用植物的叶绿体全基因组序列相对较少，很大程度上限制了药用植物的药物代谢工程、转基因工程、物种鉴定及进化等方面的发展。
本文在前人研究的基础上，基于新一代测序技术在药用植物叶绿体全基因组测序研究中的应用进行探讨，提出一种新的叶绿体基因组测序的策略。
分子生药学一、分子生药学的含义和研究对象（1）生药：指经过简单加工、直接用于医疗保健或制药原料的药材，包括制药中药、民族药和民间药。
•中药－在中医理论指导下，按照中医的治疗原则使用，并被收载于我国本草著作中的药物。
民间药－指民间医生用于治疗疾病或地区性口耳相传，本草文献无记载，不以中医理论指导的药物。
•民族药－指少数民族使用的、以它们的民族医药理论或传统经验为指导药物。
（2）生药学：利用植物学、动物学、化学等知识，研究生药真伪、优劣等的学科。
研究对象是植物体，植物器官，细胞，化学成分。
•（3）分子生药学：利用分子生物学的理论和方法，研究生药的真伪、优劣的学科。
其研究对象是中药中的DNA，RNA和酶。
二、学习分子生药学的目的意义1. 中药材品种系统整理与质量标准化研究•（1）研究有争议和难鉴定中药材，为确定中药材基源提供理论依据•如黄甘草和胀果甘草的研究，为甘草药材的基源确定提供了依据。
（2）研究有争议的植物类群，促进发现濒危药用植物的替代品。
•基本理论：药用植物亲缘关系越近，形态越相似，化学成分越相近，临床功效越近似，越有可能相互替代。
•当亲缘关系出现争议的时候，可以用分子生药学的方法解决。
例如：•中药材前胡－伞形科前胡属植物白花前胡和紫花前胡的干燥根•紫花前胡－伞形科当归属植物－伞形科前胡属植物•分子证据说明紫花前胡应是当归属植物•2、药用动植物生物多样性保护与生药资源可持续利用研究•研究濒危动植物保护种群的范围•确定物种内基本保护单元是优化和实施保护策略的基础。
•如：海南黑长臂猿是黑长臂猿的亚种；DNA序列差异较大，足以接近种的水平，而且只有15只，被列入最优先保护范围。
3、药用植物分子标记育种与新品种的培育•（1）新品种选育（2）种子种苗纯度鉴定•种子纯度是保证优良品种增产潜力得以发挥的关键因素，保证种子质量具有重要意义。
•田间试验－DNA指纹技术4、代谢途径基因调控与中药材品质定向调控•初生代谢产物相同，以此为起点，产生各种各样成分，可阻断某一代谢途径，促进另一条代谢途径的产物积累•5、利用基因工程和组织培养技术，高效表达和生产天然活性成分•含量低，价钱贵的活性成分的生物生产（1）毛状根培养（2）生物转化6、基因工程与绿色无公害药用植物•（1）农药残留（2）重金属污染7、道地药材的形成机制研究道地性越明显，种群的基因特化就越明显。
系统发育学进展及其在生物学研究中的应用随着科技的发展与应用，我们对于生物学中最基本的概念已经有了更深刻的理解。
其中，系统发育学作为生物系统进展方面的重要领域，对于生物学研究具有着十分重要的意义。
在本文中，将对于系统发育学的进展与生物学研究中的应用进行探讨。
一、系统发育学的发展历程与现状系统发育学由于其对于生物分类与演化的研究具有着重要的意义，自19世纪以来一直受到生物学家的重视。
从最早的形态学与生物地理学方法，到基于分子数据的系统发育推断，系统发育学的研究方法愈加完善，研究结果也更加精细。
其中，分子系统发育学尤为重要，其利用基因或蛋白质序列数据建立物种之间的进化树，从而反映出它们之间的相似度。
通过这种方式，我们可以准确、可靠地重新定义不同物种以及它们之间的关系，从而更好地理解它们之间的演化、分类及其与环境的关系。
目前，系统发育学的相关研究分支主要包括进化发育学（evodevo）、适应性演化学（adaptive evolution）、系统发育生理学等方面，每一方面都在不断地拓展我们对于生物系统进展的了解。
二、系统发育学在生物学研究中的应用1、演化史研究系统发育学的一个主要应用就是在生物分类中的应用。
通过对于不同物种基因数据的比较、分析，生物学家们可以根据不同物种之间的相似度重新定义它们的分类关系。
而这种重新定义往往会为生物学的研究、理解和保护提供更有价值的依据。
例如，通过对于哺乳动物系统发育的分析，科学家们重新定义了各种哺乳动物的亲缘关系，从而拓展了对于哺乳动物的分类与进化历程的了解。
2、药物研发通过对于生物之间基因、蛋白质序列等分子结构的比较、分析，可以发现这些结构上的差异、相似性等，特别是对于药物研发有着十分重要的意义。
例如，通过分析不同生物体之间基因的差异，科学家们可以发现一些意想不到的机制，进而寻找到新的治疗方式。
如今年肺炎疫情中，抗体所采用的发现就得益于系统发育学的相关研究。
3、生物进化机制探究生物进化机制及其影响因素一直是生物学家关注的重点之一，而系统发育学的研究为我们揭示了许多以往难以解释、理解的问题，如非洲长臂猿的进化、人类的起源等。
生物信息学在DNA序列比对中的应用研究DNA序列比对是生物信息学中一项重要的研究内容，它可以帮助科学家在基因组层面上研究不同物种间的亲缘关系、寻找基因突变及发现新基因等。
生物信息学技术的发展使得DNA序列的比对变得更加高效和准确。
本文将探讨生物信息学在DNA序列比对中的应用研究。
DNA序列比对的目的是将一个DNA序列与另一个参考序列进行比较，查找相似性和差异性的特征。
在比对过程中，科学家使用生物信息学工具和算法来寻找相同或相似的序列片段，并据此得出结论。
DNA序列比对可以应用在许多领域，包括基因组学、系统发育学、药物发现和病毒学等。
首先，DNA序列比对对于研究物种间的亲缘关系和进化历程非常有用。
通过比对DNA序列，科学家可以确定物种之间的共同祖先，并重建进化树。
这有助于我们理解物种之间的亲缘关系，确定不同物种的分类和分类学等级。
此外，DNA序列比对还可以帮助我们了解不同物种的进化速度和突变率，为进一步的进化遗传学研究提供基础。
其次，DNA序列比对也可以用于寻找基因突变和研究遗传疾病。
基因突变是导致许多疾病发生的重要原因之一，比如癌症和遗传性疾病。
通过比对患者的DNA序列与正常人群的参考序列，科学家可以找到突变的位置和类型。
这有助于我们了解突变对基因和蛋白质功能的影响，以及疾病的发生机制。
此外，DNA序列比对还可以识别和鉴定疾病相关的基因变异，为临床诊断和预防提供支持。
此外，DNA序列比对在药物发现方面也发挥着重要作用。
比对不同物种的DNA序列，可以帮助科学家找到特定的基因和蛋白质靶标，以及与之配对的药物。
这有助于加速药物研发过程，提高药物的疗效和选择性。
DNA序列比对还可以帮助我们了解药物的作用机制和药物代谢途径，为设计个体化的治疗方案提供依据。
最后，DNA序列比对在病毒学研究中也有广泛的应用。
通过比对病毒的DNA序列，科学家可以推断不同病毒株之间的关系，揭示其进化历程和传播途径。
这对于病毒溯源、疫苗设计和抗病毒药物的研发都至关重要。
近年来，随着分子生物学、分子遗传学与分子药理学，特别是基因组学的发展，人们逐渐认识到，不同个体对同一药物的不同反应，大多源于基因的差异。
由此，在药物遗传学的基础上，发展形成了药物基因组学这一新学科，在分子和基因水平上研究揭示个体对药物不同反应的机理，为科学合理用药开拓了新的思路和途径。
1、什么是药物基因组学药物基因组学是以药物效应和安全为主要目标，研究药物体内过程差异的基因特性，以及基因变异所致的不同患者对药物的不同反应，从而研究开发新的药物和合理用药方法的一门新学科。
这个学科以与药物效应有关的基因为靶点，以基因多态性与药效多样性为平台，研究遗传基因及基因变异对药物效应的影响。
它是基于功能基因组学与分子药理学，从基因水平研究人类个体对药物效应不同的分子机理的学科。
药物基因组学的创立，为研究高效、特效药物开辟了新的途径，为患者和特定人群寻找合适的药物及适宜的用药方法展现了新的前景。
2、药物基因组学的诞生药物基因组学是在药物遗传学基础上发展起来的新学科。
早在20世纪50年代，人们就发现，不同的遗传背景会导致药物反应的差异，特别是药物代谢酶基因的差异可引起药物的不良反应。
例如，由胆碱酯酶基因引起的胆碱酯酶缺乏，可使琥珀胆碱的肌松作用时间延长；抗疟药物治疗时的溶血现象与红细胞中编码葡萄糖－6－磷酸脱氢酶的基因有关，葡萄糖－6－磷酸脱氢酶活性降低时可引起抗疟药的溶血作用；外周神经病变的病人，对异烟肼的反应差异与编码药物乙酰代酶的基因有关。
这些发现表明，由于编码药物代谢酶基因的多态性，可导致它所编码的酶具有不同活力，从而引起相关药物的不同反应。
20世纪70年代开始分子遗传变异的研究，杰弗里提出基因中每100个碱基中就有1个呈现变异；到20世纪80 年代后期，科学家们把这些差异引进药物遗传学。
第一个被阐明具有基因多态性的酶是细胞色素P450酶系中CYP2D6。
编码此酶的基因具有多态性，导致病人对药物呈现快代谢和慢代谢两种不同的代谢方式，慢代谢型病人的CYP2D6酶不能很快地分解药物，使病人血液中的活性药物浓度升高，易导致体温过低、惊厥或肾衰。
药学学报Acta Pharmaceutica Sinica2014,49(10):1387−1394・1387・从药用亲缘学到药用基因组亲缘学:分子系统发育、进化与药物发现郝大程1*,肖培根2*,刘明1,彭勇2,何春年2(1.大连交通大学生物技术研究所,环境化工学院,辽宁大连116028;2.中国医学科学院、北京协和医学院药用植物研究所,北京100193)摘要:近年随着高通量测序技术的迅猛发展,生物系统发育研究中开始采用基因组数据,因此出现一些新术语,如系统发育基因组学(phylogenomics,基因组系统学/基因组亲缘学)、药用基因组亲缘学(pharmacophy-logenomics)、转录组亲缘学(phylotranscriptomics)等。
系统发育基因组学是进化和基因组学的交叉学科,是将基因组数据用于进化关系重建的综合分析;药用亲缘学研究药用生物(特别是药用植物)的生物亲缘关系、化学成分和疗效(传统疗效和药理活性)间的相关性;系统发育基因组学方法可用于药物发现和开发的相关问题研究,在组学水平拓展了药用亲缘学的领域,由此衍生出药用基因组亲缘学。
系统学(亲缘学)是生命科学各分支和交叉学科的根基所在,在生药学和药用生物学等药学相关领域起到提纲挈领的作用。
在此对与药用亲缘学(pharmaphylogeny)密切相关的若干术语做一简要辨析。
关键词:药用亲缘学;药用基因组亲缘学;分子系统发育;进化;药物发现中图分类号:R931文献标识码:A文章编号:0513-4870(2014)10-1387-08Pharmaphylogeny vs.pharmacophylogenomics:molecular phylogeny,evolution and drug discoveryHAO Da-cheng1*,XIAO Pei-gen2*,LIU Ming1,PENG Yong2,HE Chun-nian2(1.Biotechnology Institute,School of Environment and Chemical Engineering,Dalian Jiaotong University,Dalian116028,China; 2.Institute of Medicinal Plant Development,Chinese Academy of Medical Sciencesand Peking Union Medical College,Beijing100193,China)Abstract:With the surge of high-throughput sequencing technology,it is becoming popular to perform the phylogenetic study based on genomic data.A bundle of new terms is emerging,such as phylogenomics, pharmacophylogenomics and phylotranscriptomics,which are somewhat overlapping with pharmaphylogeny.Phylogenomics is the crossing of evolutionary biology and genomics,in which genome data are utilized for evolutionary reconstructions.Pharmaphylogeny,advocated by Prof.Pei-gen Xiao since1980s,focuses on the phylogenetic relationship of medicinal plants and is thus nurtured by molecular phylogeny,chemotaxonomy and bioactivity studies.Phylogenomics can be integrated into the flow chart of drug discovery and development, and extend the field of pharmaphylogeny at the omic level,thus the concept of pharmacophylogenomics could be redefined.This review gives a brief analysis of the association and the distinguished feature of the pharmaphylogeny related terms,in the context of plant-based drug discovery and sustainable utilization of pharmaceutical resource.Key words:pharmaphylogeny;pharmacophylogenomics;molecular phylogeny;evolution;drug discovery收稿日期:2014-04-21;修回日期:2014-07-24.基金项目:科技部国家支撑计划(2012BAI29B01).*通讯作者Tel:86-411-84572552,E-mail:hao@;xiaopg@・1388・药学学报Acta Pharmaceutica Sinica2014,49(10):1387−1394近年随着高通量测序技术的迅猛发展,生物系统发育研究中开始采用基因组数据,因此出现一些新术语,如系统发育基因组学(phylogenomics,基因组系统学/基因组亲缘学)、药用基因组亲缘学(pharmacophylogenomics)、转录组亲缘学(phylotranscriptomics)等。
系统学(亲缘学)是生命科学各分支和交叉学科的根基所在,在生药学和药用生物学等药学相关领域起到提纲挈领的作用。
在此对与药用亲缘学(pharmaphylogeny)密切相关的若干术语做一简要辨析。
1系统发育基因组学系统发育基因组学是进化和基因组学的交叉学科,是将基因组数据用于进化关系重建的综合分析,因此需要系统发育(phylogenetics)研究技术和基因组学技术的有机整合。
系统发育研究是比较分析单个基因或几个基因序列[1,2],也常结合其他类型数据,例如形态学和植物化学[3,4]数据。
系统发育基因组学基于基因组时代之前的分子系统学研究,通过比较全基因组序列或至少大部分基因组序列来获取对进化关系重建有用的信息。
目前该领域研究包括:1.1基因功能预测和进化推演现存种子植物超过26万种,在进化史上均经历多次全基因组倍增(whole genome duplication,WGD),倍增基因拷贝在基因组中通常以保守的同线块(syntenic block)形式存在。
在植物进化过程中,基因组大小变化是一种相对频繁的事件,这些变化一般并不与基因多少及顺序变化相关联。
基因数量及顺序的保守性称为同线性(synteny或colinearity)。
倍增影响新性状起源,近年来植物次生代谢路径多样化与WGD有关的例子越来越多。
硫代葡糖苷(GS)及其降解产物异硫氰酸盐的抗癌活性已引起关注。
Hofberger等[5]发现WGD 和串联倍增(tandem duplication,TD)加速十字花科(Brassicaceae)硫苷次生代谢路径的遗传多样性(图1)。
在模式植物拟南芥(At)中硫苷生物合成需要至少52个生物合成和调控基因。
发现位于十字花目(Brassicales)系统树基部的阿拉伯岩芥菜(Aethionema arabicum,Aab)有多达67个硫苷生物合成基因,大部分拟南芥硫苷生物合成基因家族都能在阿拉伯岩芥菜找到直系同源基因,且大多表现出同线型。
拟南芥45%蛋白编码基因有多于一个拷贝,而拟南芥和岩芥菜硫苷路径多达95%和97%基因有多拷贝,提示硫苷类化合物在植物防御中的重要性。
对倍增基因拷贝的序列联配表明在最近一次WGD发生了显著的硫苷路径基因倍增。
硫苷路径基因的串联倍增及随后发生的亚功能化(subfunctionalization)和新基因化(neofunctionalization)过程进一步增加了硫苷次生代谢产物的遗传多样性和化学多样性,增强了植物适应环境变化的能力,显示了植物次生代谢产物化学空间在药物发现方面的巨大潜力。
倍增基因拷贝同样可以解释萜类等其他多基因路径合成的次生代谢产物的多样化过程。
被子植物中已发现次生代谢产物超过20万种,可能大部分源自复杂性状的快速创新。
Figure1Duplicate distribution among Arabidopsis protein-coding genes compared with AtGS and Aethionema GS loci, redrawn from ref[5].Percentage of genes with retained ohnolog (clusters of dose-sensitive genes organized in functional modules), tandem duplicate,and gene transposition duplicate(GTD)are shown.GS metabolic flexibility during lineage evolution arose from a permutation of increased ohnolog retention and TD rates 甾体糖生物碱(steroidal glycoalkaloid,SGA)具细胞毒活性,能抑制乙酰胆碱酯酶,破坏细胞膜功能。
Manrique-Carpintero等[6]研究了茄属(Solanum)6个野生种和种植马铃薯SGA代谢路径5个基因的自然变异和全基因组SNP基因分型。
5个基因包括属于初级代谢的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶1和2(HMG1、HMG2)以及2.3-鲨烯环氧酶(SQE),属于次级代谢的茄碱半乳糖基转移酶(SGT1)和葡糖基转移酶(SGT2)。
测序3.7kb DNA检测到354个变异。
内含子中发现的变异多于外显子,次生代谢途径的关键酶编码基因中的变异多于初级代谢基因。
dN/dS<1以及Tajima’s D检验为负值提示存在纯化选择和遗传搭车(hitchhiking,指看似对生物体适应性及进化没有贡献的搭车客突变)。
