沙氏液体培养基

霉菌与酵母菌计数方法1试验菌液得制备与使用(以白色念珠菌为示例)白色念珠菌(0)代↓传代培养↓实验菌液得制备:沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培养基,培养温度20～２5℃,培养时间2~3天↓计数培养基适用性检查:胰酪大豆胨琼脂培养基,培养温度３0～3５℃,培养时间不超过5天,接种量不大于10０cｆu↓计数方法适用性试验:胰酪大豆胨琼脂培养基(ＭPＮ法不适用),培养温度３０～３5℃,培养时间不超过５天,接种量不大于10０cfu 注:当需用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌与酵母菌总数时,应进行培养基适用性检查,检查方法同沙氏葡萄糖琼脂培养基1.１菌种试验用菌株得传代次数不得超过５代(从菌种保藏中心获得得干燥菌种为第0代),并采用适宜得菌种保藏技术进行保存,以保证试验菌株得生物学特性。

1。

2菌液制备(按表1规定程序培养各试验菌株)取白色念珠菌得新鲜培养物↓用pH7、0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液或0、9％无菌氯化钠溶液制成适宜浓度得菌悬液取黑曲霉得新鲜培养物↓加入3～５ｍｌ含0.０５%聚山梨酯80得pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液或0、9％无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱↓采用适宜得方法吸出孢子悬液至无菌试管内↓用含0。

05％聚山梨酯80得pＨ7.０无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液或0。

９%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度得黑曲霉孢子悬液菌液制备后若在室温下放置,应在2小时内使用;若保存在２~8℃,可在24小时内使用、稳定得黑曲霉孢子悬液可保存在2~８℃,在验证过得贮存期内使用、1。

３阴性对照为确认试验条件就是否符合要求,应进行阴性对照试验,阴性对照试验应无菌生长。

如阴性对照有菌生长,应进行偏差调查、2、培养基适用性检查按表1规定,接种不大于100cｆu得菌液至沙氏葡萄糖琼脂培养基平板↓置表１规定条件下培养↓每一试验菌株平行制备2管或2个平皿↓同时,用相应得对照培养基替代被检培养基进行上述试验↓被检固体培养基上得菌落平均数与对照培养基上得菌落平均数得比值应在0。

有限公司一次性使用无菌检查方法适用性试验1、样品信息2、培养基及试剂3、菌种基本信息：4、菌液制备：2.1接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨y 液体培养基中或胰酪大豆胨琼脂培养基上，30～35℃培养18～24小时，培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。

2.2接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35℃培养18～24小时，培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。

2.3接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中或沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20～25℃培养24～48小时，培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含菌数小于100cfu的菌悬液。

2.4接种黑曲霉菌的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20～25℃培养5～7天，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。

然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌孢子悬液。

6、无菌检查直接接种法方法适用性试验6.1供试品制备：取质量浓度为9g/L的无菌氯化钠溶液为浸提介质，按管内表面积每10cm2流过内腔1ml,浸提介质，流量约为10mL/min 。

6.2试验组：取装量为 15 ml的硫乙醇酸盐流体培养基3管，各接种 1ml供试液，并分别接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌；取装量为 10 ml的胰酪大豆胨液体培养基3管，各接种 1ml供试液，并分别接种小于100cfu的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉。

6.3对照组：取装量为 15 ml硫乙醇酸盐流体培养基3管，分别接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌；取装量为 10 ml的胰酪大豆胨培养基3管，分别接种小于100cfu的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉。

培养基管理规程1目的建立培养基的管理规程，保证培养基的正常使用，从而保证试验数据的可靠性。

2范围适用于培养基的采购、接收入库、存储、配制、灭菌、技术性验收、使用及销毁。

3职责3.1微生物实验员负责培养基的申请、接收入库、配制、灭菌、储存、技术性验收、使用及销毁。

3.2组长负责对培养基技术性验收记录进行审核。

3.3主任负责定期对培养基在配制、灭菌、使用过程中的监督审核。

4内容4.1培养基的申请由微生物实验员根据培养基的使用情况（包括临时检验需要），提出购买计划，注明培养基的名称、数量、规格等，交微生物部主任审核后由总经理批准。

之后采购人员按照《外部提供的产品和服务管理程序》向合格供应商采购。

4.2培养基的接收与入库购回时由库房管理员、采购员及实验人员负责接收登记，接收时应检查、核对培养基的名称与数量是否与申购的一致；培养基的包装是否完好。

若数量不对或外包装破损或培养基已经超过二分之一有效期的（如：血平板的有效期为2个月，申购回来的培养基的使用时间仅剩21天的），则拒绝签收。

经检查、核对无误后，由微生物实验人员作好记录，填写《培养基出入库登记表》。

4.3培养基的存储新到货的培养基按照培养基说明书上的要求妥善保存；超过有效期还未用完的培养基，应集中放置于一个地方，并标示清楚，此类培养基不可用于对外出具报告的试验，仅能用于科研；开瓶后的干粉培养基自开瓶之日起，有效期为一年，但不得超过供应商规定的有效期。

配制好的培养基，于2-25℃条件下存储，可保存三周。

制成琼脂平板的培养基，需放置于呼吸袋中，在呼吸袋上标记好培养基名称、配制时间及有效期，于2-8℃冰箱保存，可保存一周。

4.4培养基的配制4.4.1干粉培养基在领用时需填写《培养基出入库记录》。

在开瓶使用时，需贴上《微生物开启标签》，注明开启日期、有效期至、开启人、复核人，并且不得把原标签覆盖。

4.4.2配制培养基选用市售脱水培养基。

4.4.3器具耗材：天平、电磁炉、pH计、不锈钢锅、玻璃棒、烧杯、试管、三角瓶、试管架、硅胶塞、线绳/橡皮筋、牛皮纸、称量勺等。

.培养基适用性验证方案起草人：方案审核人：方案批准人：XXXXX药业股份有限公司目录1. 验证目的 (2)2. 参照标准 (2)3. 验证项目 (2)4. 验证小组人员及职责 (3)5. 验证可接受的标准 (3)6. 验证步骤 (3)7. 菌液制备 (6)8. 适用性检查 (6)9. 控制菌检查 (7)10. 操作方法 (8)11.结论 (11)1. 验证目的：需氧菌、霉菌及酵母菌计数用的培养基及控制菌培养基应进行培养基的适用性检查。

本次验证的目的是确认胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基适合需氧菌、霉菌及酵母菌总数及测定和控制菌适用性检查。

2. 参照标准：2015版中国药典微生物限度检查法。

3. 验证项目：营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基的适用性检查和控制菌适用性检查。

4.验证小组人员及职责：4.14.2验证人员职责及要求4.2.1按验证方案及相关文件实施验证。

4.2.2认真观察并做好验证原始记录。

4.2.3对实施验证的结果负责。

4.3验证中各部门的职责4.3.1验证领导组职责4.3.1.1制订验证总计划，负责全公司验证工作的管理。

4.3.1.2确定验证项目及验证项目负责人。

4.3.1.3负责验证方案的批准工作。

4.3.1.4负责验证资料及结果的审核工作。

4.3.1.5负责验证报告的批准工作。

4.3.2验证工作小组职责4.3.2.1负责验证方案的起草工作。

4.3.2.2参与验证方案的讨论、确认工作。

4.3.2.3负责验证方案的实施。

4.3.2.4负责验证结果的分析、统计、报告工作。

4.3.2.5参与验证结果的评价工作。

4.3.3质量部职责4.3.3.1负责验证方案的审核工作。

4.3.3.2负责验证过程中仪器、仪表、计量器具的校验工作。

4.3.3.3负责验证中各项检测工作，提供验证的检验记录、检验报告，对验证过程中的各项检验工作负责。

4.3.3.4负责验证资料和报告的审核工作。

4.3.3.5负责验证文件回收、归档管理工作。

培养基适用性检查操作规程编制人：日期：部门：微生物室审核人：日期：替代：批准人：日期：执行日期：1、目的建立一个培养基适用性检查操作规程。

2、适用范围微生物限度及无菌检查的成品培养基，由脱水培养基或按处方配置的培养基均应进行培养基适用性检查。

3、检验依据按2010年版《中国药典（一、二部）》附录无菌方法进行测试检查。

4、试验所需菌种大肠埃希菌；金黄色葡萄球菌；枯草芽孢杆菌；生孢梭菌；白色念珠菌；黑曲霉。

5、标准规定5.1 无菌培养基使用性检查5.1.1 无菌性：每批培养基随机取不少于5支（瓶），经培养14天应无菌生长。

5.1.2 灵敏度：经培养对照管应无菌生长，试验管接菌小于100cfu均应生长良好。

5.2 微生物限度使用性检查5.2.1 细菌、霉菌和酵母菌计数检查取标准菌株大肠、金葡、枯草、白念、黑曲霉菌50～100cfu,分别接入于测试与对照培养基，经规定温度、时间培养，测试结果测试与对照培养基平均菌落数比不应小于70%。

5.2.2 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌检查取新鲜标准菌株大肠、金葡、铜绿假单胞菌制备使成10～100cfu菌悬液，分别对测试与对照培养基进行促生长能力、抑制能力及指示能力测试，结果被测培养试验菌的生长反应情况与对照培养基一致。

（液体培养基应记录为生长良好/生长微弱/未生长；固体培养基应记录为符合xx菌特征/不符合xx菌特征）。

5.2.3 大肠埃希菌、大肠菌群检查取新鲜标准菌株大肠、金葡球菌制备使成10～100cfu菌悬液，分别对测试与对照培养基进行促生长能力、抑制能力即指示能力测试，结果被测培养基试验菌的的生长反应情况应与对照培养基一致。

（液体培养基应记录为生长良好/生长微弱/未生长；固体培养基应记录为符合xx菌特征/不符合xx菌特征）。

5.2.4白色念珠菌、梭菌检查取新鲜标准菌株大肠、白念、生孢梭制备使成10～100cfu菌悬液，分别对测试与对照培养进行促生长能力、抑制能力及指示能力测试，结果被测培养基试验菌的生长反应情况应与对照培养基一致。

1.目的建立培养基的管理规程，确保产品的无菌及微生物限度检查结果真实可靠。

2.范围适用于实验室使用的培养基的管理。

3.职责3.1.实验员及实验室管理员负责对本制度实施。

3.2.QA负责监测本规程的执行。

4.规程4.1.种类和要求：本实验室无菌检查和微生物限度检查所使用的培养基均为脱水、干燥的商品培养基，商品培养基应有处方、使用说明和质量报告书。

培养基包括硫乙醇酸盐流体培养基、胰酪大豆胨液体培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基等培养基，要求来源于正规的生产厂家。

4.2.培养基的购买:岗位实验员要根据培养基使用情况及剩余量及时向部门领导提出申购，经部门领导审批后方可购买。

应当从可靠的供应商处采购，生产厂家应尽量稳定，必要时应当对供应商进行评估；一次购入量不宜过多。

4.3.培养基的接收：培养基购进后，由岗位实验员负责接收，并及时填写《培养基接收登记表》（附件1），如培养基标签未标注效期，则应当在培养基的容器上标注接收日期。

4.4.培养基的保管4.4.1.培养基性状均为粉末，有特殊气味，容易受潮。

岗位实验员负责核对品名、数量后，按标签的要求于阴凉干燥处贮存，防止光照，潮湿。

4.4.2.储存期限:新购进未开瓶的干粉培养基按厂家说明书上的储存期限储存。

开口后的干粉培养基的储存条件和效期均按说明书上的规定执行。

4.4.3.开封后的干粉培养基使用后用3M封口膜缠绕密封。

4.5.培养基的使用4.5.1.在制备培养基时，应按使用说明上的要求操作配制，每次配制前应检查脱水培养基是否变质，如结块、变色、变味等，不得使用结块或颜色发生改变的脱水培养基。

每次使用需在需登记《培养基领用记录》（附件2）。

4.5.2.培养基配制时应准确称量脱水培养基，并做好记录，配制培养基所用容器和配套器具应洁净，配制培养基的溶剂为去离子水或纯化水。

脱水培养基应完全溶解于水中，再进行分装与灭菌。

配制时若需要加热助溶，应注意不要过度加热，以避免培养基炭化颜色变深。

㊀山东农业科学㊀２０２３ꎬ５５(６):８５~９４ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ㊀ＤＯＩ:１０.１４０８３/ｊ.ｉｓｓｎ.１００１－４９４２.２０２３.０６.０１２收稿日期:２０２２－０８－３０基金项目:山东省科技部重点专项 大宗疫情药材柴胡野生抚育关键技术集成与产业化推广应用 (ＳＱ２０２０ＹＦＦ０４２６２８６)作者简介:杜衎(１９９７ )ꎬ男ꎬ河北廊坊人ꎬ硕士研究生ꎬ研究方向为中药资源鉴定与分类ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｄｋ１３２８８＠１６３.ｃｏｍ通信作者:高德民(１９７３ )ꎬ男ꎬ山东济南人ꎬ博士ꎬ副教授ꎬ研究方向为中药资源品质与开发应用ꎮＥ－ｍａｉｌ:Ｇｄｍ０１１５＠１６３.ｃｏｍ北柴胡内生真菌分离鉴定及其生防促生活性分析杜衎１ꎬ高德民１ꎬ孙燕１ꎬ冯筱涵１ꎬ曹海禄２ꎬ张颖颖３(１.山东中医药大学药学院ꎬ山东济南㊀２５０３５５ꎻ２.恒德本草(北京)农业科技有限公司ꎬ北京㊀１０００７１ꎻ３.山东中医药大学中医学院ꎬ山东济南㊀２５０３５５)㊀㊀摘要:为揭示北柴胡植株内生真菌组织分布特点ꎬ探索具有拮抗活性和促生活性内生真菌资源ꎬ本试验采用组织块分离法对北柴胡植株根㊁茎㊁叶内生真菌进行分离并鉴定ꎬ通过活性测试ꎬ包括体外抑菌活性㊁产真菌细胞壁降解酶能力㊁分泌ＩＡＡ能力㊁固氮活性㊁解钾活性㊁溶磷活性㊁产铁载体能力ꎬ筛选具有生防与促生作用的北柴胡内生真菌ꎮ结果表明ꎬ北柴胡内生真菌在茎中的分离率(８４.１４％)㊁多样性指数(１.３１)最高ꎬ青霉菌属(Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ)与生赤壳属(Ｂｉｏｎｅｃｔｒｉａ)为根㊁叶内生真菌优势属ꎬ链格孢属(Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ)和曲霉属(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ)为茎内生真菌优势属ꎮ在５４株测试菌株中ꎬＢＣＳ－４２８[深绿木霉(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ)]及其发酵液抑菌活性最高ꎬＢＣＳ－５９１[尖孢镰刀菌(Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍ)]及ＢＣＳ－５００[草酸青霉(Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｏｘａｌｉｃｕｍ)]具有较高的ＩＡＡ分泌能力ꎬ分泌量分别为５９.５５ｍｇ/Ｌ和７６.１６ｍｇ/ＬꎮＢＣＲ－５１３[嗜松篮状菌(Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓｐｉｎｏｐｈｉｌｕｓ)]具有较强的解钾活性ꎬ相比空白营养液ꎬ菌液可溶性钾增加２６.７６ｍｇ/ＬꎻＢＣＬ－４４９(Ｃｏｐｒｉｎｅｌｌｕｓｓｉｌｖａｔｉｃｕｓ)具有较强的固氮活性ꎬ菌液可溶性氮含量增加１１１.５１ｍｇ/ＬꎻＢＣＲ－４２７(Ａｐｈａｎｏｃｌａｄｉｕｍａｒａｎｅａｒｕｍ)和ＢＣＳ－４２０[细疣篮状菌(Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓｕｓ)]表现出较强的溶解有机磷与无机磷活性ꎮ综上ꎬ北柴胡内生真菌资源丰富ꎬ从北柴胡内生真菌中寻找开发生防与促生功能菌株具有巨大潜力ꎮ关键词:北柴胡ꎻ内生真菌ꎻ抑菌活性ꎻ植物促生活性中图分类号:Ｓ５６７.７＋９㊀㊀文献标识号:Ａ㊀㊀文章编号:１００１－４９４２(２０２３)０６－００８５－１０ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＥｎｄｏｐｈｙｔｉｃＦｕｎｇｉｆｒｏｍＢｕｐｌｅｕｒｕｍｃｈｉｎｅｎｓｉｓＤＣ.ａｎｄＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＴｈｅｉｒＢｉｏｃｏｎｔｒｏｌａｎｄＧｒｏｗｔｈ￣ＰｒｏｍｏｔｉｎｇＡｃｔｉｖｉｔｙＤｕＫａｎ１ꎬＧａｏＤｅｍｉｎ１ꎬＳｕｎＹａｎ１ꎬＦｅｎｇＸｉａｏｈａｎ１ꎬＣａｏＨａｉｌｕ２ꎬＺｈａｎｇＹｉｎｇｙｉｎｇ３(１.ＳｃｈｏｏｌｏｆＰｈａｒｍａｃｙꎬＳｈａｎｄｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅꎬＪｉｎａｎ２５０３５５ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＨｅｎｇｄｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ(Ｂｅｉｊｉｎｇ)ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏ.ꎬＬｔｄ.ꎬＢｅｉｊｉｎｇ１０００７１ꎬＣｈｉｎａꎻ３.ＳｃｈｏｏｌｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅꎬＳｈａｎｄｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅꎬＪｉｎａｎ２５０３５５ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀ＩｎｏｒｄｅｒｔｏｒｅｖｅａｌｔｈｅｔｉｓｓｕｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｆｕｎｇｉｆｒｏｍＢｕｐｌｅｕｒｕｍｃｈｉｎｅｎｓｅＤＣ.ａｎｄｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｒｅｓｏｕｒｃｅｓｏｆｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｆｕｎｇｉｗｉｔｈａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃａｎｄｇｒｏｗｔｈ￣ｐｒｏｍｏｔｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ.ＩｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬｔｈｅｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｆｕｎｇｉｆｒｏｍｔｈｅｒｏｏｔｓꎬｓｔｅｍｓａｎｄｌｅａｖｅｓｏｆＢ.ｃｈｉｎｅｎｓｅＤＣ.ｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄａｎｄｉｄｅｎｔｉ￣ｆｉｅｄｂｙｔｉｓｓｕｅｂｌｏｃｋｉｓｏｌａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ.Ｔｈｅｉｎｖｉｔｒｏａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙꎬｆｕｎｇａｌｃｅｌｌｗａｌｌｄｅｇｒａｄｉｎｇｅｎｚｙｍｅｐｒｏ￣ｄｕｃｔｉｏｎａｂｉｌｉｔｙꎬＩＡＡｓｅｃｒｅｔｉｏｎａｂｉｌｉｔｙꎬｎｉｔｒｏｇｅｎｆｉｘａｔｉｏｎａｃｔｉｖｉｔｙꎬｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ￣ｄｉｓｓｏｌｖｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙꎬｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎａｃｔｉｖｉｔｙꎬａｎｄｉｒｏｎｃａｒｒｉｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｂｉｌｉｔｙｗｅｒｅｔｅｓｔｅｄｔｏｓｃｒｅｅｎｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｆｕｎｇｉｆｒｏｍＢ.ｃｈｉｎｅｎｓｅＤＣ.ｗｉｔｈｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌａｎｄｇｒｏｗｔｈ￣ｐｒｏｍｏｔｉｎｇｅｆｆｅｃｔｓ.Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎｒａｔｅ(８４.１４％)ａｎｄｄｉｖｅｒｓｉｔｙｉｎｄｅｘ(１.３１)ｏｆｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｆｕｎｇｉｆｒｏｍｔｈｅｓｔｅｍｓｏｆＢ.ｃｈｉｎｅｎｓｅＤＣ.ｗｅｒｅｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔ.ＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍａｎｄＢｉｏｎｅｃｔｒｉａｗｅｒｅｔｈｅｄｏｍｉｎａｎｔｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｆｕｎｇｉｇｅｎｕｓｉｎｒｏｏｔｓａｎｄｌｅａｖｅｓꎬｗｈｉｌｅＡｌｔｅｒｎａｒｉａａｎｄＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｗｅｒｅｔｈｅｄｏｍｉｎａｎｔｏｎｅｓｉｎｓｔｅｍ.Ａｍｏｎｇｔｈｅ５４ｔｅｓｔｅｄｓｔｒａｉｎｓꎬＢＣＳ￣４２８(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ)ａｎｄｉｔｓｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｂｒｏｔｈｈａｄｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙꎬＢＣＳ￣５９１(Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍ)ａｎｄＢＣＳ￣５００(Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｏｘａｌｉｃｕｍ)ｈａｄｈｉｇｈｅｒＩＡＡｓｅｃｒｅｔｉｏｎａｂｉｌｉｔｙｗｉｔｈｔｈｅｓｅｃｒｅｔｉｏｎａｍｏｕｎｔｓｏｆ５９.５５ｍｇ/Ｌａｎｄ７６.１６ｍｇ/Ｌꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.ＢＣＲ￣５１３(Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓｐｉｎｏｐｈｉｌｕｓ)ｈａｄｓｔｒｏｎｇｅｒｐｏｔａｓｓｉｕｍ￣ｓｏｌｕｂｉｌｉｚｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙꎬａｎｄｃｏｍ￣ｐａｒｅｄｔｏｔｈｅｂｌａｎｋｎｕｔｒｉｅｎｔｓｏｌｕｔｉｏｎꎬｔｈｅｓｏｌｕｂｌｅｐｏｔａｓｓｉｕｍｉｎｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｌｓｏｌｕｔｉｏｎｉｎｃｒｅａｓｅｄｂｙ２６.７６ｍｇ/Ｌ.ＢＣＬ￣４４９(Ｃｏｐｒｉｎｅｌｌｕｓｓｉｌｖａｔｉｃｕｓ)ｈａｄｓｔｒｏｎｇｅｒｎｉｔｒｏｇｅｎｆｉｘａｔｉｏｎａｃｔｉｖｉｔｙꎬａｎｄｔｈｅｓｏｌｕｂｌｅｎｉｔｒｏｇｅｎｃｏｎｔｅｎｔｉｎｂａｃｔｅｒｉａｌｌｉｑｕｉｄｉｎｃｒｅａｓｅｄｂｙ１１１.５１ｍｇ/Ｌ.ＢＣＲ￣４２７(Ａｐｈａｎｏｃｌａｄｉｕｍａｒａｎｅａｒｕｍ)ａｎｄＢＣＳ￣４２０(Ｔａｌａｒｏｍｙ￣ｃｅｓｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓｕｓ)ｓｈｏｗｅｄｓｔｒｏｎｇｅｒａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｄｉｓｓｏｌｖｉｎｇｏｒｇａｎｉｃａｎｄｉｎｏｒｇａｎｉｃｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ.Ｉｎｓｕｍｍａｒｙꎬｔｈｅｒｅ￣ｓｏｕｒｃｅｓｏｆｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｆｕｎｇｉｉｎＢ.ｃｈｉｎｅｎｓｅＤＣ.ｗｅｒｅａｂｕｎｄａｎｔꎬａｎｄｔｈｅｒｅｗａｓｇｒｅａｔｐｏｔｅｎｔｉａｌｔｏｓｅａｒｃｈａｎｄｄｅ￣ｖｅｌｏｐｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌａｎｄｇｒｏｗｔｈ￣ｐｒｏｍｏｔｉｎｇｓｔｒａｉｎｓｆｒｏｍｔｈｅｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｆｕｎｇｉｏｆＢ.ｃｈｉｎｅｎｓｅＤＣ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀ＢｕｐｌｅｕｒｕｍｃｈｉｎｅｎｓｅＤＣ.ꎻＥｎｄｏｐｈｙｔｉｃｆｕｎｇｉꎻＢａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙꎻＧｒｏｗｔｈ￣ｐｒｏｍｏｔｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙ㊀㊀内生真菌普遍存在于植物健康组织中ꎬ且显著影响植物中代谢产物的形成ꎮ内生真菌作为生物肥料的重要来源ꎬ具有受外界环境影响小㊁对宿主防卫反应耐受度高等优点ꎬ探索植物和内生真菌之间的相互作用是推动农业可持续发展的一种有效策略[１－３]ꎮ近１０年来ꎬ超过８３科２１２种药用植物被分离出３７６属以上的内生真菌ꎬ其中一些内生真菌已经被利用于植物栽培㊁生防菌研发㊁土壤生态修复等[４]ꎮ植物内生真菌的生防和促生功能研究已成为一大热点ꎬＣｈｅｎ等[５]研究表明ꎬ内生真菌卷叶毛霉(ＭｕｃｏｒｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓＤＦ２０)可显著提高丹参酮生物合成途径中某些重要酶基因(ＤＸＳ㊁ＤＸＲ㊁ＨＭＧＲ㊁ＧＰＰＳ)的表达水平ꎬ促进根中丹参酮的生物合成和积累ꎻＳｃｈｍｉｄｔ等[６]发现混合接种内生真菌能显著促进芒草在重金属污染土壤上的生长ꎻ王海霞等[７]从燕麦中分离出的降解淀粉芽孢杆菌对炭疽病防治效果显著ꎮ北柴胡(ＢｕｐｌｅｕｒｕｍｃｈｉｎｅｎｓｅＤＣ.)为«中国药典»规定的柴胡基源植物ꎬ具有抗癌㊁抗炎㊁抗菌等药理作用ꎬ是我国大宗药材和国家重点保护野生药材品种之一[８ꎬ９]ꎮ随着新型冠状病毒肺炎防治的正常化和公共卫生要求的提高ꎬ北柴胡国内外市场需求量和种植面积迅速增加[１０]ꎮ根腐病㊁锈病严重影响北柴胡品质与产量[１１]ꎮ目前北柴胡病害的防治主要依靠化学方法ꎬ化学药剂的长期使用导致农药残留㊁环境污染等问题突出ꎮ因此ꎬ利用北柴胡有益内生真菌发展北柴胡绿色㊁标准化栽培具有很大潜力[１２]ꎮ目前关于北柴胡内生真菌群落结构及功能菌株的研究未见报道ꎬ因此本试验以组织块分离法对北柴胡内生真菌进行分离并鉴定ꎬ初步分析北柴胡内生真菌多样性ꎬ并对内生菌株进行抑菌活性及促生活性测定ꎬ筛选出１１株优良菌株并进行ＩＴＳ分子鉴定ꎬ以期为进一步研究㊁开发与利用北柴胡内生菌资源用于生物防治与植物促生研究奠定基础ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀试验材料１.１.１㊀植物材料㊀北柴胡植株为一年生栽培品成熟期植株ꎬ生长地年均日照时数为２４４６.６ｈꎬ年均气温１４.４ħꎬ年均降水量６６１.７ｍｍꎬ土壤类型为棕壤土ꎮ于２０２１年８月下旬采自山东中医药大学百草园(３６ʎ３３ᶄ２４.７３ᵡＮꎬ１１６ʎ４７ᶄ５０.２４ᵡＥ)ꎬ并经山东省农业科学院生物技术中心鉴定为北柴胡ꎮ新鲜植株用冰袋低温保存ꎬ在２ｈ内进行内生菌分离试验ꎮ１.１.２㊀培养基㊀ＰＤＡ培养基㊁牛肉膏蛋白胨培养基㊁阿须贝氏(Ａｓｈｂｙ)培养基㊁沙氏液体培养基ꎬ６８㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀参考周德庆和徐德强[１２]的配制方法ꎻ无机磷㊁有机磷与解钾菌筛选培养基均参考孙玉[１３]的方法配制ꎻ产葡聚糖酶㊁几丁质酶㊁纤维素酶㊁蛋白酶活性筛选培养基配制参考李雪艳等[１４]的配方ꎮ１.１.３病原指示菌㊀大肠杆菌(Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ)㊁金黄色葡萄球菌(Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ)㊁铜绿假单胞菌(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ)作为指示细菌ꎬ由山东中医药大学医学院微生物实验室张颖颖教授提供ꎻ层生镰刀菌(Ｆｕｓａｒｉｕｍｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｕｍ)㊁尖孢镰刀菌(Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍ)㊁茄病镰刀菌(Ｆｕｓａｒ￣ｉｕｍｓｏｌａｉｎ)作为指示真菌ꎬ由山东省农业科学院孙文研究员提供ꎮ１.２㊀试验方法１.２.１㊀内生真菌分离和纯化㊀参考柳靖婷[１５]的方法ꎬ结合北柴胡组织特点ꎬ采用组织块分离法对北柴胡内生真菌进行分离ꎮ主要消毒条件:７５％乙醇浸泡(根㊁茎５ｍｉｎꎬ叶３ｍｉｎ)及５％ＮａＣｌＯ溶液浸泡(叶５ｍｉｎꎬ根㊁茎１０ｍｉｎ)ꎮ１.２.２㊀内生真菌鉴定㊀参考«真菌鉴定手册»[１６]进行形态学鉴定ꎮ将筛选的菌株纯化后ꎬ在无菌状态下挑取菌丝ꎬ置于研钵中用液氮充分研磨菌丝体至粉末状ꎬ采用ＤＮＡ提取试剂盒提取菌株ＤＮＡꎬ采用引物ＩＴＳ４－Ｒ(５ᶄ－ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴ￣ＧＡＴＡＴＧＣ－３ᶄ)和ＩＴＳ５－１７３７Ｆ(５ᶄ－ＧＧＡＡＧＴＡ￣ＡＡＡＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＧＧ－３ᶄ)扩增北柴胡内生真菌的５.８ＳｒＤＮＡ－ＩＴＳ片段ꎬ扩增体系(５０μＬ):１０ˑＰＣＲｂｕｆｆｅｒ５μＬꎬＭｇＣｌ２(２５ｍｍｏｌ/Ｌ)３μＬꎬｄＮＴＰｓ(２ｍｍｏｌ/Ｌ)４μＬꎬ正向和反向引物(５μｍｏｌ/Ｌ)各２μＬꎬＴａｑ酶(２Ｕ/μＬ)１μＬꎬＤＮＡ模板(１０ｎｇ/μＬ)２μＬꎬ加ｄｄＨ２Ｏ至５０μＬꎮ委托广东美格基因科技有限公司进行测序ꎬ在ＮＣＢＩ网站的Ｇｅｎｂａｎｋ数据库中进行序列比对ꎬ分析内生真菌多样性ꎮ通过ＭＥＧＡ７.０软件中的邻接法(ｎｅｉｇｈ￣ｂｏｒ－ｊｏｉｎｉｎｇｍｅｔｈｏｄｓꎬＮＪ)㊁基于Ｋｉｍｕｒａ２－ｐａｒａｍｅ￣ｔｅｒ距离构建抑菌和促生活性菌株系统发育树ꎬ并以自展法(ｂｏｏｔｓｔｒａｐ)进行检测ꎬ自展次数设为１０００次[１７]ꎮ１.２.３㊀抑菌活性菌株筛选与测试㊀初筛选参考袁林等[１８]的方法进行ꎮ北柴胡内生真菌对细菌指示菌的抑菌活性测试采用琼脂块法ꎬ对真菌指示菌的抑菌活性测试采用平板对峙法ꎮ参考赵龙飞等[１９]的方法采用牛津杯法测定初期筛选的活性强的菌株的发酵培养物上清液抑制能力ꎬ菌株发酵上清液１５０μＬ注入牛津杯中ꎬ每平板放置３个无菌牛津杯ꎬ每菌株设置３个重复ꎮ活性菌株产真菌细胞壁降解酶能力测试:采用平板透明圈法[１４]测试拮抗菌产胶体几丁质酶㊁蛋白酶㊁葡聚糖酶㊁纤维素酶能力ꎬ分别将待测菌株琼脂块放置４种酶测试平板上ꎬ每处理４个重复ꎬ以０.１％刚果红溶液浸渍培养基上表面２０ｍｉｎ后冲洗ꎬ测量透明圈大小ꎮ１.２.４㊀促生菌株筛选与测试㊀ＩＡＡ分泌能力菌株筛选:分泌植物生长素(ＩＡＡ)能力测定所用ＰＣ比色液和Ｓ２比色液的配制参考李振东等[２０]的方法ꎬ北柴胡内生真菌分泌ＩＡＡ能力的定性测定采用Ｓａｌｋｏｗｓｋｉ比色法[２１]ꎮＰＣ比色液显色则表明该菌液ＩＡＡ浓度为低浓度ꎬＳ２比色液显色则为高浓度ꎮ采用标准品绘制两组ＩＡＡ标准曲线进行定量测试ꎬ第一组浓度梯度为２.５㊁５.０㊁７.５㊁１０.０㊁１２.５㊁１５.０ｍｇ/Ｌꎬ第二组浓度梯度为２５㊁５０㊁７５㊁１００㊁１２５㊁１５０ｍｇ/Ｌꎮ各菌株菌液采用相应显色液显色ꎬ在ＯＤ５３０波长条件下使用紫外－可见光分光光度计测量吸光度ꎬ根据标准曲线最终确定其ＩＡＡ分泌量ꎮ溶磷菌株筛选参考王贵生[２２]的方法ꎮ在无机磷筛选平板㊁有机磷筛选平板分别接种各待测菌株ꎬ观察是否有溶磷透明圈产生ꎬ定性测试阳性菌株ꎮ以钼锑抗比色法于无机磷筛选液体培养基和有机磷筛选液体培养基培养的发酵液中测定可溶性磷含量ꎮ潜在固氮能力菌株筛选参考Ｖｉｕａｒ等[２３]的方法ꎬ于阿须贝氏(Ａｓｈｂｙ)培养基固体平板接种各待测菌株ꎬ观察菌株是否生长及产生暗白色光晕ꎬ采用综合元素分析仪测定活性菌株于相应液体培养基发酵液中的可溶性氮含量[２３]ꎮ解钾能力菌株筛选参考于发莲[２４]的方法ꎬ将待测菌株接种于解钾固体培养基平板上ꎬ采用四苯硼酸钾重量法测定活性菌株于相应液体培养基发酵液中的可溶性钾含量ꎮ产铁载体菌株筛选参考雷７８㊀第６期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀杜衎ꎬ等:北柴胡内生真菌分离鉴定及其生防促生活性分析平等[２５]的方法ꎮ以上筛选试验均做４个重复ꎬ定量试验待测菌株接种量为０.１ｍＬ(１０５~１０６ｃｆｕ/ｍＬ)ꎬ培养时间为５ｄꎬ以接种无菌ＰＤＡ培养基琼脂块为空白对照ꎮ１.３㊀数据分析抑菌率(％)＝(对照菌落生长直径－处理菌落生长直径)/对照菌落生长直径ˑ１００ꎻ分离率(％)＝分离内生真菌数/组织块数ˑ１００ꎻ分离频率(％)＝样本中分离到的某种内生真菌数/分离到的总菌株数ˑ１００ꎻ多样性指数(Ｈᶄ)＝－ΣＰｉˑｌｎＰｉꎬ其中Ｐｉ是指特定部位某种真菌的菌株数占分离到真菌菌株总数的比值ꎮ采用ＳＰＳＳ１７.０对试验所得数据进行方差分析ꎬＰ<０.０５表示差异显著ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀内生真菌组织分布从植株的３４５个组织块中共分离得到２７０株菌株ꎬ其中从根㊁茎㊁叶中分别分离到８７㊁１２２㊁６１株内生真菌ꎬ北柴胡内生真菌在茎中的分离率(８４.１４％)与多样性指数(１.３１)最高(表１)ꎮ㊀㊀表１㊀植株内生真菌分离结果组织组织块数内生真菌数分离率(％)属水平物种数多样性指数根１２０８７７２.５０１００.９８茎１４５１２２８４.１４１２１.３１叶８０６１７６.２５８０.７１㊀㊀结合形态学和显微特征ꎬ２７０株菌株共鉴定为１７属(表２)ꎮ从根中共分离得到１０属ꎬ其中青霉属(Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ)与生赤壳属(Ｂｉｏｎｅｃｔｒｉａ)为优势属ꎬ分离频率分别为９.２６％和８.８８％ꎻ茎中内生真菌共１２属ꎬ链格孢属(Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ)和曲霉属(Ａｓ￣ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ)为优势属ꎬ分离频率分别为１０.３７％和１０.００％ꎬ而根中并未分离得到这两属内生真菌ꎮ叶中共分离到８属内生真菌ꎬ青霉属(Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉ￣ｕｍ)和生赤壳属(Ｂｉｏｎｅｃｔｒｉａ)为优势属ꎬ分离频率分别为８.８８％和５.９２％ꎮ内生真菌与北柴胡组织器官长期共存ꎬ共同进化形成一种稳定的共生关系ꎬ内生真菌根㊁茎㊁叶分布具有明显的组织特异性与一定的相似性ꎮ㊀㊀表２㊀根㊁茎㊁叶内生真菌属组成属根菌株数分离频率(％)茎菌株数分离频率(％)叶菌株数分离频率(％)青霉菌属(Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ)２５９.２６８２.９６２４８.８８生赤壳属(Ｂｉｏｎｅｃｔｒｉａ)２４８.８８００１６５.９２链格孢属(Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ)００２８１０.３７６２.２２曲霉属(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ)００２７１０.００３１.１１镰刀菌属(Ｆｕｓａｒｉｕｍ)８２.９６１３４.８１３１.１１木霉属(Ｈｙｐｏｃｒｅａ)７２.５９１２４.４４００单端孢属(Ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｕｍ)００１６５.９２００篮状菌属(Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ)７２.５９６２.２２００鬼伞属(Ｃｏｐｒｉｎｅｌｌｕｓ)７２.５９００４１.４８石座菌属(Ｐｅｔｒｏｍｙｃｅｓ)３１.１１３１.１１００赤霉菌属(Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ)３１.１１２０.７４００蜡蚧霉属(Ｌｅｃａｎｉｃｉｌｌｉｕｍ)００３１.１１００炭疽菌属(Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ)００３１.１１１０.３７亚隔孢壳属(Ｄｉｄｙｍｅｌｌａ)２０.７４００００被孢霉属(Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ)００００４１.４８头束霉属(Ｃｅｐｈａｌｏｔｒｉｃｈｕｍ)１０.３７００００单胞酿酒酵母(Ｋａｚａｃｈｓｔａｎｉａ)００１０.３７００２.２㊀抑菌活性菌株筛选２.２.１㊀初筛选结果㊀结合北柴胡内生真菌形态与显微特征ꎬ挑选出差异较大的５４株代表性菌株进行活性筛选ꎮ结果表明(表３)ꎬ北柴胡内生真菌具有抑菌活性的菌株比例较高ꎬ有４６％的测试菌株对６种指示菌中至少一种病原指示菌表现出抑菌活性ꎬＢＣＲ－０９７㊁ＢＣＲ－０９８㊁ＢＣＲ－４５８㊁ＢＣＳ－４２８㊁ＢＣＳ－５００㊁ＢＣＬ－００９㊁ＢＣＬ－４４９㊁ＢＣＲ－４２７㊁ＢＣＳ－４２０㊁ＢＣＳ－５９１对５种及５种以上指示菌具有抑菌活性ꎬ抑菌谱较广ꎬ其中ＢＣＳ－４２８抑菌活性最高ꎬ对３种细菌指示菌抑菌圈直径达到１６ｍｍ以上ꎬ对两种真菌指示菌抑菌率达到７０％以上ꎮ２.２.２㊀复筛选结果㊀对初筛试验中具有拮抗作用的菌株进行液体发酵并通过离心取上清液进行抑菌活性测试ꎬ结果表明(表４)ꎬ对金黄色葡萄球菌抑菌活性最强的为ＢＣＲ－４５８ꎬ对大肠杆菌㊁铜绿假单胞菌及茄病镰刀菌抑菌活性最强的为ＢＣＳ－４２８ꎬ对层生镰刀菌抑菌活性最强的为ＢＣＬ－４４９ꎬ对尖孢镰刀菌抑菌活性最强的为ＢＣＲ－０９７ꎮ８８㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀㊀㊀表３㊀北柴胡内生真菌抑菌活性筛选结果内生真菌金黄色葡萄球菌大肠杆菌铜绿假单胞菌层生镰刀菌尖孢镰刀菌茄病镰刀菌ＢＣＲ－０９７＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＢＣＲ－０９８＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＢＣＲ－１３７－－－＋＋＋ＢＣＲ－４０３－－－＋＋＋ＢＣＲ－４１０－－－＋＋＋＋＋ＢＣＲ－４２７－＋＋＋＋＋＋＋ＢＣＲ－４５６＋＋－－＋＋＋＋＋＋ＢＣＲ－４５８＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＢＣＳ－１０８－－－＋＋＋＋＋ＢＣＳ－１６９－－－＋＋＋＋＋＋＋＋ＢＣＳ－４１１－－－＋＋＋ＢＣＳ－４２０－＋＋＋＋＋＋＋＋ＢＣＳ－４２１－＋＋＋－－－ＢＣＳ－４２８＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＢＣＳ－４６７－－＋－－－ＢＣＳ－４９４－－－＋＋＋＋ＢＣＳ－４９５－－－－＋＋＋＋ＢＣＳ－５００＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＢＣＳ－５０８－－－＋＋＋＋＋＋ＢＣＳ－５１１－－－＋＋＋＋＋ＢＣＳ－５９１－＋＋＋＋＋＋＋＋ＢＣＬ－００１＋＋－－＋＋＋ＢＣＬ－００７－－－＋＋＋＋＋＋ＢＣＬ－００９＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＢＣＬ－４４９＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋㊀㊀注: ＢＣＲ ㊁ ＢＣＳ ㊁ ＢＣＬ 分别代表北柴胡根㊁茎㊁叶内生真菌ꎬ下同ꎻ＋:抑菌圈直径<１０ｍｍ或抑菌率<５５％ꎬ＋＋:１０ｍｍɤ抑菌圈直径<１６ｍｍ或５５％ɤ抑菌率<７０％ꎬ＋＋＋:抑菌圈直径ȡ１６ｍｍ或抑菌率ȡ７０％ꎬ－:无抑菌活性ꎮ２.２.３㊀产真菌细胞壁降解酶能力测试㊀对初筛具较高抑菌活性的菌株进行产真菌细胞壁降解酶能力测试ꎬ结果(表５)表明ꎬＢＣＲ－０９７㊁ＢＣＲ－０９８㊁ＢＣＲ－４５８㊁ＢＣＳ－４２０㊁ＢＣＳ－５００㊁ＢＣＬ－００９能够产生４种酶ꎬＢＣＲ－０９８产蛋白酶和几丁质酶能力最强ꎬＢＣＳ－５９１产葡聚糖酶能力最强ꎬＢＣＬ－４４９产纤维素酶能力最强ꎮ２.３㊀促生活性菌株筛选２.３.１㊀内生真菌分泌ＩＡＡ能力定性与定量分析㊀通过绘制ＩＡＡ标准曲线(图１)ꎬ得到ＩＡＡ分泌量测定公式为ｙ＝０.０３９３ｘ－０.００５１(Ｒ２＝０.９９４７)和ｙ＝０.０２２４ｘ＋０.０９６０(Ｒ２＝０.９９５６)ꎮ本试验结果表明(表６)ꎬ在５４株测试菌株中ꎬ具有分泌ＩＡＡ能力的菌株共有１８株ꎬ占总测试北柴胡内生菌株的３３％ꎬ其中１１株合成ＩＡＡ为色氨酸途径ꎬＢＣＳ－４９３在没有添加色氨酸和添加色氨酸两种情况下都发生了颜色反应ꎬ证明其可通过两种途径合成ＩＡＡꎮ在所有测试菌株中ＢＣＳ－５９１㊁ＢＣＳ－５００ＩＡＡ分泌量较高ꎬ分别为５９.５５ｍｇ/Ｌ和７６.１６ｍｇ/Ｌꎬ具有较高的植物促生研究价值ꎮ２.３.２㊀内生真菌固氮㊁溶磷㊁解钾㊁产铁载体活性菌株筛选㊀在５４株待测菌株中ꎬ共１２株在解钾固体平板上产生黄色光晕ꎮ对１２株解钾活性菌株进行定量测试ꎬ结果表明(图２Ａ)ꎬ测试菌株ＢＣＲ－５１３与ＢＣＲ－０９８菌液所产可溶性钾含量最高ꎬ相比空白培养液ꎬ增量分别为２６.７６ｍｇ/Ｌ和２０.９０ｍｇ/Ｌꎮ在ＢＣＳ－４２０与ＢＣＳ－４６７菌液培养过程中ꎬ显微镜发现两菌株菌丝能有效吸附钾长石矿粉颗粒形成真菌－矿物聚集体ꎬ产生动态溶㊀㊀表４㊀内生真菌发酵液抑菌活性内生真菌抑菌圈直径(ｍｍ)金黄色葡萄球菌大肠杆菌铜绿假单胞菌层生镰刀菌尖孢镰刀菌茄病镰刀菌ＢＣＲ－０９７１３.３７ʃ０.７２ｅ１１.５５ʃ０.６０ｆ１２.１０ʃ０.９２ｄ１２.７１ʃ２.６４ａｂ１４.５９ʃ１.１４ａ１１.８０ʃ０.４７ｄＢＣＲ－０９８１５.５４ʃ０.５９ｄ１１.６１ʃ１.１０ｆ１０.３５ʃ０.３１ｅ１０.５０ʃ０.３６ｃ１３.７５ʃ０.６１ａｂ１３.１５ʃ１.６０ｂＢＣＲ－４２７ ８.３２ʃ０.４８ｇ８.８９ʃ０.７６ｆ１１.４０ʃ０.８８ｂ１２.３２ʃ１.６９ｃ１１.７０ʃ０.８４ｄＢＣＲ－４５８２３.８８ʃ２.６８ａ１１.３０ʃ１.５５ｄ１５.１６ʃ１.９８ｃ１３.７１ʃ０.９０ａ１２.４３ʃ１.３２ｂｃ１３.０４ʃ０.５９ｂＢＣＳ－４２０ １５.８８ʃ０.２３ｃ１１.８０ʃ１.０９ｄ８.０７ʃ１.６６ｄ９.９５ʃ０.７５ｄ９.１８ʃ０.４３ｅＢＣＳ－４２８２２.２９ʃ２.１４ｂ２２.０９ʃ１.２８ａ２２.０６ʃ１.０４ａ１２.４０ʃ０.５４ａｂ１４.５３ʃ０.３３ａ１５.２２ʃ１.０５ａＢＣＳ－５００１８.９２ʃ０.１６ｃ１６.５７ʃ１.５２ｂ１５.４８ʃ０.９３ｃ１１.４９ʃ０.３１ｂ１３.５６ʃ０.７５ａｂｃ１１.６８ʃ０.７０ｄＢＣＳ－５９１ １４.０８ʃ３.４１ｄ１５.３７ʃ２.３６ｃ８.１５ʃ０.８２ｄ１０.６６ʃ０.５２ｄ８.３８ʃ０.２８ｅＢＣＬ－００９１３.７３ʃ０.５８ｅ１５.００ʃ１.８３ｃｄ１７.５９ʃ２.７４ｂ９.７４ʃ０.８２ｄ１０.８１ʃ０.６９ｄ１１.０５ʃ０.８８ｄＢＣＬ－４４９１５.８７ʃ１.３０ｄ１２.６７ʃ０.２２ｅ９.２８ʃ０.７４ｆ１４.０９ʃ０.８４ａ１２.９１ʃ０.３７ｂｃ１２.１０ʃ０.６２ｃ㊀㊀注:数据为平均值ʃ标准差ꎬ同列不同小写字母表示经Ｄｕｎｃａｎ ｓ新复极差法检验在Ｐ<０.０５水平差异显著ꎬ下同ꎮ９８㊀第６期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀杜衎ꎬ等:北柴胡内生真菌分离鉴定及其生防促生活性分析图１㊀ＩＡＡ分泌量测定标准曲线㊀㊀表５㊀酶解透明圈外径(ｍｍ)内生真菌葡聚糖酶蛋白酶几丁质酶纤维素酶ＢＣＲ－０９７１２.０３ʃ０.７４ｆｇ１２.８１ʃ０.４４ｄ２３.８５ʃ０.５９ｂ１０.４１ʃ０.３６ｄｅＢＣＲ－０９８１１.４４ʃ０.７５ｆｇ１６.７２ʃ０.１６ａ２６.７２ʃ０.２１ａ８.５９ʃ０.６７ｆＢＣＲ－４２７１６.７７ʃ２.１７ｄｅ１０.３９ʃ０.１３ｆ ９.５１ʃ０.６２ｅｆＢＣＲ－４５８８.８５ʃ０.４４ｇ１３.０６ʃ０.３９ｃｄ７.９７ʃ０.１４ｇ１６.１８ʃ１.１６ｂＢＣＳ－４２０１９.４１ʃ２.４７ｃｄ１５.９２ʃ１.８９ａｂ１０.４８ʃ０.８６ｆ１０.９３ʃ０.１４ｄｅＢＣＳ－４２８２２.６７ʃ１.７７ｂ １３.８８ʃ０.８８ｅ９.９７ʃ０.８７ｄｅｆＢＣＳ－５００１１.４６ʃ０.６８ｆｇ１１.１７ʃ０.０１ｅｆ１７.１３ʃ０.４２ｄ１４.２７ʃ０.３８ｃＢＣＳ－５９１２７.７５ʃ１.４０ａ１５.１１ʃ１.８４ｂ ８.４８ʃ０.５９ｆＢＣＬ－００９１５.５９ʃ０.７６ｅ１４.４１ʃ０.５３ｂｃ２１.４４ʃ０.４５ｃ１１.１７ʃ１.０２ｄＢＣＬ－４４９２１.８２ʃ２.５３ｂｃ １８.５９ʃ０.０２ａ㊀㊀表６㊀内生真菌ＩＡＡ分泌定性与定量筛选结果内生真菌生物合成途径颜色反应吸光度ＩＡＡ含量(ｍｇ/Ｌ)ＢＣＲ－４０８色氨酸粉红色０.７１０１８.１９ＢＣＲ－４５３色氨酸浅粉红色１.０２０４１.２５ＢＣＲ－４５８色氨酸浅粉红色０.４５９１１.８１ＢＣＳ－１６９色氨酸浅粉色０.２１２５.５２ＢＣＳ－４１１非色氨酸浅紫红色０.５７０２１.１６ＢＣＳ－４２８色氨酸浅粉红色１.１１０４５.２７ＢＣＳ－４９１非色氨酸浅粉色０.１６３４.２８ＢＣＳ－４９３色氨酸/非色氨酸浅粉色０.１６５４.３３ＢＣＳ－４９５非色氨酸浅粉色０.２０２５.２７ＢＣＳ－５００色氨酸紫红色１.８０２７６.１６ＢＣＳ－５０２非色氨酸浅粉红色０.２６８６.９５ＢＣＳ－５０８色氨酸浅粉红色０.３７１９.５７ＢＣＳ－５１１非色氨酸浅粉色０.２６０６.７５ＢＣＳ－５５２色氨酸紫红色０.５４０１３.８７ＢＣＳ－５９１色氨酸深紫红色１.４３０５９.５５ＢＣＬ－００４非色氨酸浅粉色０.１３４３.５４ＢＣＬ－００８色氨酸浅粉色０.１６９４.４３ＢＣＬ－１９７色氨酸浅粉色０.１４６３.８４解－吸收过程[２６]ꎬ当菌株吸收量大于溶解量时导致菌液中可溶性钾含量反而低于空白菌液ꎬ这种现象在固氮与溶磷菌株定量测试过程中也被发现ꎮ共９株测试菌株在阿须贝氏(Ａｓｈｂｙ)培养基上生长并产生暗色圈ꎬ显示出固氮活性ꎬ其ＢＣＳ－４６７㊁ＢＣＳ－５００与ＢＣＬ－４４９在定量测试过程中菌液可溶性氮含量增加量较高ꎬ具有较强的固氮活性ꎬ其中ＢＣＬ－４４９增量最高ꎬ为１１１.５１ｍｇ/Ｌ(图２Ｂ)ꎮ共８株菌株在无机磷筛选固体平板和有机磷筛选固体平板上产生透明圈ꎬＢＣＳ－４２０㊁ＢＣＲ－５１３与ＢＣＲ－４２７在溶解无机磷活性筛选定量测试中菌液可溶性磷含量增加量较高ꎬ具有较强的无机磷溶解活性ꎬ其中ＢＣＳ－４２０较空白培养液增量最大ꎬ为５５.７９ｍｇ/ＬꎮＢＣＲ－４２７㊁ＢＣＲ－５１３㊁ＢＣＳ－４２０㊁ＢＣＬ－４３６与ＢＣＬ－４４９在溶解有机磷活性筛选定量测试中菌液可溶性磷含量增量较大ꎬ具有较强的有机磷溶解活性ꎬ其中ＢＣＲ－４２７较空白培养液增量最大ꎬ为７２.１８ｍｇ/Ｌ(图２Ｃ)ꎮ共１０株待测真菌在ＣＡＳ平板上产生橙黄色光晕即噬铁圈ꎬ其中ＢＣＳ－４２０㊁ＢＣＬ－００９㊁ＢＣＬ－４９９噬铁圈直径较大ꎬ分别为２３.５０㊁２４.８８ｍｍ及２４.５６ｍｍꎬ具有较高产铁载体活性(图２Ｄ)ꎮ２.４㊀分子鉴定及系统进化分析综合抑菌活性及促生活性筛选结果ꎬ将高活性菌株５.８ＳｒＤＮＡ－ＩＴＳ扩增片段在ＮＣＢＩ网站ＧｅｎＢａｎｋ数据库中进行序列比对ꎬ主要功能菌株鉴定结果如表７所示ꎬ挑选出吻合度超过９９％的序列构建系统发育树(图３)ꎮ活性菌株根据组群亲缘关系可以将除去Ｃｏｐｒｉｎｕｓａｒａｃｈｎｏｉｄｅｕｓ及Ｃｏｐｒｉｎｅｌｌｕｓｘａｎｔｈｏｔｈｒｉｘ剩余的菌株分成３个种群ꎬ自检支持率分别为３０％㊁８１％和５４％ꎮ０９㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀图２㊀北柴胡内生真菌解钾(Ａ)㊁固氮(Ｂ)㊁溶磷(Ｃ)㊁产铁载体(Ｄ)活性测定１９㊀第６期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀杜衎ꎬ等:北柴胡内生真菌分离鉴定及其生防促生活性分析Ｌｅｃａｎｉｃｉｌｌｉｕｍａｐｈａｎｏｃｌａｄｉｉ:丝枝蜡蚧霉菌ꎻＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ:产紫青霉ꎻＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａｇｌｏｂａｌｐｉｎａ:球形孢霉ꎻＣｏｐｒｉｎｅｌｌｕｓｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ:家园小鬼伞菌ꎻＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓａｃｕｌｅａｔｕｓ:棘孢曲霉ꎻＦｕｓａｒｉｕｍｋｅｒａｔｏｐｌａｓｔｉｃｕｍ:角化镰刀菌ꎻＣｏｐｒｉｎｅｌｌｕｓｘａｎｔｈｏｔｈｒｉｘ:庭院小鬼伞菌ꎮ图３㊀基于５.８ＳｒＤＮＡ－ＩＴＳ序列由邻近法构建的系统发育树㊀㊀表７㊀主要功能菌株鉴定结果菌株编号属种ＧｅｎＢａｎｋ登录号ＢＣＲ－０９７镰刀菌属(Ｆｕｓａｒｉｕｍ)茄腐镰刀菌(Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉ)ＯＮ７４０９１２.１ＢＣＲ－０９８鬼伞属(Ｃｏｐｒｉｎｅｌｌｕｓ)辐毛小鬼伞菌(Ｃｏｐｒｉｎｅｌｌｕｓｒａｄｉａｎｓ)ＯＮ７４０９１６.１ＢＣＲ－４２７丝枝霉属(Ａｐｈａｎｏｃｌａｄｉｕｍ)ＡｐｈａｎｏｃｌａｄｉｕｍａｒａｎｅａｒｕｍＯＮ７４０９４０.１ＢＣＲ－４５８木霉属(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ)哈茨木霉(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍ)ＯＮ７４０６７９.１ＢＣＲ－５１３篮状菌属(Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ)嗜松篮状菌(Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓｐｉｎｏｐｈｉｌｕｓ)ＯＮ７４０６８１.１ＢＣＳ－４２０篮状菌属(Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ)细疣篮状菌(Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓｕｓ)ＯＮ７４０６８２.１ＢＣＳ－４２８木霉属(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ)深绿木霉(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ)ＯＮ７４０６８０.１ＢＣＳ－５００青霉属(Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ)草酸青霉(Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｏｘａｌｉｃｕｍ)ＯＮ７４０６８３.１ＢＣＳ－５９１镰刀菌属(Ｆｕｓａｒｉｕｍ)尖孢镰刀菌(Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍ)ＯＮ７４０９５２.１ＢＣＬ－００９被孢霉属(Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ)高山被孢霉(Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａａｌｐｉｎａ)ＯＮ７４０９４６.１ＢＣＬ－４４９鬼伞属(Ｃｏｐｒｉｎｅｌｌｕｓ)林生小鬼伞菌(Ｃｏｐｒｉｎｅｌｌｕｓｓｉｌｖａｔｉｃｕｓ)ＯＲ０８４１３１.１３㊀讨论与结论内生真菌一般存在于药用植物组织和器官中ꎬ具有产生植物生长调节剂类物质㊁提高宿主植物生理活性和抗逆性等功能ꎬ在植物生长发育中发挥重要作用[２７]ꎮ本研究从大田栽培北柴胡根㊁茎㊁叶中分离得到２７０株内生真菌ꎬ青霉属(Ｐｅｎｉ￣ｃｉｌｌｉｕｍ)与生赤壳属(Ｂｉｏｎｅｃｔｒｉａ)为根㊁叶部内生真菌优势属ꎬ链格孢属(Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ)和曲霉属(Ａｓｐｅｒ￣ｇｉｌｌｕｓ)为茎部内生真菌优势属ꎬ这与野生柴胡内生真菌根㊁茎㊁叶内生真菌分布具有一定的差异性[２８]ꎮ２９㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀内生真菌分布不仅受宿主种类的影响ꎬ表现出宿主的特异性和组织的特异性ꎬ还受宿主植物生长环境㊁生长年限㊁生长阶段等因素的影响[２９ꎬ３０]ꎮ如石斛内生真菌丰富度随石斛生长年限的增加而增加ꎬ不同地区的丹参内生真菌群落具有显著差异[３１ꎬ３２]ꎻ单叶蔓荆在沿海地区内生真菌腐生菌丰富度较大ꎬ这种变化能促进宿主在沙子掩埋期间增加营养吸收[３３]ꎻＭａｒｔｉｎ等[３４]发现从自然发生病害的植物系统中更容易发现有效生防与促生作用菌株ꎻ内生真菌与宿主植物属于长期协同进化的共生关系ꎬ当宿主植物受到环境应激时ꎬ释放信号类似物可吸引某种微生物ꎮ在制备内生真菌分离菌株材料时ꎬ可以以目标活性为导向选择或制造特定的应激环境ꎮ北柴胡栽培生长过程中易感染多种疾病ꎬ尤以根腐病最为严重[３５]ꎮ研究发现非致病性的尖孢镰刀菌是天然真菌拮抗剂ꎬ也是潜在的生物防治剂ꎬ其释放的挥发性物质β－Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｅｎｅ经研究证明具有促进植物生长的作用[３６ꎬ３７]ꎮ茄腐镰刀菌代谢产生的多糖类物质是发挥抑菌性作用的物质基础ꎬ接种茄腐镰刀菌的番茄对病原微生物的防御作用明显增强[３８ꎬ３９]ꎬ其发酵产物具有作为生物技术应用的拮抗剂和抗菌剂的潜力ꎮ本研究中ＢＣＲ－０９７(茄腐镰刀菌)表现出较强抑菌活性ꎬＢＣＳ－５９１(尖孢镰刀菌)则同时表现出较强的ＩＡＡ分泌活性ꎬ这与以上研究存在相同点ꎮ产生ＩＡＡ等植物生长激素和促进植物对氮㊁磷等营养元素的吸收是内生真菌促进植物生长主要作用方式[４０]ꎮ深绿木霉与哈茨木霉已被证明除生防作用外也具有较高促生活性ꎬ被广泛用于生物菌肥的开发[４１]ꎬ但作为北柴胡内生菌ꎬ哈茨木霉与深绿木霉与北柴胡之间的作用机制仍值得进一步探索ꎮ本研究中ＢＣＳ－５００(草酸青霉)㊁ＢＣＲ－５１３(嗜松篮状菌)㊁ＢＣＲ－０９８(辐毛小鬼伞菌)等表现出较强的促生活性ꎮ有研究证明草酸青霉可显著提高水稻的抗旱能力[４２]ꎮ嗜松篮状菌具有产生β－葡聚糖酶㊁几丁质酶㊁铁载体及吲哚乙酸等活性ꎬ是近年来除木霉属真菌可用作生物增强剂的新型真菌[４３]ꎮ研究证明Ｃｏｐｒｉｎｅｌｌｕｓｒａｄｉａｎｓ可有效降解邻苯二甲酸二丁酯及邻苯二甲酸二辛酯ꎬ可对污染土壤进行修复[４４]ꎮ综上ꎬ开发本研究中内生真菌用于北柴胡生物菌肥具有巨大潜力ꎮ目前植物内生真菌用于农业生产仍面临诸多挑战ꎬ主要表现在微生物接种剂持久性短㊁适用面窄㊁波动性大等ꎬ而栽培管理措施㊁土壤条件㊁本土微生物菌落的拮抗作用都会对微生物接种剂效果产生影响[４５]ꎮ下一步应加强待开发菌株宿主相关昆虫影响的研究㊁组合不同优良菌株等措施进一步提高菌株开发水平和田间作用效果ꎮ参㊀考㊀文㊀献:[１]㊀ＫｕｏＪꎬＣｈａｎｇＣＦꎬＣｈｉＷＣ.ＩｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｆｕｎｇｉｗｉｔｈａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙｆｒｏｍｍｅｄｉｃｉｎａｌｐｌａｎｔＺａｎｔｈｏｘｙｌｕｍｓｉｍｕ￣ｌａｎｓＨａｎｃｅ[Ｊ].ＦｏｌｉａＭｉｃｒｏｂｉｏｌ.(Ｐｒａｈａ)ꎬ２０２１ꎬ６６(３):３８５－３９７.[２]㊀ＣｏｓｏｖｅａｎｕＡꎬＣａｂｒｅｒａＲ.ＥｎｄｏｐｈｙｔｉｃｆｕｎｇｉｉｎｓｐｅｃｉｅｓｏｆＡｒｔｅ￣ｍｉｓｉａ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＦｕｎｇｉꎬ２０１８ꎬ４(２):５３. [３]㊀ＩｋｒａｍＭꎬＡｌｉＮꎬＪａｎＧꎬｅｔａｌ.Ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｆｕｎｇａｌｄｉｖｅｒｓｉｔｙａｎｄｔｈｅｉｒｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｗｉｔｈｐｌａｎｔｓｆｏｒａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅｓｕｓｔａｉｎａｂｉｌｉｔｙｕｎｄｅｒｓｔｒｅｓｓｆｕｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎ[Ｊ].ＲｅｃｅｎｔＰａｔ.ＦｏｏｄＮｕｔｒ.Ａｇｒｉｃ.ꎬ２０２０ꎬ１１(２):１１５－１２３.[４]㊀谭小明ꎬ周雅琴ꎬ陈娟ꎬ等.药用植物内生真菌多样性研究进展[Ｊ].中国药学杂志ꎬ２０１５ꎬ５０(１８):１５６３－１５８０. [５]㊀ＣｈｅｎＨＭꎬＱｉＹꎬＨｅＸＹꎬｅｔａｌ.ＥｎｄｏｐｈｙｔｉｃｆｕｎｇｕｓＭｕｃｏｒｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓＤＦ２０ｐｒｏｍｏｔｅｔａｎｓｈｉｎｏｎｅｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄａｃｃｕ￣ｍｕｌａｔｉｏｎｉｎＳａｌｖｉａｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａｒｏｏｔ[Ｊ].ＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅꎬ２０２１ꎬ３０７:１１０８９８.[６]㊀ＳｃｈｍｉｄｔＣＳꎬＭｒｎｋａＬꎬＦｒａｎｔíｋＴꎬｅｔａｌ.Ｐｌａｎｔｇｒｏｗｔｈｐｒｏｍｏ￣ｔｉｏｎｏｆＭｉｓｃａｎｔｈｕｓˑｇｉｇａｎｔｅｕｓｂｙｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｂａｃｔｅｒｉａａｎｄｆｕｎｇｉｏｎｎｏｎ￣ｐｏｌｌｕｔｅｄａｎｄｐｏｌｌｕｔｅｄｓｏｉｌｓ[Ｊ].ＷｏｒｌｄＪ.Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.Ｂｉｏ￣ｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２０１８ꎬ３４(３):４８.[７]㊀王海霞ꎬ郑成忠ꎬ东保柱ꎬ等.燕麦内生细菌ＹＮ－Ｊ３的分离鉴定及防病促生作用研究[Ｊ].中国生物防治学报ꎬ２０２２ꎬ３８(２):４４７－４５７.[８]㊀蔡华ꎬ雷攀ꎬ杜士明ꎬ等.柴胡制剂的开发利用研究进展[Ｊ].中国药师ꎬ２０１５ꎬ１８(１１):１９６３－１９６６. 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