水产品中微囊藻毒素的测定-编制说明

分析检测固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法同时测定海产品中微囊藻毒素和鱼腥藻毒素吕晓静，鞠光秀，曲　欣，汪　勇，于红卫*（1.青岛市疾病预防控制中心/青岛市预防医学研究院，山东青岛 266033；2.岛津企业管理（中国）有限公司，北京 100020）摘 要：目的：建立固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法同时测定海产品中7种微囊藻毒素和2种鱼腥藻毒素的方法。

方法：样品经80%乙腈提取，HLB小柱净化后，采用MRM模式进行分析，外标法定量。

结果：7种微囊藻毒素和2种鱼腥藻毒素在0.5～50.0 μg·L-1范围内线性关系良好，检出限为0.3 μg·kg-1，回收率为75.5%～98.8%，相对标准偏差在1.5%～5.4%。

结论：该方法重现性较好、灵敏度高、成本低，可以实现海产品中的鱼腥藻毒素和微囊藻毒素的同时检测。

关键词：微囊藻毒素；鱼腥藻毒素；固相萃取（SPE）；高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）Simultaneous Determination of Microcystins and Anatoxins in Marine Products by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry with SolidPhase ExtractionLYU Xiaojing, JU Guangxiu, QU Xin, WANG Yong, YU Hongwei*(1.Qingdao Municipal Center For Disease Control & Prevention/Qingdao Institute of Preventive Medicine, Qingdao266033, China; 2.Shimadzu (China) Co., Ltd., Beijing Branch, Beijing 100020, China) Abstract: Objective: A method for simultaneous determination of 7 microcystins (MCs) and 2 Anatoxins (AnTXs) in marine products was achieved by solid phase extraction (SPE)-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS). Method: The sample was extracted with 80% acetonitrile, purified by HLB small column, analyzed using MRM mode, and quantified using external standard method. Result: The linear ranges for 7 MCs and 2 AnTXs were 0.5～50.0 μg·L-1. The limits of detection were 0.3 μg·kg-1. The recoveries of the 7 MCs and 2 AnTXs spiked in blank marine products ranged from 75.5% to 98.8% with the relative deviations of 1.5%～5.4%. Conclusion: The method has the advantages of good reproducibility, high sensitivity and low cost, and can achieve simultaneous detection of fishy algae toxins and microcystins in seafood.Keywords: microcystin; anatoxin; solid phase extraction (SPE); high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS)微囊藻毒素（Microcystins，MCs）和鱼腥藻毒素（Anatoxins，AnTXs）是两种典型的蓝细菌毒素[1]。

关于微囊藻毒素的调查与分析--食品安全与卫生论文我们每个人，每天都需要依靠食物来提供能量继续生存下去，甚至于世界上所有生命都需要食物，而且每一刻都在某个地方存在进食的现象，俗话也说“民以食为天”。

所以，食物，在整个社会历史发展中都是尤为重要的，自然而然的，食品安全与卫生检测就是攸关生死的大事了，对于食物中所含毒素的研究，也显得尤为重要了。

通过学习这门通识课，我学到很多，也发现其中乐趣之多，感到这门课非常值得学习。

既然我是水产学院的一员，相对而言就对水产品更为熟悉，所以就选择调查分析一些常见的食品鱼类所含毒素。

作为满足人类食物要求的重要产业，淡水水产养殖业在不断扩大规模的同时，也给养殖区域的水环境带来严重后果。

2001年7、11月有人对太湖水域进行调查，发现次生代谢产物——微囊藻毒素MC对水体环境和人类健康构成巨大威胁。

采自太湖的28尾淡水鱼体内均检出MC，其中，肝脏中MC含量远远高于肌肉中含量。

肝脏中含量最高的是鲤鱼、鲢鱼和鳙鱼，肌肉中最高的是鲢鱼和鳙鱼。

间接证明我国局部地区人群肝功能损害，甚至肝癌的高发可能与当地的水源、食品鱼类有密切关系。

微囊藻毒素是由蓝藻水华，如固氮的鱼腥藻、束丝藻、拟柱胞藻、胶刺藻和节球藻等暴发所产生的一种肝毒素，它对蛋白磷酸酶1 和蛋白磷酸酶2A 具有抑制作用，因此与肿瘤促进作用有直接关系。

微囊藻毒素为七肽单环肝毒素，结构中存在着环状结构和间隔双键，因而具有相当的稳定性。

它能够强烈抑制蛋白磷酸酶的活性，当细胞破裂或衰老时毒素释放进入水中，同时它还是强烈的肝脏肿瘤促进剂。

MC具有水溶性和耐热性，易溶于水，甲醇或丙酮，不挥发，抗pH 变化。

化学性质相当稳定，自然降解过程十分缓慢。

1996年巴西一透析中心因透析液遭MC污染最终导致53人死亡。

流行病学调查显示，饮用水源中微囊藻毒素是中国南方一些地区原发性肝癌发病率高的主要原因之一。

对江西鄱阳湖的调查显示，水体微囊藻毒素最大为1 036. 9pg·ml-1，同时发现鱼体内有毒素积累。

=技术与方法>超高效液相色谱-串联质谱法测定水体中微囊藻毒素张晓梅,张竹青,黄文鹏 (吉林省环境监测中心站,吉林 长春 130011)=摘 要> 目的 建立测定水体中微囊藻毒素的超高效液相色谱-串联质谱分析方法。

方法 通过固相萃取富集净化,采用超高效液相色谱-串联质谱测定水中微囊藻毒素-LR 。

结果 该方法检出限为0104L g/L ;线性定量范围为10~1000L g/L ,平均回收率为97120%,平均相对标准偏差为4171%。

结论 本文建立的超高效液相色谱-串联质谱法为水质微囊藻毒素监测提供了一种快速、准确、灵敏的分析方法。

=关键词> 微囊藻毒素;固相萃取;超高效液相色谱-质谱1中图分类号2 R 12311 1文献标识码2 A 1文章编号2 167124199(2010)0320223203De term i na tion of M icr ocystins inW a ter by U ltr a H igh P er form an ce L i qu i d Ch ro m a togr aphy -M a ss Spectro m etry Z HA NG Xia o -mei ,ZHA NG Zhu -qing,HU A NG Wen -peng 1J ili n P rovincia l Environ m enta l m o n itoring Center Sta ti on ,Changchun J ilin 130011,China=Abstr a ct >Ob jec ti ve To establi sh a m ethod for m i c rocystins in water by u ltra-h i gh perfor m ance liqu i d chro m atog 2raphy -tandem m ass spectro m etry 1M e thods U ltra h i gh pe rf or m ance li qu i d chro ma to graphy-m ass spectro m e try co m bi 2n i ng with solid phase extracti on has been emp l oyed to enhance the accuracy in the deter m i natio n of m i c rocystins ,such as m icrocysti n-LR 1R esults The de tecti on li m its was 0104L g/L ,t he li near range was 10-1000L g /L ,average recovery rate was 97120%,average RS D was 4171%1C onc l u sion The resu lts sho w that the rapid ,accurate and sensiti ve me t hod is su itab l e for ana l yzing and mon itoring m i crocysti ns i n wate r 1=K ey word s > M icrocysti ns ;Soli d phase extractio n ;U ltra h i gh perfor m ance liqu i d chro m atography-m ass spectro m 2etry作者简介:张晓梅(1963-),女,吉林长春人,本科,高级工程师,研究方向:环境监测。

水中低含量微囊藻毒素（RR）高效液相色谱法检测摘要：本文用高效液相色谱法检测水中微囊藻毒素（RR），针对水中微囊藻毒素含量低，难检出问题，对常规高效液相色谱做了两种优化改进，在线富集进样、大定量进样，大大降低检出限，获得满意的结果。

关键词液相色谱在线富集大定量进样微囊藻毒素检出限前言微囊藻毒素（RR）具有较强的毒性及危害性。

随着中国水体富营养化程度加剧，蓝藻水华和赤潮的发生逐渐增加。

80%的蓝藻水华都可以检测出次生代谢产物----微囊藻毒素（microcystins，MCs），它对水体环境和人群健康的危害已成为全球关注的重大环境问题之一。

环境改善，检测、防控和治理是必不可少的工作内容。

本文主要介绍水中低含量微囊藻毒素（RR）的检测方法。

本方法检出限低或超低，主要针对水中低含量微囊藻毒素（RR）高效液相色谱法检测，适用于饮用水、湖泊水、河水、地表水等水样检测。

本方法参考《GB/T 5750.8-2006 生活饮用水标准检验方法有机物指标》中第13部分微囊藻毒素，优化出两种检测方案。

实验部分1 方案一：在线富集高效液相色谱法检测。

图1 在线富集高效液相色谱法检测流程图1.1 仪器配置：高压输液泵2台，在线脱气机（两路以上脱气）1台，六通自动进样阀2个（1个带2ml定量环1套，一个带富集柱1根），预柱1根，色谱柱1根，柱温箱1台，紫外检测器1台，三通电磁阀1个，进样泵（或高效液相色谱自动进样器）1台，工作站1套，配件1套（包括废液桶、管路、接头等）。

1.2 色谱条件：色谱柱：ODS C18色谱柱，Venusil XBP (L) 4.6mm×150mm×5μm流动相：流动相A（色谱洗脱液）：乙腈：水：三氟乙酸=40%：60%：0.05%流动相B（富集液）：甲醇（或乙腈）：水=15%：85%进样体积：2ml流速：1ml/min检测器：紫外检测器检测波长：238nm柱温：35℃1.3 试验对比（进样量相同，进样体积不同）：直接进样20μl，标准样品浓度20ng/ml，色谱图情况图2 微囊藻毒素（RR）标准样品浓度20ng/ml色谱图该检测方法噪声约3.6μAu，样品峰高32μAu，标准样品浓度20ng/ml，按3倍噪声计算检出限，检出限约6.75 ng/ml。

固相萃取高效液相色谱法测定水中痕量微囊藻毒素分析化学(FENXIHUAXUE) 研究报告第5期2022年5月ChineseJournalofAnalyticalChemistry522～525第29卷固相萃取高效液相色谱法测定水中痕量微囊藻毒素张维昊徐小清3(中国科学院水生生物研究所,武汉430072)μg/L,线性定量范围为0.1～50μg/L。

应用该法分析了天然水样,关键词微囊藻毒素,固相萃取,高效液相色谱1 引言(harmfulalgalbloom,HAB)的频繁1。

微囊藻毒素(microcystins,MC)即为有害的蓝藻水华释放的,已发现60多种异构体。

蓝藻水华及其毒素已列为微生物和有机污染2〕物的检测工程〔。

并已有国家推荐水中微囊藻毒素的平安浓度为1μg/L。

我国自80年代就对微囊藻3〕毒素的毒性做过研究〔,而对于水体中微囊藻毒素的检测,由于含量低、干扰大,目前还未有可靠的定性3～9〕和定量检测方法的报道。

本文在综合国外文献〔的根底上,结合国情,建立了固相萃取(SPE)高效液相色谱(HPLC)检测水环境中痕量藻毒素的分析方法,并用于实际样品分析,取得满意结果。

2 实验局部2.1 仪器和试剂LC2890A型高效液相色谱仪(北京星达技术公司),配有S23702型紫外2可见光检测器(日本相马公司),LC2850型柱室恒温箱;色谱数据工作站,HypersilBDSC18分析色谱柱(4.6×250mm,5μm),C18保护预柱,C18固相萃取柱(100g/L)均为中国科学院大连化学物理研究所提供。

μm混合纤维素酯微孔滤膜μm针头过滤器。

微囊藻毒素标样为MC2LR,MC2RR(Sigma公司),三氟乙酸(化学纯,上海化学试剂公司),甲醇(色谱纯,上海化学试剂研究所),双蒸水。

2.2 色谱分析条件流动相为含0.1%三氟乙酸的水溶液∶甲醇=30∶70(V/V),流速1mL/min,进样量10μL,色谱柱恒温箱设为25℃,紫外检测波长为238nm,实验依据保存时间定性,外标法定量。

《生活饮用水卫生标准》GB5749- 项目解读微囊藻毒素(1)1 概述微囊藻毒素藻毒素主要的结构特征为N-甲基脱氢丙氨酸及两个L-氮基酸残基x和Z,根据1988年制定的微囊藻毒素(Microcystins或MCYST)命名法规定．x,Z二残基的不同组合由代表氨基酸的字母后缀区分。

常见的有LR，RR，YR三种毒素,L，R,Y分别代表亮氨酸，精氨酸，酪氨酸。

微囊藻毒素的一般结构为环(D-丙氨酸-L-X-赤-β-甲基-D-异天冬氨酸-L-Z—Adda-D-异谷氨酸-N-甲基脱氢丙氨酸)，其中Adda(3氨基9-甲氨基2，6，8-三甲基10-苯基-4，6-二烯酸)是微囊藻毒素生物活性表达所必须的。

已证实微囊藻毒素是一种肝毒素，能抑制蛋白质磷酸酯酶，从而帮助解除对细胞增殖的正常的制动作用，促进肿瘤的发育。

微囊藻毒素虽然主要存在于藻细胞中．但研究表明藻细胞死亡解体后·不断有藻毒素释放到水体，对人类的饮用水源造成危害，已证明某些地区的肝癌高发率与饮用水源中的水华大量发生有关。

微囊藻毒素是一类具生物活性的单环七肽，这类毒素主要由淡水藻类铜绿微囊藻(Microcystins aeruginosa)产生，此外其他种类的微囊藻，如绿色微囊藻(M．viridis)、惠氏微囊藻(M．wesenbergii)以及鱼腥藻(Anabaena)、念珠藻(Nostoc)、颤藻(Oscillatoria)的一些种或株系也能产生这类毒素。

目前所检测到的微囊藻毒素异构体已超过50多种。

微囊藻毒素有不同的脂多糖和极性．毒性也不同，微囊藻毒素-LR是最早被阐明化学结构的藻毒素．在对藻毒素的研究中也多以它作为研究对象。

它是一个环状的7肽分子，分子量约为1000道尔顿，许多国家出现的由藻毒素引发的事件大都与微囊藻毒素-LR有关。

2 分析方法测量水体中微囊藻毒素的总量(包括所有种类，而非仅仅微囊藻毒素-LR)是很重要的。

酶联免疫法(ELISA)是一种灵敏度很高适合微囊藻毒素的检测方法。