水中微囊藻毒素的测定

微囊藻毒素的荧光定量 PCR检测法摘要：荧光定量 PCR检测方法具有灵敏度高、精确度高、检测范围宽、重复性好优势，本文就其方法对水体中的微囊藻进行检测。

关键词：荧光定量PCR；微囊藻毒素；检测随着我国工农业的迅猛发展以及城市化进程的加快，生活污水、工业废水中污染物的排放量日益增加，环境污染越来越严重，造成水体富营养化及污染日益严重。

水中过量的氮、磷等营养性物质，使水中蓝藻等藻类过渡繁殖，蓝藻水华暴发频繁。

藻类水华爆发严重威胁城市水源水安全。

因此，及时监测城市源水蓝藻发生情况，对保证城市供水安全具有重要意义。

蓝藻监测，传统的方法主要通过显微镜镜检法，对水体中的藻细胞计数及分类，后来又有通过藻类的16S rDNA 序列分析进行藻种分类，然而这些方法不能区分产毒微囊藻及非产毒微囊藻，并在蓝藻暴发之前对其进行准确预测。

实时荧光定量PCR（Real- time fluorescence quantitative PCR，qPCR）方法是一种特异性强、敏感性高、准确性好的分子检测方法，已被用于产毒微囊藻的监测。

微囊藻毒素由一些藻毒素合成酶基因簇控制，该基因簇由 mcyA～mcyJ等10个基因构成。

通过检测微囊藻毒素的产毒基因 mcyA mcyBmcyD 可以用于监测水体中的产毒微囊藻细胞。

mcyE 基因可以用于设计种特异性引物，用于监测水体中的产生微囊藻毒素的不同产毒藻种。

Ouahid 等利用 mcyE 等藻毒素合成酶基因监测水体中的产毒微囊藻［5］。

Al- Tebrineh 等利用 mcyE 和 ndaF 基因设计的实时荧光定量 PCR 方法，同时监测水体中的不同微囊藻毒素产毒藻种［3］。

由于不同水域环境中水体的产毒微囊藻的种类及分布不同，本文利用荧光定量 PCR技术，对水体中的微囊藻进行检测。

1 材料与方法1.1 藻种来源和培养条件实验用藻种购买于中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库，藻种编号为鱼腥藻（Anabaena sp）FACHB-82水华束丝藻（ Aphanizomenon flos-aque）FACHB-1039铜绿微囊藻FACHB-315柱胞鱼腥藻（Ana-baena cylindrica）FACHB-170 席藻（Phormidium sp.）FACHB- 1099 水华束丝藻 FACHB- 245 颤藻（Oscillatoriasp．）FACHB- 1053，于 BG- 11 培养基中扩大培养，颤藻 FACHB-528在 SE培养基中扩大培养。

=技术与方法>超高效液相色谱-串联质谱法测定水体中微囊藻毒素张晓梅,张竹青,黄文鹏 (吉林省环境监测中心站,吉林 长春 130011)=摘 要> 目的 建立测定水体中微囊藻毒素的超高效液相色谱-串联质谱分析方法。

方法 通过固相萃取富集净化,采用超高效液相色谱-串联质谱测定水中微囊藻毒素-LR 。

结果 该方法检出限为0104L g/L ;线性定量范围为10~1000L g/L ,平均回收率为97120%,平均相对标准偏差为4171%。

结论 本文建立的超高效液相色谱-串联质谱法为水质微囊藻毒素监测提供了一种快速、准确、灵敏的分析方法。

=关键词> 微囊藻毒素;固相萃取;超高效液相色谱-质谱1中图分类号2 R 12311 1文献标识码2 A 1文章编号2 167124199(2010)0320223203De term i na tion of M icr ocystins inW a ter by U ltr a H igh P er form an ce L i qu i d Ch ro m a togr aphy -M a ss Spectro m etry Z HA NG Xia o -mei ,ZHA NG Zhu -qing,HU A NG Wen -peng 1J ili n P rovincia l Environ m enta l m o n itoring Center Sta ti on ,Changchun J ilin 130011,China=Abstr a ct >Ob jec ti ve To establi sh a m ethod for m i c rocystins in water by u ltra-h i gh perfor m ance liqu i d chro m atog 2raphy -tandem m ass spectro m etry 1M e thods U ltra h i gh pe rf or m ance li qu i d chro ma to graphy-m ass spectro m e try co m bi 2n i ng with solid phase extracti on has been emp l oyed to enhance the accuracy in the deter m i natio n of m i c rocystins ,such as m icrocysti n-LR 1R esults The de tecti on li m its was 0104L g/L ,t he li near range was 10-1000L g /L ,average recovery rate was 97120%,average RS D was 4171%1C onc l u sion The resu lts sho w that the rapid ,accurate and sensiti ve me t hod is su itab l e for ana l yzing and mon itoring m i crocysti ns i n wate r 1=K ey word s > M icrocysti ns ;Soli d phase extractio n ;U ltra h i gh perfor m ance liqu i d chro m atography-m ass spectro m 2etry作者简介:张晓梅(1963-),女,吉林长春人,本科,高级工程师,研究方向:环境监测。

水中低含量微囊藻毒素（RR）高效液相色谱法检测摘要：本文用高效液相色谱法检测水中微囊藻毒素（RR），针对水中微囊藻毒素含量低，难检出问题，对常规高效液相色谱做了两种优化改进，在线富集进样、大定量进样，大大降低检出限，获得满意的结果。

关键词液相色谱在线富集大定量进样微囊藻毒素检出限前言微囊藻毒素（RR）具有较强的毒性及危害性。

随着中国水体富营养化程度加剧，蓝藻水华和赤潮的发生逐渐增加。

80%的蓝藻水华都可以检测出次生代谢产物----微囊藻毒素（microcystins，MCs），它对水体环境和人群健康的危害已成为全球关注的重大环境问题之一。

环境改善，检测、防控和治理是必不可少的工作内容。

本文主要介绍水中低含量微囊藻毒素（RR）的检测方法。

本方法检出限低或超低，主要针对水中低含量微囊藻毒素（RR）高效液相色谱法检测，适用于饮用水、湖泊水、河水、地表水等水样检测。

本方法参考《GB/T 5750.8-2006 生活饮用水标准检验方法有机物指标》中第13部分微囊藻毒素，优化出两种检测方案。

实验部分1 方案一：在线富集高效液相色谱法检测。

图1 在线富集高效液相色谱法检测流程图1.1 仪器配置：高压输液泵2台，在线脱气机（两路以上脱气）1台，六通自动进样阀2个（1个带2ml定量环1套，一个带富集柱1根），预柱1根，色谱柱1根，柱温箱1台，紫外检测器1台，三通电磁阀1个，进样泵（或高效液相色谱自动进样器）1台，工作站1套，配件1套（包括废液桶、管路、接头等）。

1.2 色谱条件：色谱柱：ODS C18色谱柱，Venusil XBP (L) 4.6mm×150mm×5μm流动相：流动相A（色谱洗脱液）：乙腈：水：三氟乙酸=40%：60%：0.05%流动相B（富集液）：甲醇（或乙腈）：水=15%：85%进样体积：2ml流速：1ml/min检测器：紫外检测器检测波长：238nm柱温：35℃1.3 试验对比（进样量相同，进样体积不同）：直接进样20μl，标准样品浓度20ng/ml，色谱图情况图2 微囊藻毒素（RR）标准样品浓度20ng/ml色谱图该检测方法噪声约3.6μAu，样品峰高32μAu，标准样品浓度20ng/ml，按3倍噪声计算检出限，检出限约6.75 ng/ml。

细胞和水中的微囊藻毒素的快速检测摘要水中微囊藻毒素的污染在全球的出现以及被人们所关注，促使了一系列对它定性和定量的检测方法的发展。

然而，大多数的方法相对来说是耗时的，昂贵的，而且还需要实验室的专业知识。

完整和灵敏的重组抗体的出现已经减少了免疫试纸条发展的困难，这种试纸条可以用最少的装备和最简单的步骤在现场快速的检测微囊藻毒素和节球藻毒素。

本文主要评估已经商业化的试纸条的灵敏度和交叉反应性，并且用它们来检测了实验室培养物和自然样品中的微囊藻毒素。

结果表明：免疫试纸条用于检测10 mg/l 的微囊藻毒素时，所有要检测的八个样品都检测出毒素的浓度低于 1 mg/l 。

此外，在一系列实验室培养物和取自灌溉池塘的样品中都成功的检测出了微囊藻毒素和节球藻毒素。

1.前言微囊藻毒素是一种由许多水生类的蓝藻产生的剧毒肝毒素，在世界很多地方都有它的报道。

被这种毒素污染的水体正在增加，这个问题已经被我们察觉，我们把它归咎于湖水和水库的富营养化或者也可能由于气候的变化。

微囊藻毒素对暴露在其中的人有急性和慢性致癌作用，正是由于它这种影响使它受到广泛关注，也导致了饮用水中的MCLR的最高含量标准，以及一类工作者探测、识别和量化在自然经过加工的水中的微囊藻毒素需要必备条件的出台。

仪器分析（也就是HPLC和LC-MS）提供了高质量的资料，这些资料包括了对已知的以及潜在的新型的微囊藻毒素的定量和定性。

一般来说，这种方法要求样品有浓度的数量限制，而这个数量限制要低于WHO1m g/l的标准。

这种方法使用固相萃取，能同时达到样品浓度和样品清洁度，虽然在取样和的结果会超过48H，但是它仍然是最受亲睐的。

在广泛的生物检测和酶抑制力中，ELISA法由于其良好的选择性和灵敏度已被最广泛使用，另外几种方法现在已经商业化了数年。

相对于其他的生物实验，ELISA法可以检测和报告样本的微囊藻毒素含量总数。

虽然没有查明个别微囊藻毒素，但它达到了消除一个范围广泛的分析标样的要求，并允许简单的风险评估。

微囊藻毒素的检测方法及其展望内陆水体富营养化的加剧引起了藻类大量繁殖，形成日趋严重的水华污染。

水华污染是淡水水体中危害最严重的因素之一，所产生的微囊藻毒素（Microcystins，MC)毒性较大,分布广泛,具有稳定的化学结构和生物活性，是目前发现的最强的肝脏肿瘤促进剂之一。

常规饮用水处理技术并不能有效地脱除水体中的微囊藻毒素，微囊藻毒素引起的野生动物、家禽和家畜等中毒或死亡的事件已有许多报道,并通过生态系统、食物链对人类造成潜在的威胁。

由于MC—LR在微囊藻毒素中的毒性最大，并证实其有促肿瘤作用，所以目前关于饮用水中藻毒素的限值都是以MC—LR为代表的。

上世纪九十年代世界卫生组织（WHO）在对饮用水质量基准的补充文件中规定微囊藻毒素—LR（游离的和与细胞结合的）的基准值为0.001mg/L，我国在2006年修订并实施的《国家生活饮用水卫生标准》中已将MCYST-LR列为非常规监测项目，确定执行标准为0.001mg/L。

水体中藻毒素污染已成为一个全球性的环境问题而日益受到人们的关注。

1微囊藻毒素的特点藻细胞破裂后会释放出多种藻毒素。

一般认为它是由肽合成酶复合体合成的生物活性小肽,具有环状结构及其氨基酸的特殊结构.影响微囊藻毒素合成的环境因子较多，主要的有光照、温度、pH值和营养元素等。

有研究结果表明藻毒素是初级代谢产物，其主要作用是通过鳌合使进入藻体内的重金属离子减轻毒性和抑制其它水生植物并促进其本身的生长。

不同藻毒素的功能还有待深入研究。

2检测方法国内在这方面的研究则相对集中在对MC的去除方法上，在检测技术方面目前常用的检测方法主要有生物毒理检测法、化学分析法和生化分析法。

2.1生物毒理检测法：生物毒理检测法包括动物毒性法、细胞毒性法。

动物毒性法是将纯化的微囊藻毒素或水华蓝藻中提取的藻毒素通过动物口服或注射来间接评价藻毒素的毒性的一种方法。

根据动物的生理病变及半致死剂量(LD50）可初步确定藻毒素的毒性,这也是毒理评价的常用方法。

高效液相色谱法测定水中微囊藻毒素雷军马东哲王鹏辉（国家城市供水水质监测网大庆监测站，大庆，163458）摘要研究了一种用高效液相色谱法分析水中微囊藻毒素的方法。

当取样量为1L时，回收率为99.6%，RSD<10%，检出限为0.05mg/L。

并用该方法对某地区水库引水干渠、水库原水、出厂水中的微囊藻毒素的含量进行了定量测定。

关键词微囊藻毒素液相色谱法1引言微囊藻毒素分子形态成七肽环状[1]，结构稳定，其分子结构通常为环-[-D-丙氨酸-L-X-赤-β-甲基-D-异天冬氨酸-L-Y-Adda-D-异谷氨酸-Mdha]，其中Mdha和Adda是两种特殊氨基酸，Adda与MC的毒性有密切关系[2]，X,Y代表两种可变氨基酸，由它们的不同，以及其它一些基团的细微变化，就产生了多种微囊藻毒素异构体，常见的有MC-LR、MC-RR、MC-YR三种毒素[3-4]，其中L、R、Y分别代表亮氨酸、精氨酸、酪氨酸[5]，目前发现的异构体有60多种。

Harada将微囊藻毒素的检测和分析分为四个层次[6]：筛选、纯化、鉴定和定量分析。

其主要的方法有生物分析法、色谱分析法、免疫分析法和其他仪器分析法。

目前使用较多的是色谱分析法和免疫分析法两种。

高效液相色谱法因其灵敏度高、分析速度快，在测定微囊藻毒素方面具有其它方法无可比拟的优点，它可对不同类型的微囊藻毒素分别进行定性定量测定。

本文在色谱柱选择、色谱条件优化等方面实验优化，进一步提高了检测的灵敏度，增加检测的特异性，使此方法能更成熟、可靠，同时操作更简便，检测速度快捷。

2实验部分2.1仪器和试剂HP1290高效液相色谱系统（美国Agilent公司），包括G1315A二极管阵列检测器（DAD）；G1311A四元泵；G1313A自动进样器；G1322A真空脱气机；G1316A恒温柱箱；HP ChemStation A.06.01；Turbo Vap® LV样品浓缩仪。

CE和HPLC测定水源水体中微囊藻毒素方法比较王 阳1,2，徐明芳1,2,*，曾晓琮3，耿梦梦1，黎 明1，陈耕南1（1.暨南大学生命科学技术学院，广东广州510632；2.暨南大学应急管理研究中心，广东广州510632；3.广东省食品检验所，广东省酒类检测中心，广东广州510435）摘 要：利用毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）仪结合紫外-可见光二极管阵列检测器检测技术建立水体中痕量微囊藻毒素的检测新方法。

通过与GB/T 20466—2006《水中微囊藻毒素的测定》高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）方法对比分析，进行2 种检测技术的评价。

CE检测条件为：毛细管柱（60 cm×75 μm i.d.），有效长度为44 cm，分离缓冲溶液为12 mmol/L硼酸盐（pH 9.0），分离电压25 kV，检测波长238 nm，压力6 895 Pa流体动力学进样；优化后的HPLC检测条件为：C18色谱柱（250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm），甲醇-磷酸盐缓冲溶液（60∶40，V/V）为流动相，检测波长238 nm，柱温度35 ℃，流速1 mL/min。

结果表明：CE对3 种微囊藻毒素MC-RR、MC-LR和MC-YR的检出限分别是0.16、0.20 μg/mL和0.24 μg/mL，HPLC对3 种微囊藻毒素的检出限分别为0.020、0.079 μg/mL和0.052 μg/mL，这2 个方法的灵敏度相差1 个数量级；加标回收率分别92.5%～106.0%和99.6%～102.5%，CE对应的保留时间和峰面积的精密度相对标准偏差为0.53%～0.64%和2.67%～3.29%；HPLC法的保留时间和峰面积精密度相对标准偏差为0.16%～0.53%和0.80%～1.53%。

《生活饮用水5种微囊藻毒素的测定方法—液相色谱串联质谱联用法》（送审稿）编制说明《生活饮用水中微囊藻毒素的测定方法》标准编制组二O一二年五月《生活饮用水中5种微囊藻毒素的测定方法—液相色谱串联质谱联用法》编制说明1 编制依据本检测方法的制订是中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所、深圳市疾病预防控制中心受卫生部卫生政策法规司/卫生标准专业委员会/环境卫生标准委员会委托，对现行《生活饮用水卫生检验标准方法-毒素指标》(GB/T 5750-2006)中5种微囊藻毒素（MC-LR、RR、YR、LW、LF）测定方法进行修订本课题于2011年初立项，经过查阅文献、实验方案设计、条件选择实验、方法学各项指标的实验研究、现场及实验室验证、实验数据汇总，至标准方法送审稿形成，历经1年时间，于2012年2月完成。

2 起草单位及主要起草人起草单位：深圳市疾病预防控制中心、珠海市疾病预防控制中心、深圳市水质检测中心、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。

主要起草人：刘红河、刘桂华、朱舟、陈剑刚、宗栋良、岳振峰。

3 背景及标准概况水是生命之源，健康之本，饮用水水质的安全与卫生是人类健康最基本的保障。

在我国，由于环境污染的不断恶化，内陆河湖地区普遍存在藻类污染，其中蓝绿藻属中的一类微囊藻，能够在水中分解出微囊藻毒素（microcystin，简称MC）。

MC是一类具有强烈促癌作用的天然肝毒素，大量研究表明，MC能抑制磷酸（酯）酶活性，形成活性氧，干扰细胞骨架的组成，引发细胞凋亡、肝出血、肝肿瘤。

其结构变化很多，但都有一个共同的单环肽毒素结构，含有共同的分子成分：3-氨-9-甲氧基-2, 6, 8-三甲基-10-苯基- 4, 6-二烯酸（Adda），Adda是一个关键的毒性成分。

在MC已发现的60多种异构体中，MC-LR、MC-YR、MC-RR分布很广泛, 其中MC-LR 在世界上分布最为广泛。

MC 性质稳定，其在水中的溶解度大于1 g/L，也溶于甲醇和丙酮，煮沸后不失活，不挥发，抗pH变化。