三氟乙酸在HPLC中的应用

三氟乙酸色谱级
三氟乙酸（TFA）是一种重要的有机化合物，在医药、农药、燃料、氨基酸保护、有机合成等领域得到广泛应用。

在色谱领域，三氟乙酸常常用作离子对试剂，用于反相色谱分离多肽和蛋白质。

三氟乙酸色谱级是指在色谱分析过程中，采用高纯度的三氟乙酸作为试剂，进行样品的分离和检测。

三氟乙酸色谱级具有以下特点：
1. 较高的酸性强，极性大，有利于在反相色谱柱中实现良好的峰形和分离效果。

2. 挥发性好，易于从制备样品中除去，降低了对环境和实验人员的危害。

3. 紫外吸收峰低于200nm，对低波长处的多肽检测干扰较小。

4. 线性关系良好，灵敏度高，重复性好，适用于多肽药物中三氟乙酸的质量控制要求。

在三氟乙酸色谱级应用中，常见的色谱柱类型有：
1. Discovery BIO C18色谱柱：可以在不加三氟乙酸的情况下，实现多肽的良好分离和峰形。

2. Dionex IonPacTM AS23阴离子柱：用于同时测定多肽中的三氟乙酸与乙酸，具有较高的准确性和灵敏度。

3. 毛细管电泳法：作为一种高效的分离技术，可在三氟乙酸存在下实现多肽的分离和检测。

总之，三氟乙酸色谱级是在色谱分析过程中，采用高纯度的三氟乙酸作为试剂，实现多肽和蛋白质分离的一种方法。

通过选择合适的色谱柱和优化实验条件，可以实现对三氟乙酸的高效分离和检测。

合成多肽药物中三氟乙酸检测方法研发表时间：2018-11-23T11:56:21.727Z 来源：《药物与人》2018年8月作者：张莲莲杜开峰[导读] 三氟乙酸（TFA）是多肽药物的一项重要控制项目，目前报道较多的检测方法是离子色谱法（IC）与高效液相色谱法（HPLC）。

摘要：三氟乙酸（TFA）是多肽药物的一项重要控制项目，目前报道较多的检测方法是离子色谱法（IC）与高效液相色谱法（HPLC）。

本文分别对 IC 及 HPLC 法进行研究：结果表明 IC 法 TFA 定量限为 2.4ng，推算检出限为 0.8ng，且在 0.12088μg/mL～6.044μg/mL 范围内呈良好的线性关系（r = 0.9999）；HPLC 法定量限为 6ng，检出限为 1.5ng，且在 0.3023μg/mL～15.115μg/mL 范围内呈良好的线性关系（r = 0.9998），加标回收率为 99.3%～101.7%，精密度（n=6）为 0.192%～0.200%，RSD5=1.4%。

结论：IC 法与 HPLC 法相比，在灵敏度，线性及重复性等方面差异不大，均能满足准确检测相关多肽样品中 TFA 含量要求，但 HPLC 法适用范围更广，且能同时检测多肽药物中醋酸（HAC）及三氟醋酸（TFA）含量，达到简单易行、结果准确、灵敏度高、降低成本、提高效率的研究目的。

关键词：离子色谱法，高效液相色谱法，多肽，三氟乙酸，含量检测中图分类号：文献标识码：A Abstract：Trifluoroacetic acid (TFA) is an important control item of polypeptide drugs. Ion chromatography (IC) and high performance liquid chromatography (HPLC) are commonly used in the detection of TFA. In this paper, IC and HPLC methods are studied respectively.The results showed that the quantitative limit of TFA by IC method was 2.4 ng, the detection limit was 0.8 ng, and the linear relationship was good in the range of 0.12088 ug/mL to 6.044 ug/mL (r=0.9999);the quantitative limit of HPLC was 6 ng, the detection limit was 1.5 ng, and the linear relationship was good in the range of 0.3023 ug/mL to 15.115 ug/mL (r = 0.9998). The recovery was 99.3% ~ 101.7%, the precision (n = 6) was 0.192% ~ 0.200%, RSD5 = 1.4%.CONCLUSION: Compared with HPLC, IC method has little difference in sensitivity, linearity and repeatability, and can meet the requirement of accurate determination of TFA content in related polypeptide samples. However, HPLC method has a wider application range and can simultaneously detect the contents of HAC and TFA in polypeptide drugs.The HPLC method is simple, accurate, sensitive, low cost and efficient. Key words：Ion chromatography ;HPLC; Peptide ;Trifluoroacetic acid; Content determination 1 前言三氟乙酸（TFA）普遍用于合成多肽的工艺中作为切割剂及脱保护剂，临床使用存在毒性。

高效液相色谱法测定塞来昔布中三氟乙酸残留【摘要】目的建立高效液相色谱法测定塞来昔布中三氟乙酸的残留含量。

方法色谱柱：采用Hypersil ODS柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），检测波长210 nm，流动相：0.08%磷酸溶液（Ph 3.0）-甲醇（95：5），流速1.0 ml/min，柱温：35℃。

结果三氟乙酸浓度在 2.05～12.12 μg/ml范围内，线性关系良好，r=0.9998；检测限为1.0 ng；加样回收率平均为98.57%，RSD 为0. 99%。

结论此法可用于塞来昔布中三氟乙酸含量的测定，准确度高。

【关键词】塞来昔布；高效液相色谱法；三氟乙酸；含量测定塞来昔布（4-[5-（4-甲基苯基）-3-（三氟甲基）-1H-吡唑-1-基]苯磺酰胺）是第一个在骨关节炎和风湿病的治疗中起作用的COX-2抑制剂[1，2]。

这个药与传统的非类固醇性抗炎剂联用时无通常的副作用。

GD Searle研发出了塞来昔布，目前市场上商品名为西乐葆。

在塞来昔布的合成工艺中，一般以对甲基苯乙酮和三氟乙酸乙酯经Claisen 缩合反应制得中间体，然后与对苯磺酰胺基苯肼盐酸盐化合制得塞来昔布。

由于三氟乙酸乙酯会水解生产三氟乙酸，因此在塞来昔布原料药的质量标准中，对三氟乙酸限量有明确要求，进口注册标准中规定三氟乙酸不得超过0.04%。

本实验建立了高效液相色谱法（HPLC）测定塞来昔布中三氟乙酸残留的方法。

1 材料塞来昔布，江苏正大清江制药有限公司提供，批号：20121029、20121103、20121109、20121118；三氟乙酸对照品（色谱纯），美国天地试剂有限公司；甲醇（色谱纯），江苏汉邦科技有限公司；其余试剂均为市售分析纯。

美国Waters Alliance 2695 高效液相色谱仪，2487紫外可变波长检测器，Empower 2色谱工作站。

2 方法与结果2. 1 色谱条件色谱柱：Hypersil ODS 柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流动相：0.08% 磷酸溶液（pH3.0）- 甲醇（95：5）；流速：0.8 ml/min；检测波长：210 nm；柱温：35 ℃；进样量：20 μl。

三氟乙酸(Trifluoroacetic acid)于液相层析方法应用
须高pH:
前曾述及当pH高于8会融溶“硅胶”的骨干造成伤害，因此pH高于8的移动相，则不建议使用。

若必须使用高pH移动相以增进分离效应者，须选用耐高pH的层析管。

一般的认知，硅胶具高纯度、高质量的官能基化学键结及完善硅醇基的终结处理，都是降低或减少被融溶，即降低对层析管材质的伤害。

或是少用“磷酸盐”因为高pH会促进硅胶的融溶。

或是有机相改用Pyrrolidone可防止在高PH的融溶。

即使是如此的注意使用，一旦常用于高pH移动相，层析管寿命会受影响的。

须调和盐类的浓度:
移动相调和盐类在于提供适切的pH，若仅为pH需求，则些许少量即可。

多数注入分析的量，
大约是在ng/ml至
ug/ml范围，如此即使注
入了100ul作分析，也
不过是数百ng的量，只
要些许于pKa值的一个
pH变化量的盐类即够
充分。

层析管材料被盐类充分
布满也是Buffer量的考
虑，然而，越是更纯的
硅胶，越是毋须高Buffer
量的使用。

这一点，可
由Figure 4，不同TFA
使用量的移动相所获得
不同的图峰型，Figure 4
左边的三种层析管，使
用了0.1% TFA之图峰
型优良。

若降低为0.01%
TFA时，有的图峰则变
得不成峰型。

HPLC使用注意事项1.流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45um或更细的膜过滤)。

2.流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。

3.不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。

4.使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用去离子水冲洗管路及柱子一小时，然后用甲醇(或甲醇水溶液)冲洗40分钟以上，以充分洗去离子。

对于柱塞杆外部，做完样品后也必须用去离子水冲洗20ml以上。

5.长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水易长霉。

6.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。

7.C18柱绝对不能进蛋白样品，血样、生物样品。

8.堵塞导致压力太大，按预柱→混合器中的过滤器→管路过滤器→单向阀检查并清洗。

清洗方法；①以异丙醇作溶剂冲洗：②放在异丙醇中间用超声波清洗；⑧用10％稀硝酸清洗。

9.气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。

10.如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液：通常在输液前要进行流动相的清洗。

11.要注意柱子的PH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。

12.更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边靖洗，然后插入新的流动相中。

更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。

高效液相色谱常见故障的断定及解决诊状可能的原因解决方法(一)保留时间变化1.柱温变化柱恒温，必要时需配置恒温箱2.等度与梯度间未能充分平衡至少用10倍柱体积的流动相平衡柱3.缓冲液容量不够用》25mmol/L的缓冲液4.柱污染每天冲洗柱5.柱内条件变化稳定进样条件,调节流动相6.柱快达到寿命采用保护柱(二)保留时间缩短1.流速增加检查泵,重新设定流速2.样品超载降低样品量3.键合相流失流动相PH值保持在3"7.5检查柱的方向4.流动相组成变化防止流动相蒸发或沉淀5.温度增加柱恒温(三)保留时间延长1.流速下降管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡2.硅胶柱上活性点变化用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化3.键合相流失同前(二)34.流动相组成变化同前(二)45.温度降低同前(二)5(四) 出现肩峰或分*1.样品体积过大用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%2.样品溶剂过强采用较弱的样品溶剂3.柱塌陷或形成短路通道更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件4.柱内烧结不锈钢失效更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品5.进样器损坏更换进样器转子(五)鬼峰1.进样阀残余峰每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗2.样品中未知物处理样品3.柱未平衡重新平衡柱,用流动相作样品溶剂 (尤其是离子对色谱)4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱) 每天新配,用抗氧化剂5.水污染(反相) 通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水(六) 基线噪声1.气泡(尖锐峰) 流动相脱气,加柱后背压2.污染(随机噪声) 清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂3.检测器灯连续噪声更换氘灯4.电干扰(偶然噪声) 采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等)5.检测器中有气泡流动相脱气,加柱后背压(七)峰拖尾1.柱超载降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相2.峰干扰清洁样品,调整流动相3.硅羟基作用加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值,钝化样品4.同前(四)4 同前(四)45.同前(四)3 5.同前(四)36.死体积或柱外体积过大连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管7.柱效下降用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱(八)峰展宽1.进样体积过大同(四)12.在进样阀中造成峰扩展进样前后排出气泡以降低扩散3.数据系统采样速率太慢设定速率应是每峰大于10点4.检测器时间常数过大设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10%5.流动相粘度过高增加柱温,采用低粘度流动相6.检测池体积过大用小体积池,卸下热交换器7.保留时间过长等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱8.柱外体积过大将连接管径和连接管长度降至最小9.样品过载进小浓度小体积样品液相色谱柱使用经验谈色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。

HPLC使用指南第一部分使用前准备1. 流动相1.1 常用的溶剂体系1.1.1 中性体系甲醇-水乙腈-水异丙醇-水（质谱常用，HPLC使用较少）1.1.2 酸性体系0.08% (v/v) TFA（三氟乙酸） in water - 0.08% (v/v) TFA in acetonitrile（乙腈）0.1% (v/v) TFA in water - 0.1% (v/v) TFA in acetonitrile*HPLC常用的酸有：三氟乙酸，甲酸。

三氟乙酸：最常用。

对体系（基线）的稳定性好。

但配置好的流动相溶液不稳定，不能长时间放置。

沸点低，容易除去。

酸性较强。

甲酸：常用。

沸点较低，较易除去。

但对体系（基线）的稳定性较差。

**酸性体系会减少色谱柱的使用寿命。

因此在使用不同的色谱柱之前，需要注意填料可耐受的酸碱度。

一般C18的填料的耐受范围是pH3-8。

1.1.3 缓冲体系0.05M TEAB（溴化四乙铵） - acetonitrile0.1M TEAB - acetonitrile*HPLC常用的缓冲溶液体系有：三乙胺-碳酸缓冲液 (TEAB)，三乙胺-醋酸缓冲液 (TEAA)，三乙胺-磷酸缓冲液 (TEAP)三乙胺-碳酸缓冲液 (TEAB)：沸点较低，容易除去。

常用。

三乙胺-醋酸缓冲液 (TEAA)：沸点较高，不易除去。

多用TEAB替代。

三乙胺-磷酸缓冲液 (TEAP)：根据需要使用。

**摩尔浓度指TEA的摩尔浓度，酸用来调节pH值。

根据需要调节所需要的pH值。

例如：pH7.5的TEAB (0.05M) 水溶液。

1.2 溶剂过滤及过滤设备1.2.1 溶剂过滤必须过滤的流动相：经过配置的酸性体系及缓冲体系可以不过滤的流动相：中性体系，即纯水，纯乙腈，纯甲醇*所有接触过非色谱纯的容器的溶液，都需要过滤。

过滤之后需要用标签注明过滤的日期。

**已过滤的溶液，经过长时间放置，需要重新过滤。

1.2.2 溶剂过滤器*由过滤杯，过滤头，接收瓶及铝合金夹子组成。

流动相辅助剂的作用三乙胺流动相中加入三乙胺，能显著的改善峰形，消除拖尾，其作用是屏蔽硅羟基。

三乙胺的pKa为，在pH<－2＝的条件下是以离子状态N＋H(CH2CH3)3的形式存在的，因此pH在~ 硅羟基呈Si－O－离子态的情况下，N＋H(CH2CH3)3容易与Si－O－形成相对较强的静电吸引力。

加入三乙胺的注意事项加入三乙胺改善峰形的时候，有两点需要注意：1）三乙胺的碱性很强，加入三乙胺后流动相的pH可能超出色谱柱的使用范围，对色谱柱造成损伤。

pH的改变也会导致出峰时间的显著变化，可能引起的其它问题，建议流动相中加入三乙胺后回调至未加入前的pH值。

通常即使pH回调过后，由于三乙胺成为了固定相的一部分，保留时间也有较大变化；2）三乙胺在210nm处有比较强的吸收，如果液相方法中检测波长在210nm以下测定时需要谨慎使用。

四烷基季铵盐四烷基季铵盐（如四丁基硫酸氢铵、四丁基溴化铵、四丁基氢氧化铵等）在水中电离后，也形成了类似N＋H(CH2CH3)3的结构N＋(CH2CH2CH2CH3)4 ，这种结构也能有效的与Si－O－产生较强的静电作用，阻止氨基与硅羟基的接触，改善峰形。

而且它还有一个不同于三乙胺的显著特点是，它在低波长范围的吸收比三乙胺弱。

烷基磺酸盐离子对试剂流动相中加入辛烷磺酸钠等烷基磺酸盐离子对试剂也能很好的改善峰形，其作用机理与三乙胺和四丁基硫酸氢铵颇为不同，是通过与样品分子的作用来阻止样品分子与硅羟基的作用来改善峰形。

缓冲盐增加缓冲盐浓度可以增大流动相中的离子强度，减少因静电的作用（有可能存在于样品分子之间、也有可能存在于样品分子与填料表面之间）引起的前延。

四氢呋喃往流动相中加入少量的四氢呋喃有时可以改善峰形、增大分离度，很多色谱工作者都知道和使用，但其机理似乎少人提及。

通常所加入的量在5％以内即可，需要的时候可以加入更大的量。

三氟乙酸TFA流动相中的三氟乙酸通过与疏水键合相和残留的极性表面以多种模式相互作用，来改善峰形、克服峰展宽和拖尾问题。

三氟乙酸在HPLC中的应用高效液相色谱(High-performance liquid chromatography, HPLC)是一种分离、检测化合物的分析方法。

在实际的分析过程中，选择合适的流动相对于样品的分离效率和分离速度都十分重要。

三氟乙酸(trifluoroacetic acid, TFA)是HPLC中常用的流动相溶剂，下面将探讨一下其在HPLC分析中的应用。

三氟乙酸的性质三氟乙酸是一种无色透明的液体，水溶性良好，熔点-15.3 ℃，沸点71.8 ℃，密度为1.49 g/mL。

三氟乙酸对很多有机物有很好的溶解度，同时可以降低溶剂极性，因此在HPLC中被广泛使用。

三氟乙酸在HPLC中的应用三氟乙酸在HPLC中通常用于两种流动相，即水和乙腈溶液。

对于非极性或中性化合物，首选使用乙腈流动相；对于极性化合物，可以使用水流动相。

当使用中性或稍微极性的流动相时，使用0.1%~0.5%的三氟乙酸作为缓冲剂，则可以提高分离效率。

三氟乙酸在HPLC中的应用主要表现在以下两个方面：提高分离效率三氟乙酸作为缓冲剂在HPLC中使用时，可以提高极性化合物的分离效率。

这是因为三氟乙酸可以降低溶剂极性，使得芳香族化合物等极性化合物能够在相同的流动相下快速分离。

解决峰形状异常问题在HPLC分析中经常会出现峰形状异常问题，如峰前扁平化、畸变等问题。

这些问题通常是由于试剂等因素所引起。

三氟乙酸可以作为一种试剂混入流动相中，来解决这些异常问题。

除此之外，三氟乙酸还可以增加HPLC柱的使用寿命。

，三氟乙酸在HPLC中有着广泛的应用。

作为一种优良的缓冲剂，它不仅可以提高极性化合物的分离效率，还可以解决峰形状异常问题。

因此，合理地应用三氟乙酸，可以提高样品分离效率和提高HPLC的使用寿命。

0.02.55.07.510.012.5min0510152025303540mVDetector A:Ex:365nm,Em:425nmHPLC 柱前衍生法分析黄曲霉毒素B1黄曲霉毒素（AFT ）对有机体具有致突、致癌、致畸性，被列为可能的人体致癌物质。

黄曲霉毒素在多种人类食物中被发现，如玉米、坚果、花生等等，以B1、B2、G1、G2的形式存在。

AFTB1在动物体内可转变成两种主要代谢产物- AFTM1和AFTQ , 前者的毒性和致癌性与AFTB1相近, 主要存在于动物的尿和乳汁中。

黄曲霉毒素可使用正相和反相液相色谱法分离，反相色谱法操作较容易、流动相毒性也较低，被广泛采用。

使用反相液相色谱检测时，可通过柱前衍生法或柱后衍生法，提高AFTB1、AFTG1的检测灵敏度，使之与AFTB2、AFTG2在相近水平下检测。

柱前衍生法无需专用柱后衍生反应系统，方法简单。

本方法通过三氟乙酸（TFA ）柱前衍生，HPLC 检测黄曲霉毒素B1。

该方法可用于4种黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2同时检测，也可用于AFTM1检测。

■ 样品前处理取50μL 黄曲霉毒素B1标样溶液 (10ng/mL ，溶剂苯-乙腈溶液(98:2 v/v))，用氮气吹干，加入200μL 正己烷和100μL 三氟乙酸，混匀1min ，室温下放置10min ，氮气吹干，用乙腈水溶液(乙腈/水 85：15 v/v) 50μL 重新溶解，混匀30s ，经0.45μm 滤膜过滤，供液相色谱仪检测用。

■ LC 分析条件仪器Shimadzu LC-20A 液相色谱系统（含LC-20AT 二元泵、CTO-20A 柱温箱，RF-10AXL 荧光检测器，LCsolution 色谱工作站）色谱分析条件流动相：甲醇:乙腈:水=1:3:6 流速：1.0mL/min色谱柱：Shim-pack GVP-ODS (4.6mm*10mm)；Shim-pack VP-ODS (4.6mm*150mm,5μm) 激发波长 365nm 发射波长 425nm 柱温：40 ℃进样量：10μL ■ 分析结果黄曲霉毒素B1（AFTB1）标样色谱图及分析结果图1 衍生后AFB1标样色谱图 图2 未衍生AFTB1标样色谱图AFTB1AFTB0.02.5 5.07.510.012.515.0min-0.10.00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.01.1mVDetector A:Ex:365nm,Em:425nm表1黄曲霉毒素B1分析结果化合物标样浓度(ng/mL)保留时间(min)峰面积峰高AFTB1 衍生10 3.36832924637098 AFTB1 未衍生10 6.721126851024 ■结论三氟乙酸柱前衍生法可用于AFTB1检测，增强其荧光强度，提高检测灵敏度。

三氟乙酸流动相梯度基线全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：三氟乙酸（trifluoroacetic acid，简称TFA）是一种常用的有机酸，它具有较强的酸性和溶解性，因此在化学分析和有机合成中被广泛运用。

TFA在液相色谱分析中扮演着关键的角色，其流动相的梯度调节对分析结果具有重要影响。

流动相在液相色谱中扮演着溶解试样、传递试样、分离试样等重要作用。

梯度则是流动相中溶剂浓度逐渐变化的过程，通过梯度的调节可以实现对化合物的有效分离。

梯度的设计需要考虑多方面因素，比如分离物质的性质、分离的难易程度、分析的目的等。

在液相色谱分析中，梯度的优化是提高分离效果、分析精度和速度的关键。

而基线则是液相色谱中的一个重要概念，它代表了色谱图中没有化合物的区域。

基线的高低、平整与否直接影响到分析结果的准确性，所以基线的稳定性和平整性对于液相色谱分析至关重要。

在设计梯度时，需要A级溶液和B级溶液的比例调配，以此来实现对分析物的有效分离，同时还要保证基线的稳定和平整。

三氟乙酸在液相色谱中作为流动相的优点在于其溶解性和稳定性较好，可以有效地溶解不易溶解的化合物，并且也可以作为质谱分析的离子源。

但在使用过程中也需要注意TFA的腐蚀性和毒性，要注意安全操作。

在液相色谱分析中，梯度的调节需要在分离效果和基线的稳定性之间找到平衡点。

有时候为了追求更好的分离效果，就需要增加梯度的斜率，但这也会增加对基线稳定性的要求。

所以在设计梯度时，需要综合考虑多方面因素，尤其要注意基线的稳定性。

在实际操作中，可以通过优化梯度的设计、选择合适的检测器和柱温、调节流速等方式来提高液相色谱的分离效果和分析速度。

同时也需要注意对流动相的质量进行严格控制，以确保分析结果的准确性。

三氟乙酸在液相色谱分析中的应用十分广泛，其作为流动相的梯度调节需要综合考虑分离效果和基线的稳定性。

在实际操作中，需要注意对TFA的安全性和质量的控制，以保证色谱分析的准确性和可靠性。

三氟乙酸流动相梯度基线
三氟乙酸是一种常用的有机溶剂，在液相色谱法中经常被用作流动相。

流动相在液相色谱法中起着溶解样品、输送样品以及与固定相进行相互作用的重要作用。

在使用三氟乙酸作为流动相时，需要考虑其与样品的相容性以及对固定相的影响。

此外，还需要注意流动相的制备方法以及其对色谱分离的影响。

梯度是液相色谱法中常用的一种分离方法，通过改变流动相组成的浓度或者性质来实现对样品的分离。

梯度的设计需要考虑样品的性质、分离的要求以及固定相的特性，以达到最佳的分离效果。

在设计梯度时，需要考虑梯度的斜率、时间和浓度变化的方式，以及对分离效果的影响。

基线是液相色谱法中用来描述色谱图形态的一个重要指标，它代表着流动相或者样品在色谱柱中的透明度或者浓度。

良好的基线是色谱分析的前提，它能够保证色谱峰的分离和定量的准确性。

在液相色谱法中，需要注意基线的稳定性、平整度以及对色谱分离的影响。

综上所述，液相色谱法中使用三氟乙酸作为流动相时，需要考
虑其与样品的相容性、梯度的设计以及基线的稳定性，以达到最佳的分离效果。

同时，对于梯度和基线的控制也是液相色谱分析中需要重点关注的问题。

三氟乙酸在HPLC中的应用液质联用反相色谱柱-------- 降低三氟乙酸用量/ 改善质谱分析在反相色谱分离多肽和蛋白质的实验中，使用三氟乙酸(TFA) 作为离子对试剂是常见的手段。

流动相中的三氟乙酸通过与疏水键合相和残留的极性表面以多种模式相互作用，来改善峰形、克服峰展宽和拖尾问题。

三氟乙酸与多肽上的正电荷及极性基团相结合以减少极性保留，并把多肽带回到疏水的反相表面。

以同样的方式，三氟乙酸屏蔽了固定相上残留的极性表面。

三氟乙酸的行为可以理解为它滞留在反相固定相的表面，同时与多肽及柱床作用，这已在Vydac Advances for Spring, 1997 中得到了报导。

三氟乙酸优于其他离子修饰剂的原因是它容易挥发，可以方便地从制备样品中除去。

另一方面，三氟乙酸的紫外最大吸收峰低于200nm ，对多肽在低波长处的检测干扰很小。

改变三氟乙酸的浓度，可以细微地调整多肽在反相色谱上的选择性。

这一影响对于优化分离条件、增大复杂色谱分析（如多肽的指纹图谱）的信息量是非常有益的。

三氟乙酸添加在流动相中的浓度一般为0.1% ，在这个浓度下，大部分的反相色谱柱都可以产生良好的峰形，当三氟乙酸浓度大大低于这个水平时，峰的展宽和拖尾就变得十分明显。

LC/MS 液质联用在过去的十年中，反相色谱与电喷雾质谱联用已成为多肽和蛋白质的分子量测定和结构分析的重要工具。

然而，含有三氟乙酸的流动相对离子的产生具有抑制作用，一定程度上降低了液质联用技术的灵敏性和分析可靠性。

这种抑制作用可以通过柱后加成技术部分地克服，但将使色谱系统极大地复杂化。

将流动相中三氟乙酸的浓度降低10 倍可以消除这种抑制作用，但同时也会造成色谱分析质量的降低。

Vydac 公司开发了三种液质联用专用反相色谱柱，在使用较低浓度的三氟乙酸时，仍可以得到对称性好、柱效高的多肽和蛋白质色谱峰。

这些柱子基于Vydac 公司品质卓越的高纯硅胶（300A）及C18 和C4 键合相，并通过专利的硅胶处理技术大大减轻了对TFA 的依赖。

降低三氟乙酸用量，改善质谱分析在反相色谱分离多肽和蛋白质的实验中，使用三氟乙酸 (TFA) 作为离子对试剂是常见的手段。

流动相中的三氟乙酸通过与疏水键合相和残留的极性表面以多种模式相互作用，来改善峰形、克服峰展宽和拖尾问题。

三氟乙酸与多肽上的正电荷及极性基团相结合以减少极性保留，并把多肽带回到疏水的反相表面。

以同样的方式，三氟乙酸屏蔽了固定相上残留的极性表面。

三氟乙酸的行为可以理解为它滞留在反相固定相的表面，同时与多肽及柱床作用，这已在 Vydac Advances for Spring, 1997 中得到了报导。

三氟乙酸优于其他离子修饰剂的原因是它容易挥发，可以方便地从制备样品中除去。

另一方面，三氟乙酸的紫外最大吸收峰低于 200nm ，对多肽在低波长处的检测干扰很小。

改变三氟乙酸的浓度，可以细微地调整多肽在反相色谱上的选择性。

这一影响对于优化分离条件、增大复杂色谱分析（如多肽的指纹图谱）的信息量是非常有益的。

三氟乙酸添加在流动相中的浓度一般为 0.1% ，在这个浓度下，大部分的反相色谱柱都可以产生良好的峰形，当三氟乙酸浓度大大低于这个水平时，峰的展宽和拖尾就变得十分明显。

LC/MS 液质联用在过去的十年中，反相色谱与电喷雾质谱联用已成为多肽和蛋白质的分子量测定和结构分析的重要工具。

然而，含有三氟乙酸的流动相对离子的产生具有抑制作用，一定程度上降低了液质联用技术的灵敏性和分析可靠性。

这种抑制作用可以通过柱后加成技术部分地克服，但将使色谱系统极大地复杂化。

将流动相中三氟乙酸的浓度降低 10 倍可以消除这种抑制作用，但同时也会造成色谱分析质量的降低。

Vydac 公司开发了三种液质联用专用反相色谱柱，在使用较低浓度的三氟乙酸时，仍可以得到对称性好、柱效高的多肽和蛋白质色谱峰。

这些柱子基于 Vydac 公司品质卓越的高纯硅胶（ 300A）及 C18 和 C4 键合相，并通过专利的硅胶处理技术大大减轻了对 TFA 的依赖。

HPLC法测定生物素含量摘要：目的：建立以HPLC法测定生物素的含量。

检测方法：色谱柱为VP－ODS，流动相：乙腈-磷酸-0.05%三氟乙酸(250:1:750)，检测波长：210nm，流速为 1.0ml/min,进样量为20ul。

结果：生物素检测浓度的线性范围为0.05～0.30mg/ml(r=0.9999)；平均回收率为99.9%，RSD＝0.53%。

结论：本方法操作简便、精密度好、结果准确。

关键词关键词：高效液相色谱法生物素含量测定前言生物素(d-Biotin)又称维生素H或辅酶R，主要作为各种羧化酶的辅助因子。

对糖、脂肪、蛋白质和核酸等代谢有重要意义，广泛应用于医疗，多维制剂及饲料添加剂等方面。

已载入美国及欧州等国药典，含量测定均采用化学滴定法。

本文建立了测定生物素的HPLC法，操作简便，结果准确，速度比较快。

实验部分一、主要仪器与试剂1.仪器高效液相色谱仪：Agilent 1100Chemstation 色谱工作站2.试剂乙腈( 浙江临海市浙东特种试剂厂，色谱纯)三氟乙酸(上海化学试剂厂，分析纯)磷酸（杭州化学试剂厂，分析纯）3.试验样品生物素对照品(中国药品生物制品鉴定所，含量100%，批号：1029*1-0001)。

生物素样品(浙江医药股份有限公司新昌制药厂，批号：20070826，20070827，20070831)。

二、实验方法1.色谱条件高效液相色谱仪：安捷伦（Agilent）1100 （LC）色谱柱：VP-ODS色谱柱(4.6 mm×250mm,5um)；流动相：取乙腈250ml，加磷酸1ml，再加入0.05%三氟乙酸溶液750ml，混合均匀，过滤；检测器：紫外检测器检测波长：210nm；进样体积：20μl柱温：室温。

2.测试方法精密称取生物素样品约10mg，置于50ml容量瓶中，加流动相溶解，并稀释至刻度，摇匀，得供试品溶液。

另精密称取生物素对照品约10mg，置于50ml 容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，得对照品溶液。

三氟乙酸（TFA）是一种离子配对剂，有助于抑制电离。

在高效液相色谱中，峰拖尾是由于表面硅烷醇基团电离为-Si-O-提供阳离子交换位点而引起的常见失真，添加三氟乙酸可以限制硅胶表面上硅烷醇基团的电离。

三氟乙酸影响电离的原理是通过降低负离子的电荷密度使之稳定，从而抑制电离的发生。

具体来说，三氟乙酸分子中的氟原子具有较强的吸电子能力，能够降低负离子的电荷密度，使其更加稳定，从而抑制电离的发生。

需要注意的是，三氟乙酸是一种具有一定危险性的化学物质，在使用和处理时需要特别小心。

如果你需要使用三氟乙酸或其他化学物质，建议在专业人士的指导下进行，并遵守相关的安全操作规程。

降低三氟乙酸用量，改善质谱分析在反相色谱分离多肽和蛋白质的实验中，使用三氟乙酸 (TFA) 作为离子对试剂是常见的手段。

流动相中的三氟乙酸通过与疏水键合相和残留的极性表面以多种模式相互作用，来改善峰形、克服峰展宽和拖尾问题。

三氟乙酸与多肽上的正电荷及极性基团相结合以减少极性保留，并把多肽带回到疏水的反相表面。

以同样的方式，三氟乙酸屏蔽了固定相上残留的极性表面。

三氟乙酸的行为可以理解为它滞留在反相固定相的表面，同时与多肽及柱床作用，这已在 Vydac Advances for Spring, 1997 中得到了报导。

三氟乙酸优于其他离子修饰剂的原因是它容易挥发，可以方便地从制备样品中除去。

另一方面，三氟乙酸的紫外最大吸收峰低于 200nm ，对多肽在低波长处的检测干扰很小。

改变三氟乙酸的浓度，可以细微地调整多肽在反相色谱上的选择性。

这一影响对于优化分离条件、增大复杂色谱分析（如多肽的指纹图谱）的信息量是非常有益的。

三氟乙酸添加在流动相中的浓度一般为 0.1% ，在这个浓度下，大部分的反相色谱柱都可以产生良好的峰形，当三氟乙酸浓度大大低于这个水平时，峰的展宽和拖尾就变得十分明显。

LC/MS 液质联用在过去的十年中，反相色谱与电喷雾质谱联用已成为多肽和蛋白质的分子量测定和结构分析的重要工具。

然而，含有三氟乙酸的流动相对离子的产生具有抑制作用，一定程度上降低了液质联用技术的灵敏性和分析可靠性。

这种抑制作用可以通过柱后加成技术部分地克服，但将使色谱系统极大地复杂化。

将流动相中三氟乙酸的浓度降低 10 倍可以消除这种抑制作用，但同时也会造成色谱分析质量的降低。

Vydac 公司开发了三种液质联用专用反相色谱柱，在使用较低浓度的三氟乙酸时，仍可以得到对称性好、柱效高的多肽和蛋白质色谱峰。

这些柱子基于 Vydac 公司品质卓越的高纯硅胶（ 300A）及 C18 和 C4 键合相，并通过专利的硅胶处理技术大大减轻了对 TFA 的依赖。

三氟乙酸摩尔质量三氟乙酸（trifluoroacetic acid）是一种重要的有机化合物，化学式为CF3COOH，摩尔质量为114.02 g/mol。

它是一种无色液体，具有刺激性气味，可溶于水和有机溶剂。

三氟乙酸在有机合成和分析化学中有着广泛的应用。

三氟乙酸是一种强酸，其酸性比乙酸和乙酸酐强得多。

它可以与碱反应，生成相应的三氟乙酸盐。

这种性质使得三氟乙酸在有机合成中被广泛使用。

例如，三氟乙酸可以作为催化剂，促进酯化反应、酰化反应和烷基化反应的进行。

此外，三氟乙酸还可以用作酸催化下的酮化反应和羧酸的脱水缩合反应的催化剂。

三氟乙酸还可以用作分析化学中的溶剂。

由于其极性较强，可以溶解许多有机化合物，使其在分析时更容易处理。

三氟乙酸溶液还可以用于高效液相色谱（HPLC）中，作为流动相的一部分，用于分离、检测和定量分析化合物。

此外，三氟乙酸还可以用作质谱仪中的质谱离子化剂，用于有机化合物的质谱分析。

三氟乙酸还具有抗菌和防腐作用。

由于其酸性和抗菌性能，三氟乙酸可以用作食品和饮料工业中的防腐剂，以延长产品的保质期。

此外，三氟乙酸还可以用于农业领域，作为杀菌剂和杀虫剂，用于保护作物免受病虫害的侵害。

然而，需要注意的是，尽管三氟乙酸在许多领域中有着广泛的应用，但由于其对环境和人体的潜在危害，需要正确使用和处理。

三氟乙酸具有挥发性，易通过皮肤和呼吸道进入人体，对皮肤、眼睛和呼吸系统有刺激作用。

在使用三氟乙酸时，应采取适当的防护措施，避免直接接触和吸入。

此外，三氟乙酸在环境中的排放也需要受到限制，以减少对环境的影响。

三氟乙酸是一种重要的有机化合物，具有广泛的应用。

它在有机合成和分析化学中发挥着重要作用，不仅可以作为催化剂，促进化学反应的进行，还可以作为溶剂和离子化剂用于分析和检测。

然而，在使用和处理三氟乙酸时，需要注意安全性和环保性，以确保其应用的可持续性和安全性。

三氟乙酸在氟谱中的出峰位置三氟乙酸是一种氟代有机化合物，具有强烈的酸性和溶解性。

在氟谱分析中，三氟乙酸是一个重要的测试样品，因为它的出峰位置可以提供关键的化学信息。

一、什么是氟谱？氟谱是一种用于测量样品中氟含量的分析方法。

在氟谱中，样品（比如水或者土壤）首先与氢氟酸混合，并加上一种叫做铈的化合物，之后使用紫外光谱仪来测量反应产物。

氟谱的主要原理是，铈离子和氢氟酸反应生成氟离子（F-），而氟离子会吸收紫外光谱区域。

根据样品中吸收的光谱数据，可以计算出氟含量。

二、三氟乙酸的结构与性质三氟乙酸的化学式为CF3COOH，分子量为112.04。

它的结构中包含了一个碳酸羧基（COOH）和三个氟原子（CF3）。

它的三个氟原子均带有负电荷，因此它是一种高度离子化的化合物。

三氟乙酸是一种无色透明的液体，在常温常压下的沸点为164℃。

它具有极强的酸性和溶解力，能够很容易地和许多有机和无机化合物发生反应。

三、三氟乙酸在氟谱中的出峰位置三氟乙酸在氟谱中的出峰位置为220nm左右。

这是因为在氢氟酸和铈化合物的作用下，三氟乙酸中的三个氟原子会被剥夺一个或多个电子，形成一定量的氟离子，亦即F-，而氟离子吸收波长为220nm左右的紫外光。

因此，氟谱中会出现一个明显的吸收峰，称为“三氟乙酸峰”。

四、三氟乙酸在氟谱中的应用三氟乙酸在氟谱中的应用非常广泛。

首先，在环境保护和毒理学领域中，三氟乙酸被用作一种测试样品。

比如，在饮用水中检测三氟乙酸的含量可以判断水源的质量。

在制药和化工行业中，三氟乙酸是很重要的溶剂，在药物合成和有机化学反应中应用广泛。

氟谱法可以用于检测三氟乙酸残留量，保证生产过程的质量和安全。

此外，三氟乙酸的出峰位置在氟谱中是一个非常重要的化学信息。

由于三氟乙酸的结构和物理性质与其他氟代有机化合物非常相似，通过氟谱法可以准确判断其他样品中的三氟乙酸含量，包括其同分异构体和单体结构等。

因此，三氟乙酸在氟谱分析中具有一定的代表性。

降低三氟乙酸用量，改善质谱分析在反相色谱分离多肽和蛋白质的实验中，使用三氟乙酸 (TFA) 作为离子对试剂是常见的手段。

流动相中的三氟乙酸通过与疏水键合相和残留的极性表面以多种模式相互作用，来改善峰形、克服峰展宽和拖尾问题。

三氟乙酸与多肽上的正电荷及极性基团相结合以减少极性保留，并把多肽带回到疏水的反相表面。

以同样的方式，三氟乙酸屏蔽了固定相上残留的极性表面。

三氟乙酸的行为可以理解为它滞留在反相固定相的表面，同时与多肽及柱床作用，这已在 Vydac Advances for Spring, 1997 中得到了报导。

三氟乙酸优于其他离子修饰剂的原因是它容易挥发，可以方便地从制备样品中除去。

另一方面，三氟乙酸的紫外最大吸收峰低于 200nm ，对多肽在低波长处的检测干扰很小。

改变三氟乙酸的浓度，可以细微地调整多肽在反相色谱上的选择性。

这一影响对于优化分离条件、增大复杂色谱分析（如多肽的指纹图谱）的信息量是非常有益的。

三氟乙酸添加在流动相中的浓度一般为 0.1% ，在这个浓度下，大部分的反相色谱柱都可以产生良好的峰形，当三氟乙酸浓度大大低于这个水平时，峰的展宽和拖尾就变得十分明显。

LC/MS 液质联用在过去的十年中，反相色谱与电喷雾质谱联用已成为多肽和蛋白质的分子量测定和结构分析的重要工具。

然而，含有三氟乙酸的流动相对离子的产生具有抑制作用，一定程度上降低了液质联用技术的灵敏性和分析可靠性。

这种抑制作用可以通过柱后加成技术部分地克服，但将使色谱系统极大地复杂化。

将流动相中三氟乙酸的浓度降低 10 倍可以消除这种抑制作用，但同时也会造成色谱分析质量的降低。

Vydac 公司开发了三种液质联用专用反相色谱柱，在使用较低浓度的三氟乙酸时，仍可以得到对称性好、柱效高的多肽和蛋白质色谱峰。

这些柱子基于 Vydac 公司品质卓越的高纯硅胶（ 300A）及 C18 和 C4 键合相，并通过专利的硅胶处理技术大大减轻了对 TFA 的依赖。