磷酸化蛋白质的分析方法

磷酸化指标免疫组化染色磷酸化指标免疫组化染色：揭示蛋白质修饰的重要工具引言：在生物学研究中，了解蛋白质的修饰状态对于探索细胞信号传导、蛋白质功能以及疾病发生机制至关重要。

磷酸化作为一种常见的蛋白质修饰方式，参与了细胞的多种生理和病理过程。

磷酸化指标免疫组化染色是一种重要的实验手段，可以定量检测磷酸化蛋白质的表达和定位。

本文将从深度和广度上详细探讨磷酸化指标免疫组化染色的原理、技术流程和应用，并分享我对其个人观点和理解。

一、原理：1. 磷酸化的意义与作用磷酸化是一种通过在蛋白质分子中加入磷酸基团改变其结构和功能的修饰方式。

它参与了细胞信号传导、基因转录、细胞周期调控等重要生理过程，对于维持细胞的功能和稳态至关重要。

2. 磷酸化指标免疫组化染色的基本原理磷酸化指标免疫组化染色是一种通过特异性抗体与磷酸化蛋白质结合来检测和定量磷酸化蛋白质表达和定位的技术。

它利用免疫组化的原理，通过特异性抗体的结合，使得磷酸化蛋白质在组织切片或细胞标本中形成可视化的染色信号。

二、技术流程：1. 样本的制备与固定研究者需要选择适当的样本（组织切片或细胞标本）进行研究，并进行必要的固定处理，以保持蛋白质的磷酸化状态和细胞结构的完整性。

2. 抗体选择与优化磷酸化指标免疫组化染色的关键是选择和优化合适的抗体。

研究者需要根据研究的具体目的，在各种商业或自制的抗体中筛选出能够特异性识别目标磷酸化位点的抗体。

3. 抗原解蔽处理研究者需要对样本进行抗原解蔽处理，以提高抗体的结合能力。

抗原解蔽处理可以通过热解蔽、酶解蔽或碱解蔽等方法进行。

4. 抗体染色与信号放大将特异性抗体与样本中的磷酸化蛋白质结合，形成可见的染色信号。

为了增强信号的强度和稳定性，可以采用生物素-链霉亲和素（Biotin-avidin）系统和荧光标记等方法进行信号放大。

5. 染色结果的观察与分析通过显微镜观察染色结果，观察磷酸化蛋白质的表达和定位情况。

可以使用图像分析软件对染色结果进行定量分析，以获得更为准确的数据。

应用生物质谱分析蛋白质磷酸化位点工程完成人员：王红霞李卫华李爱玲刘炳玉工程完成单位：军事医学科学院国家生物医学分析中心摘要蛋白质的可逆磷酸化具有重要的生物学意义，对蛋白质磷酸化位点进行分析有助于说明蛋白质磷酸化的机制与功能。

生物质谱是目前进行蛋白质磷酸化分析最有力的方法之一。

我们用天然磷酸化蛋白建立了中性丧失扫描和固相金属亲和色谱〔IMAC〕两种基于质谱的磷酸化蛋白分析方法。

应用这两种方法均可将从蛋白质酶切混合物中找出磷酸化肽段，进而通过序列分析定位磷酸化位点。

两种方法具有不同的特点及局限性，具体研究中还要视具体情况优化实验条件。

蛋白质可逆磷酸化是最普遍、最重要的一种蛋白质翻译后修饰〔PTM〕。

在哺乳动物中大约有三分之一的蛋白质被认为是磷酸化修饰的，对众多生物化学功能起开/关调控作用，是一种普遍的调控机制。

细胞内蛋白质的磷酸化在信号传导中发挥着非常重要的作用。

蛋白质组研究的一个重要方面就是蛋白质磷酸化修饰的分析鉴定。

目前没有一个自动测序方法能够对三种主要的磷酸化氨基酸，即磷酸化丝氨基酸〔pSer〕、磷酸化苏氨基酸〔pThr〕和磷酸化酪氨酸〔pTyr〕。

毛细管电泳〔CE〕可以分析蛋白质或多肽的磷酸化及磷酸化氨基酸，但是鉴定蛋白质磷酸化位点首先要用高效液相色谱〔HPLC〕别离蛋白的酶解肽段，然后用CE筛测磷酸化肽，最后用自动Edman降解氨基酸分析法确定其磷酸化位点，工作量大，不是快速和高通量分析方法。

生物质谱〔MS〕是揭示蛋白质许多翻译后修饰和蛋白质一级结构分析的一个不可缺少的工具，所用的蛋白质样品量在fmol水平。

是唯一能够与蛋白质组研究水平相匹配的方法。

近年来，生物质谱的开展显著地促进了对具有生物学功能的磷酸化蛋白质的研究，是国际上当前最重要的一个前沿领域，也是目前蛋白质组研究的一个重要方面。

这种方法的成功建立，将使人们对磷酸化蛋白质的研究跨上一个新的台阶，对功能性蛋白的寻找和作用机制探寻具有重要意义，在国内具有广泛的需求。

磷酸化蛋白的高效富集在线酶解与快速鉴定项目申请人：袁敏婷黄懿指导教师：杨芃原摘要：蛋白质的可逆磷酸化具有重要的生物学意义，对蛋白质磷酸化位点进行分析有助于阐明蛋白质磷酸化的机制与功能。

生物质谱是目前进行蛋白质磷酸化分析最有力的方法之一，但由于蛋白质磷酸化的丰度低以及磷酸化的肽段离子化效率低，在质谱分析前，依然需要结合富集或分离的步骤。

本作品旨在利用四氧化三铁磁性纳米材料对磷酸化肽或蛋白快速高效的特异性吸附，结合在线酶解技术的快速，高序列覆盖度特性构建一个快速，高效鉴定分析磷酸化蛋白的新技术。

关键词：蛋白质磷酸化；Fe3O4磁性材料富集；在线酶解1.引言蛋白质的翻译后修饰（PTMs）是目前蛋白质组研究中的一个重要课题。

蛋白质磷酸化是最普遍、最重要的一种蛋白翻译后修饰方式，它几乎调节着生命活动的整个过程，包括细胞的增殖、发育和分化，神经活动，肌肉收缩，新陈代谢，肿瘤发生等。

了解蛋白质磷酸化对功能的影响可深入理解生命系统如何在分子水平进行调控。

据统计，在哺乳动物中大约有三分之一的蛋白质被认为是磷酸化修饰的，而脊椎动物基因组中有5%的基因编码蛋白激酶或磷酸酯酶。

对众多生物化学功能起开/关调控作用，是一种普遍的调控机制。

蛋白质的可逆磷酸化使得蛋白质组学研究更为复杂。

真核生物细胞蛋白质中主要的磷酸化氨基酸为丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸，其比例大概为1800∶200∶1。

大多数磷酸化蛋白质都有多个磷酸化位点，并且其磷酸化位点是可变的。

因此,一种蛋白可能有多种磷酸化形式。

对单一蛋白质进行研究的传统方法远不能满足分析这一层面上蛋白质的多样性和复杂性的需要，用蛋白质组技术和生物信息学高通量地研究翻译后蛋白质的修饰已成为必然趋势。

虽然对磷酸化蛋白质组学分析已有很大进步，但依然存在多个难点亟待解决包括磷酸化蛋白和肽段的富集，可逆性磷酸化位点的鉴定以及磷酸化位点的定量等。

在过去几十年中已有多种分离和鉴定蛋白质磷酸化的技术发展起来，包括放射性同位素标记、免疫沉淀反应、化学修饰、固定金属离子亲合色谱法等，而生物质谱技术已经成为磷酸化蛋白鉴定的主要工具，串联质谱更是可以高通量，快速的给出详细的磷酸化位点。

蛋白质修饰检测技术及其应用蛋白质修饰是指在翻译后修饰成熟的蛋白质分子上发生的各种化学改变。

蛋白质修饰可以调节蛋白质的结构、功能和活性，对维持细胞的正常生理功能至关重要。

因此，研究蛋白质修饰及其应用于疾病诊断、治疗和药物研发成为了当前的热点研究领域。

本文将介绍蛋白质修饰的检测技术及其在生物医学领域的应用。

一、蛋白质修饰的类型1. 磷酸化修饰：蛋白质磷酸化是目前研究最广泛的一种修饰形式。

它通过添加磷酸基团改变蛋白质的电荷和空间构型，从而影响蛋白质的功能。

常用的磷酸化修饰检测方法包括质谱分析、免疫印迹和蛋白质芯片技术。

2. 甲基化修饰：蛋白质甲基化是通过向蛋白质上的氮、氧或硫原子添加甲基基团而实现的修饰。

甲基化修饰可以调节蛋白质的稳定性、活性和亲和性。

常用的甲基化修饰检测方法有质谱分析、甲基化特异性抗体和免疫荧光染色。

3. 乙酰化修饰：蛋白质乙酰化是通过向蛋白质上的赖氨酸残基添加乙酰基团而实现的修饰。

乙酰化修饰可以调节蛋白质的稳定性、转录活性和DNA结合能力。

常用的乙酰化修饰检测方法包括质谱分析、乙酰化特异性抗体和酶活性检测。

二、蛋白质修饰检测技术1. 质谱分析：质谱分析是目前最常用的蛋白质修饰检测方法之一。

它通过测量蛋白质分子的质量和质荷比，可以鉴定和定量各种蛋白质修饰形式。

质谱分析的优点是高灵敏度和高分辨率，能够识别极低浓度的修饰产物。

2. 免疫印迹：免疫印迹是一种常用的蛋白质修饰检测技术，它利用特定抗体与目标修饰蛋白发生特异性结合，然后通过化学荧光或酶标记来检测修饰的蛋白质。

免疫印迹技术操作简便，可以同时检测多个修饰位点。

3. 蛋白质芯片技术：蛋白质芯片技术是一种高通量的蛋白质修饰检测技术。

它将多个蛋白质修饰位点的抗体固定在芯片上，然后通过与样品中的修饰蛋白发生特异性结合来进行检测。

蛋白质芯片技术可以同时检测大量的修饰位点，适用于高通量筛查和研究。

三、蛋白质修饰的应用1. 疾病诊断：蛋白质修饰在疾病诊断中发挥着重要作用。

蛋白质磷酸化调控网络的解析蛋白质磷酸化是一种重要的信号传导机制，通过磷酸化作用调控着细胞内的生物过程。

该调控网络不仅涉及细胞的生命周期、代谢调节等基本生物学进程，还在许多疾病的发生和发展中扮演着重要角色。

本文将对蛋白质磷酸化调控网络进行解析，探讨其机制和功能。

一、蛋白质磷酸化的基本机制蛋白质磷酸化是指通过激酶将磷酸基团（PO4）与蛋白质的亚氨基酸残基（如丝/苏氨酸、酪氨酸和酪氨酸等）结合，形成磷酸酯键的化学反应。

这一过程由蛋白激酶和蛋白磷酸酶共同调控，激酶负责催化磷酸基团的添加，而磷酸酶则负责去除磷酸基团，以实现对蛋白质活性的调节。

二、磷酸化调控网络的组成磷酸化调控网络是由激酶、底物蛋白质以及与其相互作用的调控因子等组成的复杂网络系统。

激酶是磷酸化调控网络中的核心部分，它可以通过磷酸化作用改变底物蛋白质的结构和功能。

底物蛋白质则是激酶作用的对象，它们通过与激酶结合，实现蛋白质活性的调节。

此外，还存在一些调控因子，它们可以调节激酶和底物蛋白质之间的相互作用，进一步调控磷酸化信号传导的过程。

三、磷酸化调控网络的功能磷酸化调控网络在细胞内发挥着多种功能，包括但不限于以下几个方面：1. 信号传导：磷酸化调控网络可以传递细胞内外的信号，从而调节细胞的应激反应和生物学过程。

例如，在细胞应激中，磷酸化状态的改变可以引发复杂的信号级联反应，影响细胞的增殖、分化和凋亡等。

2. 代谢调节：磷酸化调控网络可以参与调节细胞的代谢过程。

例如，在糖代谢中，磷酸化调控网络可以通过控制关键酶的活性，调节糖的合成和分解，维持细胞内的能量平衡。

3. 细胞周期：磷酸化调控网络在细胞周期中起着至关重要的作用。

通过改变细胞周期蛋白的磷酸化状态，磷酸化调控网络可以调节细胞的有丝分裂和有丝分裂等过程，保证细胞的正常生长和分裂。

4. 疾病发生与发展：磷酸化调控网络在疾病的发生和发展中起着重要作用。

例如，在肿瘤细胞中，磷酸化调控网络的异常激活会导致细胞的异常增殖和转移，进而促进肿瘤的形成。

蛋白质修饰与功能分析蛋白质是生物体中最为重要的生化分子之一，它们在细胞内参与了许多关键的生物过程。

然而，蛋白质本身的功能并非一成不变的，而是通过修饰来实现可调控性。

蛋白质修饰是指对蛋白质分子结构的化学改变，从而调节蛋白质的活性、稳定性以及相互作用等。

本文将探讨常见的蛋白质修饰类型及其在功能分析中的意义。

一、磷酸化修饰磷酸化修饰是蛋白质修饰中最常见的一类，它通过在蛋白质上加上一个磷酸基团来改变蛋白质的电荷状态。

这种修饰可通过激酶酶与磷酸酶酶进行平衡，从而调节蛋白质的功能。

磷酸化修饰可影响蛋白质的酶活性、亲和力以及稳定性等方面的功能。

在功能分析中，磷酸化修饰可通过质谱分析等技术来鉴定。

磷酸化位点的识别可以帮助我们理解蛋白质的功能，并揭示某些疾病发生机制中的关键蛋白质修饰事件。

二、糖基化修饰糖基化修饰指的是将糖分子连接到蛋白质的氨基酸上，形成糖链。

这种修饰广泛存在于细胞表面的蛋白质上，起到了识别和相互作用的重要作用。

糖基化修饰能够影响蛋白质的稳定性、活性以及在细胞内的位置。

功能分析中的糖基化修饰研究一般通过质谱等技术来鉴定特定的糖链组成，并进一步研究其在细胞信号传导和疾病发展中的相关作用。

三、乙酰化修饰乙酰化修饰是通过将乙酰基团添加到蛋白质的赖氨酸残基上而实现的。

这种修饰可以调节蛋白质的转录活性、稳定性以及相互作用等。

乙酰化修饰在转录因子的活性调节和染色质结构的变化中起到重要作用。

在功能分析中，乙酰化修饰可通过质谱和抗体识别等方法进行检测。

研究乙酰化修饰对特定蛋白质的影响，有助于我们更好地理解细胞核内的基因调控机制。

四、脂肪酰化修饰脂肪酰化修饰是通过将脂肪酰基团连接到蛋白质上的半胱氨酸残基实现的。

这种修饰可以影响蛋白质的细胞定位、稳定性以及蛋白质与膜的相互作用等。

脂肪酰化修饰在细胞信号传导和蛋白质定位中发挥着重要作用。

在功能分析中，脂肪酰化修饰的研究一般通过质谱和生物化学技术来鉴定特定脂肪酰化位点。

研究脂肪酰化修饰对蛋白质功能的影响有助于理解细胞信号传递和疾病发展的机制。

蛋白质磷酸化对细胞代谢的影响分析蛋白质磷酸化是一种常见的细胞后修饰方法，它可以通过添加磷酸基团来改变蛋白质的结构和功能。

此过程通常由磷酸化酶和激活基进行调节。

蛋白质磷酸化不仅在细胞信号传递中具有重要作用，还被证明对细胞代谢具有重要影响。

细胞代谢是指细胞内的所有化学反应，包括能量代谢、合成和分解等。

蛋白质磷酸化通过参与这些反应来影响细胞代谢。

首先，蛋白质磷酸化在细胞能量代谢中发挥着重要作用。

研究表明，许多代谢酶在磷酸化后会发生结构和功能改变，从而调节细胞代谢。

例如，通过磷酸化，肝糖原磷酸酶可以被激活，促进糖原降解，从而提供细胞所需能量。

另一方面，乳酸脱氢酶的磷酸化则可以被抑制，降低其产生乳酸的速率，从而避免细胞内产生过多的乳酸并减少乳酸蓄积。

其次，蛋白质磷酸化还能够调节合成和分解过程，进而影响细胞代谢。

在蛋白质合成过程中，磷酸化可以调节翻译起始因子和核糖体蛋白S6K1等酶的活性，进而影响蛋白质合成的速率和数量。

此外，许多代谢酶的合成也能够受到磷酸化的调节。

在蛋白质分解中，磷酸化可以调节自噬过程，以控制蛋白质降解的速率。

研究表明，蛋白质磷酸化在蛋白质代谢的平衡中发挥着重要作用。

第三，蛋白质磷酸化还可以通过调节信号通路来调节细胞代谢。

例如，紫杉醇等信号分子通常会磷酸化蛋白质，进而激活细胞内的信号通路，从而影响细胞代谢。

此外，许多代谢物也可以通过激活或抑制特定的磷酸化酶来调节自身代谢路径。

因此，蛋白质磷酸化在代谢反应通路中也具有重要的调节作用。

最后，需要指出的是，蛋白质磷酸化对细胞代谢的影响是非常复杂的。

在不同的细胞类型、环境和代谢状态下，磷酸化过程可能会引发不同的代谢调节机制。

因此，需要进行更多深入的研究来充分理解蛋白质磷酸化对细胞代谢的精细调节机制。

综上所述，蛋白质磷酸化对细胞代谢具有重要影响。

通过调节能量代谢、合成和分解等过程，以及信号通路的调节，它可以影响细胞内的代谢平衡。

深入了解和理解这一过程将有助于揭示疾病发展所涉及的代谢异常机制，并为未来的治疗和预防提供新的策略。

蛋白质的磷酸化与信号转导在细胞内，蛋白质磷酸化是一种常见的化学修饰方式，通过磷酸化作用，可以调控蛋白质的活性、位置、互作等特性，进而影响细胞内的信号转导过程。

本文将探讨蛋白质磷酸化与信号转导之间的关系，以及这种修饰机制对细胞功能的影响。

一、蛋白质磷酸化的概述蛋白质磷酸化是一种在细胞中广泛发生的化学修饰方式，通过将磷酸基团（PO4）结合到蛋白质分子的氨基酸残基上，改变蛋白质的性质和功能。

常见的磷酸化位点包括丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）残基。

磷酸化修饰是由蛋白激酶（protein kinase）催化的，而蛋白磷酸酶（protein phosphatase）则可以去除这些磷酸基团。

二、蛋白质磷酸化与信号转导信号转导是指细胞内外信号的传递与转导过程，确保细胞能够及时做出响应。

蛋白质的磷酸化在信号转导中起着重要的作用。

当外界刺激（如荷尔蒙、生长因子等）到达细胞表面受体时，会引起受体聚合或构象变化，进而激活相应的酪氨酸激酶。

此时，激酶会磷酸化特定的底物蛋白，从而传递信号并触发下游的生物效应。

蛋白质磷酸化的信号转导机制可以分为两类：直接激活型和级联激活型。

直接激活型机制中，磷酸化直接影响底物蛋白的功能，如激活或抑制其酶活性。

级联激活型机制中，磷酸化作用会导致一系列的修饰和调节步骤，进而介导信号传导到细胞内的不同部位。

三、蛋白质磷酸化调控的生物效应蛋白质磷酸化的调控可以影响多种生物效应，包括细胞周期调控、基因转录调节、细胞凋亡、细胞增殖等。

例如，细胞增殖的调控往往伴随着信号转导通路的激活，而蛋白质的磷酸化是这一过程中不可或缺的关键步骤。

磷酸化修饰可以激活或抑制蛋白质的酶活性，从而介导细胞周期的进行。

另外，蛋白质磷酸化还可以调节蛋白质的亚细胞定位和相互作用。

磷酸化作用可以导致蛋白质结构的变化，从而影响蛋白质的定位和与其他蛋白质的相互作用。

这种调控方式在细胞信号转导通路中起着至关重要的作用，确保蛋白质在特定的细胞区域发挥正确的功能。

２０２０年３月Ｖｏｌ．３８Ｎｏ．３Ｍａｒｃｈ２０２０ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ２７８ ２８６庆祝２０２０年国际劳动妇女节色谱行业女学者专刊㊃专论与综述ＤＯＩ：１０．３７２４／ＳＰ．Ｊ．１１２３．２０１９．０９０１５收稿日期：２０１９⁃０９⁃１２∗通讯联系人．Ｔｅｌ：（０４１１）８４３７９７２０，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｌｉｈｕａｚｈａｎｇ＠ｄｉｃｐ．ａｃ．ｃｎ．基金项目：国家自然科学基金（２１５０５１３３，９１７５３１１０）．Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｉｔｅｍ：ＮａｔｉｏｎａｌＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎａ（Ｎｏｓ．２１５０５１３３，９１７５３１１０）．Ｎ⁃磷酸化修饰蛋白质的富集和鉴定方法胡晔晨１，２，㊀江㊀波１，㊀张丽华１∗，㊀张玉奎１（１．中国科学院分离分析化学重点实验室，中国科学院大连化学物理研究所，辽宁大连１１６０２３；２．中国科学院大学，北京１００４９）摘要：蛋白质磷酸化修饰在细胞的信号转导㊁代谢㊁发育等生命过程中发挥着重要作用㊂除了研究较为透彻的发生在丝氨酸㊁苏氨酸和酪氨酸侧链羟基的Ｏ⁃磷酸化修饰之外，近年来，发生在组氨酸㊁精氨酸和赖氨酸侧链氨基的Ｎ⁃磷酸化修饰受到了越来越广泛的关注㊂然而，由于Ｎ⁃磷酸化修饰具有独特的Ｐ－Ｎ键结构，导致其化学稳定性差㊂尤其是在Ｏ⁃磷酸化肽段富集常用的酸性条件下，Ｎ⁃磷酸化极易丢失㊂因此，目前对Ｎ⁃磷酸化蛋白质的研究仍处于初始阶段㊂该文针对蛋白质Ｎ⁃磷酸化修饰的特点㊁富集和鉴定方法进行了综述，并对其发展前景进行了展望㊂关键词：蛋白质Ｎ⁃磷酸化修饰；富集；检测；综述中图分类号：Ｏ６５８㊀㊀㊀文献标识码：Ａ㊀㊀㊀文章编号：１０００⁃８７１３（２０２０）０３⁃０２７８⁃０９ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔａｎｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒＮ⁃ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓＨＵＹｅｃｈｅｎ１，２，ＪＩＡＮＧＢｏ１，ＺＨＡＮＧＬｉｈｕａ１∗，ＺＨＡＮＧＹｕｋｕｉ１（１．ＣＡＳＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＳｅｐａｒａｔｉｏｎＳｃｉｅｎｃｅｓｆｏｒＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＤａｌｉａｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣｈｅｍｉｃａｌＰｈｙｓｉｃｓ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｄａｌｉａｎ１１６０２３，Ｃｈｉｎａ；２．ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００４９，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｒｏｔｅｉｎｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｐｌａｙｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｖａｒｉｏｕｓｌｉｆｅｐｒｏｃｅｓｓｅｓ，ｓｕｃｈａｓｓｉｇｎａｌｉｎｇ，ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，ａｎｄｇｒｏｗｔｈ．Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎｔｏｔｈｅｗｅｌｌ⁃ｋｎｏｗｎＯ⁃ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈｏｃｃｕｒｓｏｎｓｅｒｉｎｅ，ｔｈｒｅｏｎｉｎｅａｎｄｔｙｒｏｓｉｎｅｓｉｄｅｃｈａｉｎｓ，Ｎ⁃ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ，ｏｃｃｕｒｒｉｎｇｏｎｈｉｓｔｉ⁃ｄｉｎｅ，ａｒｇｉｎｉｎｅａｎｄｌｙｓｉｎｅｓｉｄｅｃｈａｉｎｓ，ｈａｓａｔｔｒａｃｔｅｄｍｕｃｈａｔｔｅｎｔｉｏｎ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｄｕｅｔｏｔｈｅｃｈｅｍ⁃ｉｃａｌｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆＮ⁃ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ，ｔｈｅｓｔｕｄｉｅｓｏｎｉｔａｒｅｓｔｉｌｌｉｎｔｈｅｎａｓｃｅｎｔｓｔａｇｅ．Ｉｎｔｈｉｓｒｅｖｉｅｗ，ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔａｎｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｐｒｏｔｅｉｎＮ⁃ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎａｒｅｒｅｖｉｅｗｅｄ，ａｎｄｆｕｔｕｒｅｒｅｓｅａｒｃｈｉｎｔｈｉｓｆｉｅｌｄｉｓｐｒｏｓｐｅｃｔｅｄ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｐｒｏｔｅｉｎＮ⁃ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ；ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ；ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ；ｒｅｖｉｅｗ㊀㊀自１９０６年被首次报道以来，蛋白质磷酸化修饰作为关键调节因子受到了越来越广泛的关注［１，２］㊂到目前为止，发现约有３０％的人类蛋白质可能在某些时刻被磷酸化，约５００种蛋白激酶和少量的蛋白磷酸酶调节着磷酸化过程［３］㊂同时，蛋白质的磷酸化能够影响诸多生理过程，包括免疫反应㊁内分泌作用㊁神经机制和行为㊁胃肠道行为和肌肉骨骼调节等［４］㊂此外，由于激酶或磷酸酶突变导致的异常磷酸化会引起一些信号通路的异常，成为某些疾病发生的诱因［１，５］㊂㊀㊀除了众所周知的蛋白质Ｏ⁃磷酸化修饰，即磷酸化发生在丝氨酸（ｐＳｅｒ）㊁苏氨酸（ｐＴｈｒ）和酪氨酸（ｐＴｙｒ）的侧链羟基上外，还有一类发生在碱性氨基酸 组氨酸（ｐＨｉｓ）㊁精氨酸（ｐＡｒｇ）和赖氨酸（ｐＬｙｓ）的侧链氨基上，称为Ｎ⁃磷酸化修饰［６］㊂由于其在信号转导方面发挥重要的生物学功能，越来越受到人们的关注［７］㊂然而，由于其特殊的化学不稳定性质，目前针对蛋白质Ｎ⁃磷酸化修饰的研究仍㊀第３期胡晔晨，等：Ｎ⁃磷酸化修饰蛋白质的富集和鉴定方法处于初级阶段㊂本文针对蛋白质Ｎ⁃磷酸化修饰的特性与功能，以及富集和鉴定方法进行了综述㊂１㊀蛋白质Ｎ⁃磷酸化修饰的特性与功能１．１㊀蛋白质Ｎ⁃磷酸化修饰结构及其化学性质㊀㊀蛋白质中发生Ｎ⁃磷酸化修饰氨基酸的化学结构如图１所示㊂与Ｏ⁃磷酸化修饰中的Ｐ－Ｏ键相比，Ｎ⁃磷酸化修饰中的Ｐ－Ｎ键水解的吉布斯自由能（ΔＧʎ）较高㊂例如ｐＨｉｓ的氨基磷酸酯键水解释放的能量（ΔＧʎ为－１２ ０ －１３ ０ｋｃａｌ／ｍｏｌ）约为ｐＳｅｒ㊁ｐＴｈｒ或ｐＴｙｒ的磷酸酯能量（ΔＧʎ为－６ ５ －９ ５ｋｃａｌ／ｍｏｌ）的两倍［８，９］，因此热力学稳定性较差㊂此外，氨基磷酸酯在动力学上也不稳定㊂氮原子的孤电子对和磷酰胺π键重叠较少，Ｐ－Ｎ键不能形成像Ｐ－Ｏ键一样稳定的电子离域结构，因此在酸性条件下Ｐ－Ｎ键的氮的质子化促进了磷酰基的解离，从而容易发生去磷酸化［１０，１１］㊂Ｎ⁃磷酸化修饰的不稳定性给其分析带来了巨大的挑战㊂图１㊀蛋白质Ｎ⁃磷酸化修饰的化学结构Ｆｉｇ．１㊀ＣｈｅｍｉｃａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎＮ⁃ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ１．２㊀蛋白质Ｎ⁃磷酸化修饰的发现及其生物学功能㊀㊀在蛋白质Ｎ⁃磷酸化修饰中，ｐＨｉｓ是研究最为成熟的㊂根据咪唑环上磷酸化位置的不同，ｐＨｉｓ具有１⁃ｐＨｉｓ和３⁃ｐＨｉｓ两种异构体㊂Ｂｏｙｅｒ等［１２，１３］最先在大鼠肝线粒体中发现了ｐＨｉｓ蛋白质㊂尽管在原核细胞中ｐＨｉｓ修饰的丰度（约６％）高于ｐＴｙｒ（约１％）［８，１４，１５］，但哺乳动物中有关ｐＨｉｓ的报道较少㊂哺乳动物的第一个磷酸化组氨酸磷酸酶直到２００２年才被鉴定［１６，１７］㊂现有研究表明，ｐＨｉｓ在细菌㊁真菌和植物中的双组分和多组分磷酸信号传导途径中起主要作用［８，１８，１９］㊂随着生物化学和质谱技术的发展，人们发现ｐＨｉｓ对哺乳动物很多细胞生命过程，如信号传导㊁染色质组装和离子传导等，都有重要影响㊂目前已知ＮＭＥ１和ＮＭＥ２是哺乳动物的两个ｐＨｉｓ激酶［２０］，而ＬＨＰＰ是对应的ｐＨｉｓ磷酸酶［２１］㊂㊀㊀与ｐＨｉｓ类似，ｐＡｒｇ主要存在于细菌等原核生物中㊂在１９９４年对蛋白质精氨酸激酶ＭｃｓＢ进行分离和鉴定后，Ｗａｋｉｍ等［２２］首次证实了原核生物中ｐＡｒｇ的存在㊂２００９年，Ｃｌａｕｓｅｎ等［２３］发现ＭｃｓＢ在枯草芽孢杆菌转录调节中具有重要作用㊂随后，最初被认为是ｐＴｙｒ磷酸酶的ＹｗｌＥ被发现为ｐＡｒｇ磷酸酶，在细菌和黑腹果蝇ｐＡｒｇ调节中发挥作用［２３－２５］㊂最新研究表明，ｐＡｒｇ是受损原核蛋白诱导蛋白水解的标记物［２６］㊂然而，ＭｃｓＢ在真核生物中的作用尚未完全阐明［２７］㊂㊀㊀相比于ｐＨｉｓ和ｐＡｒｇ，ｐＬｙｓ的研究相对较少，因此它的生物学意义仍然不明确㊂到目前为止，ｐＬｙｓ仅在再生大鼠肝脏中的组蛋白Ｈ１上发现［２８］㊂研究人员从活细胞中分离出几种激酶和磷酸酶，并且暗示它们对赖氨酸的磷酸化起到调节作用［２９－３１］㊂由于具有相似的化学性质和稳定性，因此推测ｐＬｙｓ可能具有与ｐＨｉｓ和ｐＡｒｇ类似的作用㊂㊀㊀综上所述，尽管蛋白质Ｎ⁃磷酸化在原核生物中的功能报道较多，但目前在哺乳动物中的研究仍亟待深入㊂２㊀Ｎ⁃磷酸化蛋白质／肽段的富集方法㊀㊀由于生物样本中蛋白质Ｎ⁃磷酸化的丰度低，质谱信号易受高丰度组分抑制［３２］，因此对Ｎ⁃磷酸化蛋白质／肽段进行有效富集已成为提高其检测灵敏度的必要和关键步骤［３３］㊂目前，Ｎ⁃磷酸化蛋白质／肽段的富集方法主要包括抗体法㊁固定化金属亲和色谱法和色谱保留时间差异法等㊂２．１㊀抗体法㊀㊀与Ｏ⁃磷酸化蛋白质／肽段不同，抗体法是富集Ｎ⁃磷酸化蛋白质／肽段最常用的方法㊂主要原因是，抗体⁃抗原的特异性结合可以在温和条件下实现，不会破坏Ｎ⁃磷酸化修饰㊂然而，与其他抗体相比，获得Ｎ⁃磷酸化氨基酸的抗体十分困难㊂这是因为如果利用Ｎ⁃磷酸化氨基酸本身或含有Ｎ⁃磷酸化氨基酸的肽段作为抗原，它们在注射到动物体内后，在溶酶体加工过程中会被快速去磷酸化［１０，１１］㊂因此，研究人员探索了利用替代抗原表位来获得可以与Ｎ⁃磷酸化氨基酸交叉反应的抗体［３４］㊂２．１．１㊀抗ｐＨｉｓ抗体㊀㊀最近，研究人员合成了ｐＨｉｓ的稳定类似物［３５，３６］，用其代替ｐＨｉｓ注射到动物体内，以实现免㊃９７２㊃色谱第３８卷疫反应，获得抗ｐＨｉｓ抗体［３７］㊂㊀㊀Ｋｅｅ等［３８］分别合成了三唑类化合物１和２作为３⁃和１⁃ｐＨｉｓ类似物（见图２ａ）㊂密度泛函理论（ＤＦＴ）计算表明１与３⁃ｐＨｉｓ的结构匹配，但１中额外的氮和孤对电子周围的表面电位与３⁃ｐＨｉｓ的具有差异［３９］㊂将两种类似物通过ＳＰＰＳ方法合成于肽段中，并与ＫＬＨ蛋白结合后用于抗体的制备［３８］㊂受到单独使用半抗原产生ｐＴｙｒ抗体工作的启发，Ｋｅｅ等［４０］通过使用连接头将三唑基乙胺３与ＫＬＨ结合来产生抗体（见图２ａ）；纯化的抗体可以用于检测各种已知的ｐＨｉｓ肽段，但是通过ＥＬＩＳＡ和斑点印迹实验观察到，其与ｐＴｙｒ具有显著的交叉反应［４０］㊂该团队将这个抗体应用在Ｅ．ｃｏｌｉ裂解液中ｐＨｉｓ蛋白质的富集中，从两种培养条件下（甘油和甘露醇）鉴定到１６个ｐＨｉｓ位点［４１］，并发现这些蛋白质在大肠杆菌的代谢和信号转导中发挥重要作用图２㊀（ａ）ｐＨｉｓ的类似物与（ｂ）３种合成肽文库的结构，其中Ｈｉｓ或稳定的ｐＨｉｓ类似物（６或７）被随机地插入中性氨基酸（丙氨酸和甘氨酸）中Ｆｉｇ．２㊀（ａ）ＡｎａｌｏｇｕｅｓｏｆｐＨｉｓａｎｄ（ｂ）ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｏｆｔｈｅｔｈｒｅｅｓｙｎｔｈｅｔｉｃｐｅｐｔｉｄｅｌｉｂｒａｒｉｅｓｕｓｅｄｉｎｗｈｉｃｈｅｉｔｈｅｒＨｉｓｏｒａｓｔａｂｌｅｐＨｉｓｍｉｍｅｔｉｃ（６ｏｒ７）ｉｓｆｌａｎｋｅｄｂｙｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，ｎｅｕｔｒａｌａｍｉｎｏａｃｉｄｓ（ａｌａｎｉｎｅａｎｄｇｌｙｃｉｎｅ）（见图３）㊂然而，由于该抗体富集选择性有限，且鉴定方法依赖于ＭＳ的中性丢失信息，因此导致ｐＨｉｓ肽段的鉴定数目较少㊂㊀㊀随后，Ｋｅｅ等［３９］报道了采用吡唑乙胺４作为３⁃ｐＨｉｓ类似物（见图２ａ）制备第二代ｐＨｉｓ抗体：ＤＦＴ计算表明，吡唑类似物４不仅与３⁃ｐＨｉｓ结构匹配，而且电子结构也匹配；发现纯化的多克隆抗体检测ｐＨｉｓ的响应远远高于ｐＴｙｒ；他们将此多克隆抗体用于检测各种体外ｐＨｉｓ蛋白质，包括ＰＧＡＭ１㊁哺乳动物组蛋白Ｈ４和ＰｔｓＩ㊂同时，Ｌｉｌｌｅｙ等［４２］报道了戊二醛接头与吡喃氨基酸５结合的抗体（见图２ａ）；发现这种多克隆抗体对ｐＨｉｓ的响应同样远远高于ｐＴｙｒ，并将抗体成功用于检测免疫沉淀蛋白质Ｇβ和来自ＨＢＥ细胞的ＮＤＰＫ⁃Ａ／Ｂ㊂㊀㊀２０１５年，Ｆｕｈｓ等［４３］制备出抗ｐＨｉｓ的单克隆抗体㊂他们将６和７分别添加进中性肽库中形成两类多肽抗原（见图２ｂ），并结合ＫＬＨ蛋白来引起免疫反应㊂免疫印迹分析显示，这两种抗体能够分别特㊃０８２㊃㊀第３期胡晔晨，等：Ｎ⁃磷酸化修饰蛋白质的富集和鉴定方法图３㊀ｐＨｉｓ肽段的富集和鉴定流程图［４１］Ｆｉｇ．３㊀ＦｌｏｗｃｈａｒｔｏｆｔｈｅｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐＨｉｓｐｅｐｔｉｄｅｓ［４１］ＣＩＤ：ｃｏｌｌｉｓｉｏｎｉｎｄｕｃｅｄｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ．异性地识别３⁃和１⁃ｐＨｉｓ而不产生交叉反应［４３］㊂他们将该单克隆抗体用于哺乳动物全细胞裂解物的蛋白质印迹和ｐＨｉｓ蛋白质富集，鉴定到了包括ＮＭＥ家族ＰＧＡＭ㊁ＳＣＳ㊁ＡＣＬＹ等重要的ｐＨｉｓ蛋白质［４３］㊂然而，由于未采用ＬＣ⁃ＭＳ／ＭＳ进行鉴定，鉴定到的ｐＨｉｓ蛋白质数目较少㊂图４㊀抗ｐＡｒｇ抗体的开发策略［４５］Ｆｉｇ．４㊀Ｓｔｒａｔｅｇｙｔｏｄｅｖｅｌｏｐａｎｔｉ⁃ｐＡｒｇａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ［４５］ＫＬＨ：ｋｅｙｈｏｌｅｌｉｍｐｅｔｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ．２．１．２㊀抗ｐＡｒｇ抗体㊀㊀相对于抗ｐＨｉｓ抗体，由于Ａｒｇ具有更加柔性的侧链，针对抗ｐＡｒｇ抗体的研究较少㊂Ｆｕｈｒｍａｎｎ等［４４］采用体外噬菌体展示方法产生靶向含ｐＡｒｇ肽段的抗体㊂虽然这种抗体可用于重组蛋白的体外研究，但它对ｐＡｒｇ的低亲和力阻碍了其在细胞研究中的应用㊂为了解决这个问题，并获得高亲和力的ｐＡｒｇ特异性抗体，该团队［４５］合成了酸稳定的ｐＡｒｇ类似物ＰＯ３⁃ａｍｉｄｉｎｅ和ＳＯ３⁃ａｍｉｄｉｎｅ（见图４），进而制备了不依赖序列的高亲和力抗ｐＡｒｇ抗体，并使用这种抗体检测细胞裂解液中的两种ｐＡｒｇ蛋白 ＣｌｐＣ和ＧｒｏＥＬ㊂同样，赵玉芬院士团队［４６］也合成了类似的分子，用于ｐＡｒｇ抗体的制备㊂㊀㊀虽然抗体法是目前最经典的Ｎ⁃磷酸蛋白质／肽段富集方法，但是也存在许多问题㊂除了抗体种类少和价格昂贵之外，更重要的是它们具有肽段序列偏向性，只对某一类Ｎ⁃磷酸化具有识别作用㊂此外，目前针对ｐＬｙｓ的抗体尚未见报道㊂这些都限制了其在规模化Ｎ⁃磷酸化蛋白质研究中的引用［４７］㊂２．２㊀固定化金属离子亲和色谱㊀㊀固定化金属离子亲和色谱（ＩＭＡＣ）将金属离子通过与配体配位的方式固定在基质上，再通过金属离子与磷酸根的特异性结合形成稳定的复合物，最后以竞争性洗脱的方式实现含磷酸根分子的富集㊂因此，ＩＭＡＣ材料不仅被广泛用于Ｏ⁃磷酸化肽的富集，而且也被尝试用于Ｎ⁃磷酸化肽的富集㊂Ｍｕｉｍｏ㊃１８２㊃色谱第３８卷等［４８］用含Ｆｅ３＋和Ｃａ２＋的ＩＭＡＣ材料富集ｐＨｉｓ膜联蛋白Ａ１，但在ｐＨ５ ０的条件下选择性有待提高㊂Ｎａｐｐｅｒ等［４９］利用含Ｃｕ２＋的ＩＭＡＣ材料从大肠杆菌裂解液中选择性富集到了含有ｐＨｉｓ的ＨＰｒ蛋白㊂最近，Ｐｏｔｅｌ等［５０］利用Ｆｅ３＋⁃ＩＭＡＣ亲和柱，在ｐＨ２ ３的弱酸条件下从大肠杆菌中富集到了１３５个高可信的ｐＨｉｓ位点，是目前报道的最大的细菌ｐＨｉｓ数据集㊂然而，由于在ｐＨ２ ３的条件ｐＬｙｓ蛋白质的磷酸根更易脱落，因此对该类蛋白质的富集效率很低㊂㊀㊀目前，基于ＩＭＡＣ的Ｎ⁃磷酸化蛋白质／肽段的富集方面仍存在挑战㊂这是由于该方法需要在酸性条件下富集，因此会导致在酸性条件下不稳定的Ｎ⁃磷酸化蛋白质／肽段易发生水解而影响富集效率㊂因此，亟须发展能够在中性条件下富集Ｎ⁃磷酸化蛋白质／肽段的方法㊂图５㊀（ａ）ＲｅＤＤ策略的流程图和（ｂ）ｐＬｙｓ肽段发生的化学过程［５２］Ｆｉｇ．５㊀（ａ）Ｆｌｏｗｃｈａｒｔｏｆｒｅｔｅｎｔｉｏｎｔｉｍｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｃｏｍｂｉｎｉｎｇｄｉｍｅｔｈｙｌｌａｂｅｌｉｎｇ（ＲｅＤＤ）ｓｔｒａｔｅｇｙａｎｄ（ｂ）ｃｈｅｍｉｃａｌｐｒｏｃｅｓｓｏｆｐＬｙｓｐｅｐｔｉｄｅ［５２］ＦＡ：ｆｏｒｍｉｃａｃｉｄ；ＳＣＸ：ｓｔｒｏｎｇｃａｔｉｏｎｅｘｃｈａｎｇｅｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．２．３㊀基于色谱保留时间差异的富集方法㊀㊀针对ｐＬｙｓ丰度低㊁目前缺乏富集抗体的问题，我们根据ｐＬｙｓ肽段和其相应的去磷酸化肽段的疏水性不同，进而在高ｐＨ反相色谱［５１］保留能力上存在的差异，发展了一种ｐＬｙｓ肽段的富集方法（简称ＲｅＤＤ，见图５）［５２］㊂此外，还结合二甲基化标记来控制鉴定结果的假阳性㊂利用该方法，可以从１００００００倍质量比干扰肽段的存在下实现ｐＬｙｓ肽段的选择性富集㊂此外，还从ＨｅＬａ细胞裂解液中富集到１００个ｐＬｙｓ蛋白质㊂Ｇｅｎｅｏｎｔｏｌｏｇｙ（ＧＯ）分析表明，大多数ｐＬｙｓ蛋白质在代谢调节㊁细胞定位㊁ＲＮＡ加工等功能方面高度富集㊂此外，这些ｐＬｙｓ蛋白质还参与细胞代谢㊁分解代谢和调节ＲＮＡ加工等重要的生物学过程㊂㊀㊀为提高样品富集的回收率，我们进一步利用ｐＬｙｓ肽段的酸不稳定性，发展了一种可断裂疏水性衍生方法（简称ＨＣＤ），实现了ｐＬｙｓ肽段的选择性富集［５３］：如图６所示，经过酸处理后，ｐＬｙｓ肽段产生新的侧链仲氨基；对其用可断裂疏水性衍生试剂（Ｄｅｃ⁃ｄｉｓｕｌｆ⁃ＮＨＳ）衍生后，利用反相色谱进行富集；最后利用二硫键还原反应将其还原断裂，并采用ｎａｎｏＬＣ⁃ＭＳ／ＭＳ进行鉴定；此外，我们还结合二甲基化标记和针对错误位点的 排除策略 来控制假阳性率㊂利用该方法，从大肠杆菌中鉴定到３９个ｐＬｙｓ位点，对应３５个ｐＬｙｓ蛋白质㊂这些蛋白质在核糖体㊁糖酵解／糖异生和次生代谢产物的生物合成中发挥重要作用，并参与了分解代谢㊁代谢㊁物种起源和生物合成等重要途径㊂㊀㊀综上所述，将不稳定的ｐＬｙｓ肽段转化成稳定的㊁具有特殊标记的肽段，并结合ＨＰＬＣ的高分辨率分离，不依赖抗体即可实现ｐＬｙｓ肽段的选择性富集和鉴定㊂㊃２８２㊃㊀第３期胡晔晨，等：Ｎ⁃磷酸化修饰蛋白质的富集和鉴定方法图６㊀（ａ）ＣＨＤ策略的流程图和（ｂ）ｐＬｙｓ肽段发生的化学过程［５３］Ｆｉｇ．６㊀（ａ）Ｆｌｏｗｃｈａｒｔｏｆｃｌｅａｖａｂｌｅｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ（ＣＨＤ）ｓｔｒａｔｅｇｙａｎｄ（ｂ）ｃｈｅｍｉｃａｌｐｒｏｃｅｓｓｏｆｐＬｙｓｐｅｐｔｉｄｅ［５３］Ｄｅｃ⁃ｄｉｓｕｌｆ⁃ＮＨＳ：２，５⁃ｄｉｏｘｏｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎ⁃１⁃ｙｌ⁃３⁃（ｄｅｃｙｌｄｉｓｕｌｆａｎｙｌ）ｐｒｏｐａｎｏａｔｅ；ＴＣＥＰ：ｔｒｉｓ（２⁃ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ．２．４㊀其他富集方法㊀㊀此外，还有一些研究者通过生物分子相互作用来实现Ｎ⁃磷酸化蛋白的有效富集㊂Ｈｏｆｍａｎｎ等［５４］报道了来自Ｓｒｃ激酶的ＳＨ２结构域可以与ｐＡｒｇ肽段结合（Ｋｄ＝５５０ʃ１５０μｍｏｌ／Ｌ），并通过进一步突变ＳＨ２结构域有望实现ｐＡｒｇ肽段的有效富集㊂Ｔｒｅｎ⁃ｔｉｎｉ等［５５］开发了ｐＡｒｇ磷酸酶ＹｗｌＥ的突变体，保留了对ｐＡｒｇ蛋白质的亲和力；将其用来富集枯草芽孢杆菌Δｙｗ１Ｅ细胞提取物中的ｐＡｒｇ蛋白质，发现ｐＡｒｇ蛋白质在原核细胞的信号传导方面发挥重要作用［５５］㊂但是，此方法只能用于ｐＡｒｇ蛋白质的特异性富集，而且ＹｗｌＥ突变体的制备较为繁琐㊂３㊀蛋白质Ｎ⁃磷酸化修饰检测技术㊀㊀蛋白质组学技术的发展为Ｎ⁃磷酸化修饰蛋白质／肽段的规模化鉴定提供了有力的工具㊂目前，Ｎ⁃磷酸化蛋白质／肽段的检测主要采用ＥＳＩ⁃ＭＳ／ＭＳ和ＭＡＬＤＩ⁃ＴＯＦＭＳ㊂此外，Ｐ３１ＮＭＲ也被用于Ｎ⁃磷酸化修饰的检测㊂３．１㊀ＥＳＩ⁃ＭＳ／ＭＳ㊀㊀目前，虽然利用ＥＳＩ⁃ＭＳ／ＭＳ来检测Ｏ⁃磷酸化修饰的方法已经发展得非常成熟，但是对于Ｎ⁃磷酸化修饰的检测依然存在很大的问题㊂主要原因不仅是在常规正离子模式下所需的酸性流动相会造成Ｎ⁃磷酸化修饰水解，而且在质谱检测中，Ｎ⁃磷酸化修饰更容易产生中性丢失而难以确定位点信息㊂此外，由于目前针对ｐＡｒｇ和ｐＬｙｓ蛋白质／肽段的有效富集方法较少，ＥＳＩ⁃ＭＳ／ＭＳ主要集中于针对ｐＨｉｓ的检测㊂３．１．１㊀ｐＨｉｓ肽段分析㊀㊀Ｍｅｄｚｉｈｒａｄｓｚｋｙ等［５６］发现在正离子检测模式下，利用ＥＳＩ⁃ＭＳ很少或几乎难以检测到ｐＨｉｓ肽段信号，只检测到其相应的去磷酸化的肽段；然而，在负离子模式下，完整的磷酸化肽段可以产生明显信号㊂此外，Ｋｌｅｉｎｎｉｊｅｎｈｕｉｓ等［５７］比较了不同的ＭＳ／ＭＳ碎裂方法，发现在抑制ｐＨｉｓ肽段信号的衰减和增强ｐＨｉｓ位点检测方面，电子捕获解离（ＥＣＤ）㊁电子脱离解离（ＥＤＤ）和电子转移解离（ＥＴＣ）优于碰撞诱导解离（ＣＩＤ），更适合于Ｎ⁃磷酸化肽段的鉴定㊂这主要是由于当ｐＨｉｓ邻近天冬氨酸残基时，ＣＩＤ会导致ｐＨｉｓ以Ｈ３ＰＯ４的形式损失磷酸基团㊂最近，Ｂｅｒｔｒａｎ⁃Ｖｉｃｅｎｔｅ等［５８］发现，ｐＬｙｓ在ＭＳ检测中会发生磷酸基团的气相转移，导致无法对磷酸化位点进行准确定位㊂㊀㊀Ｃｅｂｏ等［５９］利用ｐＨｉｓ和Ｈｉｓ之间的氘⁃氢交换（ＨＤＸ）速率差异，建立了基于ＭＳ／ＭＳ的ｐＨｉｓ肽段鉴定策略，发现对于具有ｐＨｉｓ的肽段测量的ＨＤＸ速率与未修饰的肽段相差约两个数量级，并且序列㊃３８２㊃色谱第３８卷对ＨＤＸ动力学的影响可以忽略不计㊂因此该方法可以被应用于在酸性条件下进行的基于ＬＣ⁃ＭＳ／ＭＳ的Ｎ⁃磷酸化位点分析中㊂３．１．２㊀ｐＨｉｓ蛋白质分析㊀㊀ＥＳＩ⁃ＭＳ／ＭＳ也是检测ｐＨｉｓ蛋白质的有效手段㊂Ｗｉｎｄ等［６０］对完整的重组Ｎ⁃磷酸化ＣｈｅＡ⁃Ｈ蛋白进行了ＩＣＰ⁃ＭＳ／ＭＳ分析㊂虽然ＭＳ／ＭＳ谱含有大量的ｙ㊁ｂ离子，然而无法确定Ｎ⁃磷酸化位点，但作者将有可能的位点缩小到３０残基和８４残基之间［６０］㊂尽管目前针对完整Ｎ⁃磷酸化蛋白质的检测鲜有报道，但是随着蛋白质组学 自上而下 策略的不断发展，相信未来基于ＥＳＩ⁃ＭＳ／ＭＳ的Ｎ⁃磷酸化蛋白质的检测方法会为Ｎ⁃磷酸化蛋白质的研究提供强有力的技术支撑㊂３．２㊀ＭＡＬＤＩ⁃ＴＯＦＭＳ㊀㊀ＭＡＬＤＩ⁃ＴＯＦＭＳ是检测标准Ｎ⁃磷酸化肽段的重要手段㊂常用的基质是α⁃氰⁃４⁃羟基肉桂酸（ＣＨＣＡ）㊁２，５⁃二羟基苯甲酸（ＤＨＢ）和介子酸（ＳＡ）㊂但是这些基质本身都显酸性，且在使用时还需加入０ １％（ｖ／ｖ）增强离子化效率，因此可能会使酸不稳定的Ｎ⁃磷酸化肽段水解㊂Ｇｏｍａｎ等［６１］使用２，６⁃二羟基苯乙酮和柠檬酸氢铵的混合物作为ＭＡＬＤＩ⁃ＴＯＦＭＳ的基质来研究不稳定的Ｎ⁃磷酸化肽段，发现与ＣＨＣＡ相比，该基质能够明显增强不稳定肽段的信号响应㊂Ｎａｐｐｅｒ等［６２］使用ＭＡＬＤＩ⁃ＴＯＦＭＳ分析了来自磷酸化ＨＰｒ的酶解产物，观察到正离子模式下ｐＨｉｓ的源后衰变现象，而在负离子模式中这种现象则少一些㊂在另一项研究中，Ａｔｔｗｏｏｄ及同事［６３］分析了具有ｐＨｉｓ的组蛋白Ｈ４的酶解产物，他们通过ＭＡＬＤＩ⁃ＴＯＦＭＳ观察到了其中的Ｎ⁃磷酸化肽段，并使用ＥＳＩ⁃ＭＳ／ＭＳ确定了磷酸化位点（Ｈ１８和Ｈ７５）㊂３．３㊀Ｐ３１ＮＭＲ㊀㊀尽管需要大量纯化的样品，Ｐ３１ＮＭＲ是能够利用化学位移区分ｐＨｉｓ异构体的主要方法之一㊂Ｌｅｃｒｏｉｓｅｙ等［６４］发现，磷酸化ＮＤＰＫ的Ｐ３１ＮＭＲ化学位移与任何已知的１⁃ｐＨｉｓ或３⁃ｐＨｉｓ的Ｐ３１ＮＭＲ化学位移均不匹配；ｐＨｉｓ残基的化学位移在天然（－２ ７２）和变性状态（－４ ２０）间也有很大差异，而１⁃ｐＨｉｓ肽段（Ｇｌｕ⁃ｐＨｉｓ⁃Ｇｌｙ，已知的ＮＤＰＫ磷酸化序列）与变性状态下的化学位移一致㊂上述结果说明，利用Ｐ３１ＮＭＲ化学位移的差别可以研究Ｎ⁃磷酸化氨基酸残基的不同状态㊂３．４㊀其他检测方法㊀㊀Ｗｅｉ和Ｍａｔｔｈｅｗｓ［６５］开发了一种基于膜的方法，用于检测ｐＨｉｓ；即在常规的激酶测定反应后进行温和的碱性水解，在高ｐＨ下将产物吸附到Ｎｙｔ⁃ｒａｎ纸上，在ｐＨ９条件下，通过液体闪烁计数测定纸上的放射性，并结合ｐＨｉｓ的酸不稳定性使其能够只针对ｐＨｉｓ进行检测㊂此外，Ｓｕｎ等［６６］开发了一种碘化标记方法：由于咪唑基团上的氢被磷酸基团取代，因此无法用碘来标记ｐＨｉｓ位点，而可以完全碘化未修饰的Ｈｉｓ，从而将两种组氨酸位点区分开㊂但由于以上这两种方法缺乏富集过程，因此Ｎ⁃磷酸化肽段受到非磷酸化肽段的严重干扰㊂此外，Ｗａｇ⁃ｎｅｒ和Ｖｕ［６７］通过薄层色谱从［γ⁃３１Ｐ］ＡＴＰ标记的ｐＨｉｓ蛋白质的碱水解产物中用放射自显影检测到１⁃和３⁃ｐＨｉｓ㊂有报道［６８］使用邻苯二甲醛对氨基酸进行衍生化，并在ｐＨ７ ２的聚合物基反相柱（Ｈａｍ⁃ｉｌｔｏｎＰＲＰ⁃１）上进行ＨＰＬＣ分离，使用１４ ３ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸钠，１ １％（ｖ／ｖ）四氢呋喃，６ ６％（ｖ／ｖ）乙腈的等度洗脱条件，可以完全区分１⁃ｐＨｉｓ㊁３⁃ｐＨｉｓ和ｐＡｒｇ㊂４㊀总结与展望㊀㊀本文综述了Ｎ⁃磷酸化蛋白质／肽段富集和鉴定方法的研究进展㊂通过合成稳定的Ｎ⁃磷酸化氨基酸类似物，可以开发出了一系列针对ｐＨｉｓ和ｐＡｒｇ的抗体，并实现相应类型的Ｎ⁃磷酸化蛋白质／肽段的富集㊂然而，由于ｐＬｙｓ结构更柔软，难以产生有效的免疫反应，因此针对ｐＬｙｓ的抗体仍未见报道㊂此外，基于ＩＭＡＣ材料和色谱保留时间差异的方法能够实现ｐＨｉｓ和ｐＬｙｓ肽段的有效富集㊂在检测方法中，由于ＭＳ具有高通量和高准确度的特点，在Ｎ⁃磷酸化蛋白质／肽段的检测中显示出巨大潜力㊂㊀㊀然而目前蛋白质Ｎ⁃磷酸化修饰的研究才刚刚起步，仍有很多问题亟须解决㊂首先，现有的富集方法难以实现中性条件下Ｎ⁃磷酸化蛋白质／肽段的富集，因此需要开发更温和高效的富集方法㊂第二，生物样本中存在相对高丰度的Ｏ⁃磷酸化蛋白质／肽段，会造成Ｎ⁃磷酸化蛋白质／肽段富集效率低㊁离子化效率低和位点定位不准确的问题，因此发展去除Ｏ⁃磷酸化蛋白质／肽段的方法是十分必要的㊂第三，在采用正离子模式ＭＳ情况下，常用的酸性流动相会造成Ｎ⁃磷酸化修饰一定程度的水解，因此亟须发展针对Ｎ⁃磷酸化肽段分离的流动相添加剂，或是㊃４８２㊃㊀第３期胡晔晨，等：Ｎ⁃磷酸化修饰蛋白质的富集和鉴定方法发展高效的负离子模式㊂最后，由于Ｎ⁃磷酸基团容易在ＭＳ碎裂时发生中性丢失，因此还需发展适合于Ｎ⁃磷酸化修饰鉴定的ＭＳ采集方法㊂对于新发现的Ｎ⁃磷酸化蛋白质，其功能尚未揭示，因此需要推进相关生物学研究㊂参考文献：［１］㊀ＷａｎＨ，ＴａｎｇＢ，ＬｉａｏＸ，ｅｔａｌ．ＣｅｌｌＤｅａｔｈＤｉｆｆｅｒ，２０１８，２５：９０４［２］㊀ＬｕＨ，ＳｈａｍａｎｎａＲＡ，ｄｅＦｒｅｉｔａｓＪＫ，ｅｔａｌ．ＮａｔＣｏｍｍｕｎ，２０１７，８（１）：２０３９［３］㊀ＣｏｈｅｎＰ．ＥｕｒＪＢｉｏｃｈｅｍ，２００１，２６８（１９）：５００１［４］㊀ＴａｒｒａｎｔＭＫ，ＣｏｌｅＰＡ．ＡｎｎｕＲｅｖＢｉｏｃｈｅｍ，２００９，７８：７９７［５］㊀ＷａｎｇＨ，ＮｉｃｏｌａｙＢＮ，ＣｈｉｃｋＪＭ，ｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，２０１７，５４６（７６５８）：４２６［６］㊀ＲｉｌｅｙＮＭ，ＣｏｏｎＪＪ．ＡｎａｌＣｈｅｍ，２０１６，８８（１）：７４［７］㊀ＨａｕｓｅｒＡ，ＰｅｎｋｅｒｔＭ，ＨａｃｋｅｎｂｅｒｇｅｒＣＰ．ＡｃｃＣｈｅｍＲｅｓ，２０１７，５０（８）：１８８３［８］㊀ＫｅｅＪＭ，ＭｕｉｒＴＷ．ＡＣＳＣｈｅｍＢｉｏｌ，２０１２，７（１）：４４［９］㊀ＦｕｈｓＳＲ，ＨｕｎｔｅｒＴ．ＣｕｒｒＯｐｉｎＣｅｌｌＢｉｏｌ，２０１７，４５：８［１０］㊀ＢｅｓａｎｔＰ，ＡｔｔｗｏｏｄＰ，ＰｉｇｇｏｔｔＭ．ＣｕｒｒＰｒｏｔｅｉｎＰｅｐｔＳｃ，２００９，１０（６）：５３６［１１］㊀ＡｔｔｗｏｏｄＰＶ，ＰｉｇｇｏｔｔＭＪ，ＺｕＸＬ，ｅｔａｌ．ＡｍｉｎｏＡｃｉｄｓ，２００７，３２（１）：１４５［１２］㊀ＤｅｌｕｃａＭ，ＢｏｙｅｒＰＤ，ＰｅｔｅｒＪＢ，ｅｔａｌ．ＢｉｏｃｈｅｍＺ，１９６３，３３８：５１２［１３］㊀ＰｅｔｅｒＪＢ，ＢｏｙｅｒＰＤ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，１９６３，２３８：１１８０［１４］㊀ＫｏｗｌｕｒｕＡ．ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２００２，６３（１２）：２０９１［１５］㊀ＴａｎＥＬ，ＢｅｓａｎｔＰＧ，ＡｔｔｗｏｏｄＰＶ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，４１（１２）：３８４３［１６］㊀ＫｌｕｍｐｐＳ，ＨｅｒｍｅｓｍｅｉｅｒＪ，ＳｅｌｋｅＤ，ｅｔａｌ．ＪＣｅｒｅｂＢｌｏｏｄＦｌｏｗＭｅｔａｂ，２００２，２２（１２）：１４２０［１７］㊀ＥｋＰ，ＰｅｔｔｅｒｓｓｏｎＧ，ＥｋＢ，ｅｔａｌ．ＥｕｒＪＢｉｏｃｈｅｍ，２００２，２６９（２０）：５０１６［１８］㊀ＢｏｙｅｒＰＤ，ＤｅｌｕｃａＭ，ＥｂｎｅｒＫＥ，ｅｔａｌ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，１９６２，２３７：ＰＣ３３０６［１９］㊀ＰｅｒｒｙＪ，ＫｏｔｅｖａＫ，ＷｒｉｇｈｔＧ．ＭｏｌＢｉｏｓｙｓｔ，２０１１，７（５）：１３８８［２０］㊀ＣａｉＸ，ＳｒｉｖａｓｔａｖａＳ，ＳｕｒｉｎｄｒａｎＳ，ｅｔａｌ．ＭｏｌＢｉｏｌＣｅｌｌ，２０１４，２５（８）：１２４４［２１］㊀ＨｉｎｄｕｐｕｒＳＫ，ＣｏｌｏｍｂｉＭ，ＦｕｈｓＳＲ，ｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，２０１８，５５５（７６９８）：６７８［２２］㊀ＷａｋｉｍＢＴ，ＡｓｗａｄＧＤ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，１９９４，２６９（４）：２７２２［２３］㊀ＦｕｈｒｍａｎｎＪ，ＳｃｈｍｉｄｔＡ，ＳｐｉｅｓｓＳ，ｅｔａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００９，３２４（５９３２）：１３２３［２４］㊀ＦｕｈｒｍａｎｎＪ，ＭｉｅｒｚｗａＢ，ＴｒｅｎｔｉｎｉＤＢ，ｅｔａｌ．ＣｅｌｌＲｅｐ，２０１３，３（６）：１８３２［２５］㊀ＥｌｓｈｏｌｚＡＫ，ＴｕｒｇａｙＫ，ＭｉｃｈａｌｉｋＳ，ｅｔａｌ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，２０１２，１０９（１９）：７４５１［２６］㊀ＴｒｅｎｔｉｎｉＤＢ，ＳｕｓｋｉｅｗｉｃｚＭＪ，ＨｅｕｃｋＡ，ｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，２０１６，５３９（７６２７）：４８［２７］㊀ＦｕｈｒｍａｎｎＪ，ＣｌａｎｃｙＫＷ，ＴｈｏｍｐｓｏｎＰＲ．ＣｈｅｍＲｅｖ，２０１５，１１５（１１）：５４１３［２８］㊀ＺｅｔｔｅｒｑｖｓｔＯ，ＥｎｇｓｔｒｏｍＬ．ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ，１９６７，１４１（３）：５２３［２９］㊀ＨｉｒａｉｓｈｉＨ，ＹｏｋｏｉＦ，ＫｕｍｏｎＡ．ＡｒｃｈＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓ，１９９８，３４９（２）：３８１［３０］㊀ＷｏｎｇＣ，ＦａｉｏｌａＢ，ＷｕＷ，ｅｔａｌ．ＢｉｏｃｈｅｍＪ，１９９３，２９６：２９３［３１］㊀ＳｍｔｉｈＤＬ，ＢｒｕｅｇｇｅｒＢＢ，ＨａｌｐｅｒｎＲＭ，ｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，１９７３，２４６（５４２８）：１０３［３２］㊀ＬｉｍＫＢ，ＫａｓｓｅｌＤＢ．ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ，２００６，３５４（２）：２１３［３３］㊀ＷａｎｇＺＧ，ＬｖＮ，ＢｉＷＺ，ｅｔａｌ．ＡＣＳＡｐｐｌＭａｔｅｒＩｎｔｅｒ，２０１５，７（１６）：８３７７［３４］㊀ＮｉＦ，ＦｕＣ，ＧａｏＸ，ｅｔａｌ．ＳｃｉＣｈｉｎａＣｈｅｍ，２０１５，５８（３）：３７４［３５］㊀ＭｃａｌｌｉｓｔｅｒＴＥ，ＨｏｌｌｉｎｓＪＪ，ＷｅｂｂＭＥ．ＢｉｏｃｈｅｍＳｏｃＴｒａｎｓ，２０１３，４１（４）：１０７２［３６］㊀ＫｅｅＪＭ，ＶｉｌｌａｎｉＢ，ＣａｒｐｅｎｔｅｒＬＲ，ｅｔａｌ．ＪＡｍＣｈｅｍＳｏｃ，２０１０，１３２（４１）：１４３２７［３７］㊀ＭａｋｗａｎａＭＶ，ＭｕｉｍｏＲ，ＪａｃｋｓｏｎＲＦＷ．ＬａｂＩｎｖｅｓｔ，２０１８，９８（３）：２９１［３８］㊀ＫｅｅＪＭ，ＶｉｌｌａｎｉＢ，ＣａｒｐｅｎｔｅｒＬＲ，ｅｔａｌ．ＪＡｍＣｈｅｍＳｏｃ，２０１０，１３２：１４３２７［３９］㊀ＫｅｅＪＭ，ＯｓｌｕｎｄＲＣ，ＣｏｕｖｉｌｌｏｎＡＤ，ｅｔａｌ．ＯｒｇＬｅｔｔ，２０１５，１７（２）：１８７［４０］㊀ＫｅｅＪＭ，ＯｓｌｕｎｄＲＣ，ＰｅｒｌｍａｎＤＨ，ｅｔａｌ．ＮａｔＣｈｅｍＢｉｏｌ，２０１３，９（７）：４１６［４１］㊀ＯｓｌｕｎｄＲＣ，ＫｅｅＪＭ，ＣｏｕｖｉｌｌｏｎＡＤ，ｅｔａｌ．ＪＡｍＣｈｅｍＳｏｃ，２０１４，１３６（３７）：１２８９９［４２］㊀ＬｉｌｌｅｙＭ，ＭａｍｂｗｅＢ，ＴｈｏｍｐｓｏｎＭＪ，ｅｔａｌ．ＣｈｅｍＣｏｍ⁃ｍｕｎ，２０１５，５１（３４）：７３０５［４３］㊀ＦｕｈｓＳＲ，ＭｅｉｓｅｎｈｅｌｄｅｒＪ，ＡｓｌａｎｉａｎＡ，ｅｔａｌ．Ｃｅｌｌ，２０１５，１６２（１）：１９８［４４］㊀ＦｕｈｒｍａｎｎＪ，ＭｉｅｒｚｗａＢ，ＴｒｅｎｔｉｎｉＤＢ，ｅｔａｌ．ＣｅｌｌＲｅｐ，２０１３，３（６）：１８３２［４５］㊀ＦｕｈｒｍａｎｎＪ，ＳｕｂｒａｍａｎｉａｎＶ，ＴｈｏｍｐｓｏｎＰＲ．ＡｎｇｅｗＣｈｅｍ，２０１５，１２７（４９）：１４９２８［４６］㊀ＯｕｙａｎｇＨ，ＦｕＣ，ＦｕＳ，ｅｔａｌ．ＯｒｇＢｉｏｍｏｌＣｈｅｍ，２０１６，１４（６）：１９２５［４７］㊀ＢｅｌｔｒａｎＬ，ＣｕｔｉｌｌａｓＰＲ．ＡｍｉｎｏＡｃｉｄｓ，２０１２，４３（３）：１００９［４８］㊀ＭｕｉｍｏＲ，ＨｏｒｎｉｃｋｏｖａＺ，ＲｉｅｍｅｎＣＥ，ｅｔａｌ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２０００，２７５（４７）：３６６３２［４９］㊀ＮａｐｐｅｒＳ，ＫｉｎｄｒａｃｈｕｋＪ，ＯｌｓｏｎＤＪ，ｅｔａｌ．ＡｎａｌＣｈｅｍ，２００３，７５：１７４１［５０］㊀ＰｏｔｅｌＣＭ，ＬｉｎＭＨ，ＨｅｃｋＡｌｂｅｒｔＪＲ，ｅｔａｌ．ＮａｔＭｅｔｈｏｄｓ，２０１８，１５：１８７［５１］㊀ＺｏｕＨＦ．ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，２０１０，２８（１）：１００邹汉法．色谱，２０１０，２８（１），１００［５２］㊀ＨｕＹ，ＷｅｎｇＹ，ＪｉａｎｇＢ，ｅｔａｌ．ＳｃｉＣｈｉｎａＣｈｅｍ，２０１９，６２（６）：７０８［５３］㊀ＨｕＹ，ＬｉＹ，ＧａｏＨ，ｅｔａｌ．ＡｎａｌＢｉｏａｎａｌＣｈｅｍ，２０１９，４１１（１８）：４１５９［５４］㊀ＨｏｆｍａｎｎＦＴ，ＬｉｎｄｅｍａｎｎＣ，ＳａｌｉａＨ，ｅｔａｌ．ＣｈｅｍＣｏｍ⁃ｍｕｎ，２０１１，４７（３７）：１０３３５［５５］㊀ＴｒｅｎｔｉｎｉＤＢ，ＦｕｈｒｍａｎｎＪ，ＭｅｃｈｔｌｅｒＫ，ｅｔａｌ．ＭｏｌＣｅｌｌＰｒｏ⁃ｔｅｏｍｉｃｓ，２０１４，１３（８）：１９５３［５６］㊀ＭｅｄｚｉｈｒａｄｓｚｋｙＫＦ，ＰｈｉｌｌｉｐｐｓＮＪ，ＳｅｎｄｅｒｏｗｉｃｚＬ，ｅｔａｌ．ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉ，１９９７，６（７）：１４０５［５７］㊀ＫｌｅｉｎｎｉｊｅｎｈｕｉｓＡＪ，ＫｊｅｌｄｓｅｎＦ，ＫａｌｌｉｐｏｌｉｔｉｓＢ，ｅｔａｌ．Ａｎａｌ㊃５８２㊃色谱第３８卷Ｃｈｅｍ，２００７，７９：７４５０［５８］㊀Ｂｅｒｔｒａｎ⁃ＶｉｃｅｎｔｅＪ，ＳｃｈüｍａｎｎＭ，ＨａｃｋｅｎｂｅｒｇｅｒＣＰＲ，ｅｔａｌ．ＡｎａｌＣｈｅｍ，２０１５，８７（１４）：６９９０［５９］㊀ＣｅｂｏＭ，ＫｉｅｌｍａｓＭ，ＡｄａｍｃｚｙｋＪ，ｅｔａｌ．ＡｎａｌＢｉｏａｎａｌＣｈｅｍ，２０１４，４０６（３０）：８０１３［６０］㊀ＷｉｎｄＭ，ＷｅｇｅｎｅｒＡ，ＫｅｌｌｎｅｒＲ，ｅｔａｌ．ＡｎａｌＣｈｅｍ，２００５，７７（７）：１９５７［６１］㊀ＪｅｆｆｒｅｙＪＧ，ＢｅｔｔｉｎａＬＦ，ＴｈｕｏｎｇＢＮ．ＲａｐｉｄＣｏｍｍｕｎＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍ，１９９６，１０：５２９［６２］㊀ＮａｐｐｅｒＳ，ＫｉｎｄｒａｃｈｕｋＪ，ＯｌｓｏｎＤＪＨ，ｅｔａｌ．ＡｎａｌＣｈｅｍ，２００３，７５（７）：１７４１［６３］㊀ＺｕＸＬ，ＢｅｓａｎｔＰＧ，ＩｍｈｏｆＡ，ｅｔａｌ．ＡｍｉｎｏＡｃｉｄｓ，２００７，３２（３）：３４７［６４］㊀ＬｅｃｒｏｉｓｅｙＡ，ＬａｓｃｕＩ，ＢｏｍｉｎａａｒＡ，ｅｔａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９５，３４（３８）：１２４４５［６５］㊀ＴａｎＥ，ＬｉｎＺＸ，ＹｅｏｈＧＣ，ｅｔａｌ．ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ，２００３，３２３（１）：１２２［６６］㊀ＳｕｎＱ，ＪｕｌｉａｎＲＲ．ＲａｐｉｄＣｏｍｍｕｎＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍ，２０１１，２５（１５）：２２４０［６７］㊀ＷａｇｎｅｒＰＤ，ＶｕＮＤ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，１９９５，２７０（３７）：２１７５８［６８］㊀ＨｕｅｂｎｅｒＶＤ，ＭａｔｔｈｅｗｓＨＲ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，１９８５，２６０（３０）：１６１０６㊃６８２㊃。

蛋白质磷酸化对于许多生物现象的引发是很必要的，包括细胞生长、增殖、泛素（ubiquitin）介导的蛋白降解等过程。

特别是酪氨酸磷酸化，作为细胞信号转导和酶活性调控的一种主要方式，通常通过引发蛋白质之间的相互作用，进而介导生长因子、荷尔蒙和细胞因子等对细胞膜上受体的信号调控。

然而，酪氨酸磷酸化在细胞的所有磷酸化修饰中所占的比例却非常低。

大概10%的细胞蛋白会受到磷酸化共价修饰，但每100次蛋白的磷酸化修饰中仅有1次酪氨酸基团的修饰。

与大部分细胞中的丝氨酸和苏氨酸磷酸化水平相比，酪氨酸磷酸化的水平估计要低2000倍。

正是由于细胞中酪氨酸磷酸化的水平相当低，才能保证细胞在内外信号的刺激下，作出灵敏的反应，所以研究酪氨酸的磷酸化对于细胞信号的调控和许多重要生物现象的研究具有极为重要的意义，而对发生酪氨酸磷酸化的蛋白质的识别及磷酸化位点的鉴定对揭示细胞过程的调控和药物的作用位点起到非常重要的作用。

研究蛋白质磷酸化的相关方法：磷酸化Western Blot对于信号转导科研来说，抗酪氨酸磷酸化抗体的出现是一个意义重大的事件。

在没有抗酪氨酸磷酸化抗体之前，蛋白质和酶的酪氨酸磷酸化只能通过非常危险的并且很费时的放射性实验来检测。

而利用抗酪氨酸磷酸化抗体，则可以通过Western Blot或其它免疫学方法轻松地检测到磷酸化信号。

常规的检测方法包括：用抗酪氨酸磷酸化抗体在Western Blot上检测内源或外源表达的磷酸化蛋白。

如果目标蛋白的含量较低，也可利用免疫沉淀的方法先富集发生磷酸化的酪氨酸蛋白，再检测目标蛋白的水平。

抗酪氨酸磷酸化抗体也常用于检测在不同处理的条件下，细胞内总的酪氨酸磷酸化水平的变化情况，作为许多细胞生物现象的一个重要指标。

我们都知道如果需要检测某一个目标蛋白的某一特定位点的磷酸化状态，可以选用该蛋白特定位点的磷酸化特异性抗体。

但由于我们研究的通常是新的磷酸化位点，或者这些蛋白特定位点的磷酸化抗体效果不够好，我们不得不自己制备磷酸化抗体。

首都师范大学学报(自然科学版)第27卷　第6期2006年12月Journal of Capital N ormal University(Natural Science Edition )V ol.27,N o.6Dec.　2006蛋白质的磷酸化修饰及其研究方法张　倩　杨　振　安学丽　王爱丽　李巧云　晏月明3(首都师范大学生命科学学院,北京　100037)摘要 蛋白质磷酸化是一种重要的翻译后修饰,它参与和调控生物体内的许多生命活动。

随着蛋白质组技术的不断发展,蛋白质磷酸化的研究越来越受到广泛的重视。

本文介绍了蛋白质磷酸化修饰的主要类型与功能、磷酸化蛋白质及磷酸化肽的标记和分离与富集、磷酸化肽及磷酸化位点分析以及蛋白质的磷酸化改性等方法,并综述了近年来国内外的主要研究进展。

关键词:磷酸化,磷酸化蛋白质,磷酸化肽,磷酸化改性,质谱.中图分类号:Q 753收稿日期:20052092273通讯作者 蛋白质磷酸化(Protein phosphorylation )是生物界最普遍,也是最重要的一种蛋白质翻译后修饰(P ost 2translational m odifications ,PT Ms ),20世纪50年代以来一直被生物学家看作是一种动态的生物调节过程.在细胞中,大约有1/3的蛋白质被认为是经过磷酸化修饰的[1].在人类基因组中,大约有2%的基因编码了500种激酶和100种磷酸酶[2].蛋白质磷酸化和去磷酸化是原核和真核生物细胞表达调控的关键环节,对许多生物的细胞功能起开关调控作用,是一种普遍的重要调节机制.因此,蛋白质磷酸化的分析和磷酸化位点的鉴定已成为目前蛋白质组学研究的焦点之一.1　蛋白质磷酸化的主要类型与功能磷酸化蛋白质根据其磷酸氨基酸残基的不同大致可分为四类,即:O 2磷酸盐、N 2磷酸盐、酰基磷酸盐和S 2磷酸盐.O 2磷酸盐是通过羟氨基酸的磷酸化形成的,如丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸,羟脯氨酸或羟赖氨酸磷酸化仍不清楚;N 2磷酸盐是通过精氨酸、赖氨酸或组氨酸的磷酸化形成的;酰基磷酸盐是通过天冬氨酸或谷氨酸的磷酸化形成;而S 2磷酸盐通过半胱氨酸磷酸化形成.蛋白质磷酸化具有以下功能:(1)磷酸化参与酶作用机制,在此过程磷酸化为反应性中间产物(多为S 2或N 2磷酸盐),如在磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶依赖的磷酸转移酶系统(PTR )的组氨酸蛋白激酶(HPr );(2)磷酸化介导蛋白活性,蛋白分子通过蛋白激酶发生磷酸化,如蛋白激酶A (丝氨酸和苏氨酸残基)或不同的受体酪氨酸激酶(酪氨酸残基);(3)天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸的磷酸化在细菌趋化反应的感觉性传导中发生解离.2　磷酸化蛋白质及磷酸化肽的标记传统磷酸化蛋白质分析大多利用32P 放射性标记.Lees 2Miller 和Anders on [3]利用放射性32P 对人体内的两种热休克蛋白进行了标记,最终鉴定出保守的丝氨酸磷酸化位点.de Carvalho 等[4]在昆虫细胞表达了人的单核细胞中的细胞质磷脂酶A2,并采用放射性32P 标记法鉴定出磷酸化蛋白及其磷酸化位点.尽管人们至今仍广泛地运用放射性同位素标记法分析蛋白质磷酸化,但是这种方法的固有缺点是显而易见的.首先,这种方法存在放射性污染问题;其次,在某一专一蛋白激酶或者蛋白质体外磷酸化条件还不清楚的情况下,需要分析内源性蛋白质磷酸化时,这种方法就无能为力了.从20世纪80年代起,人们开始研究蛋白质磷酸化分析的非放射性方法.Meyer等[5]报道了用ABI 470气相蛋白质顺序仪固相法非放射分析磷酸化酪氨酸,并采用毛细管电泳鉴定从顺序仪上收集得到的流出液中的磷酸化酪氨酸PTH衍生物.车发云等[6]进一步建立了运用毛细管电泳同时非放射性分析蛋白质或多肽中的各种O2磷酸化氨基酸的方法,可以在低pm ol范围同时分析所有3种PTH2磷酸化氨基酸,进而可分析蛋白质或多肽中磷酸化氨基酸残基,运用此方法他们对3个模型磷酸化肽及天然的磷酸化蛋白β2酪蛋白和卵黄高磷蛋白的磷酸化位点进行了分析.车发云和夏其昌[7]还对磷酸化底物肽的硫代磷酸化及荧光标记进行了报道,他们以七肽LRRAS LG(肯普肽K em ptide)为蛋白激酶A的底物模型,研究硫代磷酸化和荧光标记反应条件,以及标记产物的性质,为荧光标记分析蛋白质磷酸化和蛋白激酶的专一性研究提供了一种新的方法.杨琴等[8]利用免疫荧光标记技术对磷酸化组蛋白H3在乳腺癌细胞中的分布进行了研究.同位素编码亲和标签(IC AT)[9]作为蛋白水平定量的质量标签,已被进一步扩展用于蛋白质磷酸化研究.磷酸同位素标记亲和标签[10](PhI AT)是一种含两个不同质量的生物素亲和标签,实际上就是用不同的化学方法处理磷酸肽,从而标记出修饰位点.现已建立了两种从复杂混合物中专一分离磷酸化蛋白Π肽的方法.G oshe等[10]将肽或蛋白混合物置于碱性硫代二乙醇溶液中,通过β消除从磷酸化丝氨酸或苏氨酸中去掉H3PO4,形成的双键受到硫代二乙醇的作用,巯基取代磷酸根.生物素与巯基相连,标记过的蛋白肽用色谱分离.Zhou等[11]用另外一种方法修饰磷酸化肽,用碳二亚胺浓缩反应将半胱氨酸加在磷酸盐部分,修饰过的肽段以共价键与碘乙酰胺树脂结合,酸洗涤释放.此方法既可用于标记富集磷酸化酪氨酸也可用于标记富集磷酸化丝氨酸和磷酸化苏氨酸.3　磷酸化蛋白质及磷酸化肽的分离与富集 目前,在磷酸化蛋白质及磷酸化肽的分离与富集的研究中经常使用的方法有以下几种:311　固相金属亲和色谱固相金属离子亲和色谱最初用于磷蛋白的亲和纯化[12],磷酸基团与固相化的金属离子有高亲和力,可被选择性地吸附在上面,现在微升级的I M AC 柱被用来富集微量磷酸肽样品[13,14].在此方法中,键合在鳌合底物上的金属离子(通常是Fe3+或G a3+)选择性地与磷酸化肽中的磷酸部分相结合,并且在高pH或磷酸缓冲液中磷酸化肽可以释放出来.此方法的优点在于每一个可溶磷酸化肽,不管其长度如何都能被富集,而且I M AC柱洗脱下的样品可直接用于RP2HP LC分析.这种方法的局限性在于不能与I M AC相结合的磷酸化肽和难于洗脱的磷酸化肽可能会丢失.312　免疫沉淀高亲和性抗体可以从复杂混合物中免疫沉淀特定的蛋白.选择性分离磷酸化蛋白通用的方法是找到能免疫沉淀任何含有磷酸化残基蛋白的抗体.酪氨酸磷酸化蛋白质的单克隆抗体是已知的较好的检测磷酸化蛋白质的抗体,它具有较强的亲和力,可以有效地免疫沉淀酪氨酸磷酸化的蛋白质[15].T illey和Schofieldt[16]利用磷酸化酪氨酸抗体对小麦的高分子量谷蛋白进行了Western2blotting分析,发现了酪氨酸磷酸化的高分子量谷蛋白亚基. Pandey等[17]用两种检测酪氨酸磷酸化蛋白质的单克隆抗体混合物,免疫沉淀表皮生长因子(EG F)刺激后的HeLa细胞总蛋白质和未处理的HeLa细胞总蛋白质,通过MS分析共鉴定出7个已知的EG F激酶底物和一个新的EG F激酶底物.为了深入探索在细胞信息传递中蛋白质酪氨酸磷酸化研究的较佳方法,陈沙力等[18]采用免疫沉淀法及Western印迹法对电离辐射诱导的小鼠胸腺细胞蛋白质磷酸化进行了比较分析.结果表明在蛋白质酪氨酸磷酸化的研究中,免疫沉淀法优于Western印迹法.王天然等[19]还初步探讨了酶联免疫试验检测磷酸化酪氨酸蛋白的可行性.抗磷酸化丝氨酸和苏氨酸抗体特异性不高,但G ronborg等[20]用6种不同的检测丝氨酸和苏氨酸磷酸化蛋白质的抗体对细胞总蛋白质进行免疫沉淀.其中3种抗体可对丝氨酸和苏氨酸发生磷酸化的蛋白质进行免疫沉淀.共鉴定出7个丝氨酸和苏氨酸发生磷酸化的蛋白质,其中5个是已知的丝氨酸和苏氨酸磷酸化的蛋白质,1个是已知蛋白质,但以前并不知道其发生磷酸化。

蛋白的磷酸化1. 引言蛋白的磷酸化是一种重要的细胞信号转导机制，通过磷酸化可以调节蛋白的结构和功能。

本文将详细介绍蛋白的磷酸化过程、调控机制以及在细胞中的功能。

2. 蛋白磷酸化的过程蛋白磷酸化是指通过添加一个或多个磷酸基团到蛋白质分子上，从而改变其结构和功能。

这一过程主要由激酶和磷酸酶两类酶来调节。

2.1 激酶激酶是一类能够将ATP转化为ADP，并将其释放出来，同时将ADP上的一个或多个磷酸基团转移给特定蛋白质分子上的氨基酸残基。

常见的激酶包括丝裂原活化激酶（MAPK）、蛋白激酶A（PKA）和蛋白激酶C（PKC）等。

2.2 磷酸酶磷酸酶是一类能够将蛋白质分子上的磷酸基团水解释放出来的酶。

磷酸酶的作用是将磷酸化蛋白还原为未磷酸化状态，从而恢复其原有的结构和功能。

3. 蛋白磷酸化的调控机制蛋白磷酸化过程受到多种调控机制的影响，包括激活和抑制因子、信号通路和底物特异性等。

3.1 激活和抑制因子激活和抑制因子是调节蛋白激酶活性的重要因素。

激活因子能够与激酶结合并促进其活性，而抑制因子则能够与激酶结合并抑制其活性。

这些因子可以通过多种方式影响激酶的催化活性和底物特异性。

3.2 信号通路蛋白磷酸化过程可以通过信号通路进行调控。

信号通路是细胞内一系列相互关联的分子事件，它们以级联方式传递信息，并最终导致细胞内的生物学响应。

常见的信号通路包括MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路和AMPK信号通路等。

3.3 底物特异性蛋白激酶对底物的特异性是调控蛋白磷酸化的重要机制。

不同的激酶对不同的氨基酸残基有选择性地进行磷酸化，这种底物特异性可以通过激酶与底物之间的结构相互作用来实现。

4. 蛋白磷酸化在细胞中的功能蛋白磷酸化在细胞中起着重要的调节功能，影响多种细胞生理和病理过程。

4.1 细胞增殖和凋亡蛋白磷酸化可以调节细胞增殖和凋亡过程。

例如，MAPK信号通路通过磷酸化转录因子启动基因表达，从而促进细胞增殖。

另一方面，蛋白激酶C（PKC）可以通过抑制凋亡相关因子活性来抑制细胞凋亡。

蛋白质磷酸化的生物化学机制研究蛋白质磷酸化是细胞内一种常见的后翻译修饰方式，通过磷酸酶的作用，在蛋白质分子中引入磷酸基团，从而改变其结构和功能。

这一修饰方式在细胞信号传导、细胞周期调控、基因转录调控以及细胞凋亡等生物过程中发挥着重要作用。

本文将围绕蛋白质磷酸化的生物化学机制展开论述，探讨其在细胞生理活动中的重要作用。

一、蛋白质磷酸化的基本原理蛋白质磷酸化是在细胞中由蛋白激酶催化下进行的化学修饰过程。

该过程通过磷酸酶将无机磷酸基团转移至靶蛋白的特定位点，从而改变蛋白的构象和活性。

磷酸化修饰的靶点通常是蛋白质上暴露的酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基。

二、蛋白质磷酸化的机制1. 激酶与底物的识别和结合蛋白激酶的底物识别和结合是蛋白质磷酸化的第一步。

激酶通过其特异性结构域与特定底物结合，形成复合物。

这种特异性结构域通常是识别并结合相应磷酸化位点周围氨基酸残基的结构域。

2. 磷酸化酶的活化和底物的磷酸化在激酶与底物结合后，激酶活性发生改变，使其能够催化底物的磷酸化反应。

这一过程通常涉及激酶结构域的构象变化，使催化位点与底物磷酸化位点空间接近并形成磷酸酯键。

3. 磷酸化位点的识别和结合磷酸化位点的识别和结合是磷酸酶在磷酸化反应中起到关键作用的步骤。

磷酸酶通过其特异性结构域识别并结合磷酸化位点，使底物与酶形成稳定的复合物，从而进行磷酸酯键的形成。

三、蛋白磷酸化的生理功能1. 信号传导调控蛋白质磷酸化在细胞信号传导过程中起到重要作用。

例如，细胞内的一些激酶被磷酸化后能够激活下游更多的激酶，从而传导信号。

这种级联反应使得细胞能够有效地响应外界刺激并传递信号。

2. 细胞周期调控蛋白质磷酸化在细胞周期调控中也起到关键作用。

例如，一些蛋白质的磷酸化会使细胞周期蛋白激酶活性增强，从而促进细胞周期的进行。

磷酸化修饰的出现和消失都能够精确地调控细胞周期的各个阶段。

3. 基因转录调控蛋白质磷酸化在基因转录调控中具有作用。

一些转录因子的磷酸化修饰能够影响其与DNA结合能力，从而调控基因的转录活性。

磷酸化的过程及蛋白质的变化
1蛋白质磷酸化
蛋白质磷酸化是构成生物体内关键生理环境和调节所必不可少的必需步骤，是调节胞内各种生物活动的重要机制，在细胞组成物和分子的结构功能发挥的过程中扮演重要的角色。

蛋白质磷酸化是一种可逆的定向水解分子反应，能够在蛋白质活性中发挥积极作用。

2磷酸化反应
磷酸化反应是通过酸性磷酸酯酶（例如蛋白激酶和磷酸酶）将磷酸结合到特定蛋白质位点上转录调节蛋白质活性以及调整其结构，使蛋白质在细胞内表现出略微不同的活性状态。

磷酸化反应可以激活蛋白质，也可以抑制蛋白质的活性，它们的作用有时可以促进细胞的凋亡、分化和互作关系。

3蛋白质的变化
对蛋白质磷酸化后，相应的蛋白质会出现改变，引起生物学活性上的改变。

在细胞信号转导中，磷酸化反应在多种分子间提供了可控性的细胞信息传递。

在细胞周期调节中，磷酸化反应显著改变蛋白质的生物学功能，可以激活抑制剂、抑制去激活剂，以调节不同分子间的相互作用，影响蛋白质间的相互作用，以促进细胞的生长、分化和凋亡等细胞的重要功能。

综上所述，蛋白质磷酸化是一种关键的生物动态过程，它可以调节和调整蛋白质组织的结构，以及改变蛋白质的生物活性，影响细胞发生多种重要功能。

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你可以采取的第一步是：通过检查蛋白序列来预测蛋白的磷酸化。 蛋白磷酸化都需要有特定的信号 如果你的蛋白有磷酸化的趋势，那么它需要包含磷酸化共有序列。 一些激酶，例如表皮生长因子受体，具有已经定位的特异性的共有序列。可以通过检查蛋白序列，看看它是否有特定的激酶识别位点。然而，另一些激酶不需要这样的特异性共有序列或共有序列还没有被定位。对于那些，可以应用其它规则。在真核生物中，蛋白质磷酸化通常发生在丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸和组氨酸（在低等真核生物中）残基上。

激酶识别和随后蛋白的磷酸化取决于残基存在的位点。位点周围的氨基酸构成共有位点。在真核生物中，当残基位于一个或多个碱性氨基酸附近时，常常发生丝氨酸和苏氨酸残基上的磷酸化。相反的，酪氨酸磷酸化发生在残基紧邻酸性氨基酸时。这些一般规则是复杂的，因为一些激酶严重依赖于蛋白质的3d结构的识别。此外，许多蛋白质含有多个磷酸化位点，并且可能发生磷酸化级联反应，一个残基的磷酸化可能仅在另一个残基被磷酸化之后发生。

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收稿日期:2007-02-01;修回日期:2007-06-28基金项目:内蒙古医学院重大科研项目(ny2004-zd -002)作者简介:刘婷(1981-),女,内蒙古医学院2005级在读硕士研究生。

通讯作者:王文礼,教授,硕士研究生导师,E -mail:wenli w ang1950@yahoo 内蒙古医学院,010059磷酸化蛋白质组学研究现状刘　婷,　王文礼3,　姜丽丽(内蒙古医学院生物化学与分子生物学教研室,内蒙古呼和浩特010059) 摘　要:蛋白质磷酸化是生命活动最重要的一项翻译后修饰,与信号转导、细胞周期、生长发育以及癌变机制等许多生物学问题有着密切的关系。

蛋白质磷酸化和去磷酸化作为原核和真核细胞表达调控的关键环节,了解其对功能的影响可以深入理解生命系统在分子水平的调控状况。

目前磷酸化蛋白质组研究仍是功能基因组面临的重大课题,本文对此作一综述。

关键词:磷酸化蛋白质组学;信号转导;疾病中图分类号:Q51 文献标识码:A 文章编号:1004-2113(2007)04-0302-04RESEARCH PR OGRESS I N PH OSPH OPR OTE OM I CSL I U Ting,　WANG W en -li,　J I A NG L i -li(D epart m ent of B ioche m istry and M olecular B iology,InnerM ongolia M edical College,Hohhot 010059China ) Abstract:The p r otein phos phorylati on is the most i m portant posttranslati onal modificati on of p r o 2teins in the life activity,which has cl ose relati onshi p with signal transducti on,cell cycle,gr owth,func 2ti on of cancer many other bi ol ogical p r oble m s .A s the key point of exp ressi on modulati on in p r o 2karyotic and eukaryotic cells,the p r otein phos phorylati on and dephos phorylati on may hel p reveal the status of the life syste m at the molecular level .The phos phorylati on in p r oteome re mains challenging f or functi onal genom ics .I n this paper,s ome ne w research p r ogress in p r otein phos phorylati on in p r oteome are su mmarized .Key words:phos phop r oteom ics;signal transducti on;disease 生物体能迅速对体内环境变化和外界环境刺激产生应答反应,这些反应过程靠复杂的调控机制调节,其中大多数调控机制是由蛋白质的构象变化所介导的,而蛋白质本身的构象变化常常是通过变构效应和蛋白质一级结构上发生的各种共价修饰来实现的[1]。