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单克隆抗体的制备方法单克隆抗体的制备方法动物的选择与免疫1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。
目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C 小鼠。
2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。
一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。
常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。
初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点）↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂（ip剂量不宜超过0.5ml）皮下或ip（腹腔内注射）↓3周后第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价）↓2～3周加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv （静脉内注射）↓3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。
②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。
③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。
（2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。
以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。
初次免疫1×107/0.5ml ip↓2～3周后第二次免疫1×107/0.5ml ip↓3周后加强免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv↓取脾融合细胞融合1．细胞融合前准备（1）骨髓瘤细胞系的选择：骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。
单克隆抗体制备1. 免疫动物：三只Balb/c小鼠2. 佐剂：首先用完全弗氏佐剂（CFA），后用不完全弗氏佐剂（IFA）。
3. 免疫原：蛋白或KLH偶联多肽。
每次免疫使用50-100µg免疫原。
4. 免疫：用PBS稀释免疫原，然后与相应的佐剂1：1混合。
抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在小鼠双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后腿进行肌肉注射。
每个区域大约用1/8的免疫原。
接着将1/2的免疫原进行腹腔注射，这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。
以后每个星期进行腹腔注射直到达到要求的效价。
5. 第0星期预采血完全弗氏佐剂（CFA）混合的100µg抗原免疫小鼠。
第2星期完全弗氏佐剂（CFA）混合的50µg抗原免疫小鼠。
第3星期不完全弗氏佐剂（IFA）混合的50µg抗原免疫小鼠。
第4星期溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
第5星期取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测，溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
第X星期取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测，溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
6. 杂交瘤融合和筛选：用PEG方法将效价最好的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞F0进行融合。
用抗原对融合的杂交瘤克隆进行筛选，检测它们的特异性和敏感性。
ELI SA阳性的克隆可用WB检测，筛选出来的克隆至少还需要亚克隆两次。
7. 大规模抗体生产：筛选得到两个克隆最后进行大规模培养（每个克隆1L）或者取腹水（每个克隆5只小鼠）。
用蛋白A/G对培养液或腹水进行纯化，平均每个克隆可以得到3-5mg 抗体。
8. 注意：每个融合平均可以得到900多个克隆，对于多肽抗原可以得到100个左右的ELISA阳性克隆，重组蛋白抗原可以得到100-150个ELISA阳性克隆。
亚克隆实验做的越早，越容易保存克隆。
因此，为了保存和复苏阳性克隆，尽早进行筛选检测是必需的。
单克隆抗体制备流程单抗制备流程1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。
这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。
制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。
一、细胞融合前准备(一) 免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。
一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。
下面以细胞性抗原为例的免疫方案:初次免疫1×10７／0.5ml ip (腹腔内注射)↓2～3周后第二次免疫1×10７／0.5ml ip↓3周后加强免疫(融合前三天) 1×10７／0.5ml ip或iv(静脉内注射)↓取脾融合2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。
要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。
商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。
初次免疫 Ag 1～50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射│(一般0.8～1ml 0.2ml／点)↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip│(ip剂量不宜超过0.5ml)↓3周后第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip│ (5～7天后采血测其效价，检测免疫效果)↓2～3周后加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv↓3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。
单克隆抗体制备方法
1. 嘿，你知道单克隆抗体制备第一步是啥吗？就好像搭房子得先有稳固的地基呀，这第一步就是免疫动物。
比如给小老鼠打上特定的抗原，让它的免疫系统开始行动起来！
2. 然后呢，就要融合细胞啦！这就像把两种不同的力量汇聚在一起，产生奇妙的反应。
像骨髓瘤细胞和免疫细胞的融合，多神奇呀！
3. 筛选阳性克隆，哇哦，这可是个精细活儿呀！就好像在一堆沙子里找出金子一样不容易呢。
比如说在众多细胞中找出能产生我们需要抗体的那一个。
4. 接下来得克隆化培养啦！这就好似精心呵护一棵小树苗，让它茁壮成长。
把筛选出来的细胞好好培养，让它不断繁殖。
5. 扩大培养也很重要哟！这不就像把一个小团队发展成一个大部队嘛。
让细胞数量大量增加，为后面做准备。
6. 单克隆抗体的收集，哇，终于等到这一刻啦！就像收获辛勤劳作后的果实一般让人开心呀。
把产生的抗体收集起来。
7. 之后还得对抗体进行鉴定呢，这难道不像是给一件宝贝做个全面检查，看看它是不是真的厉害。
比如检测它的特异性啥的。
8. 纯化抗体也是必不可少的步骤呀，这就好比把杂质去掉，只留下最纯净的精华，让抗体更加好用。
9. 最后可别忘记保存抗体哦，要好好地保护起来，让它随时能发挥作用。
就像把宝贝放在一个安全的地方。
我的观点结论：单克隆抗体的制备真的是一个很神奇的过程，每一步都至关重要，需要我们认真对待才能得到好用的单克隆抗体呀！。
单克隆抗体的制备方法
一、单克隆抗体制备法
1. 免疫动物：采用合适体表面抗原的方案，给指定动物（通常为小鼠）注射给定的抗原合剂，产生抗原特异性免疫应答，使动物体内产生单克隆抗体。
2. 抗体分离：采用配体结合层析或免疫沉淀法从免疫动物血清或体液中分离出单克隆抗体，用硫酸铵离析可以得到抗体的抗原特异性的的IgG类分子。
3. 抗体纯化：采用实现纯化的技术结合其他细胞分析技术，将抗体从抗体分离产物中得到抗体的纯度大于95%的IgG纯化成分。
4. 抗体测试：可以采用实验室的抗原-抗体免疫试验来确认得到的单克隆抗体的特异性以及抗体复应性，检测其免疫固定特异性以及抗体复应性，确认其抗体复应性。
单克隆抗体的制备原理及方法单克隆抗体是一种由单一克隆B细胞产生的抗体，具有高度的特异性和亲和力。
它在生物医药领域有着广泛的应用，包括疾病诊断、治疗和生物学研究等方面。
本文将介绍单克隆抗体的制备原理及方法，希望能对相关领域的研究人员有所帮助。
一、制备原理。
单克隆抗体的制备原理主要包括以下几个步骤，抗原免疫、细胞融合、筛选和鉴定、扩增和保存。
首先，通过将目标抗原注射到实验动物体内，诱导其产生特异性抗体。
然后，从免疫动物体内获得B细胞，与骨髓瘤细胞进行融合，形成杂交瘤细胞。
接着，通过细胞培养和筛选，筛选出产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞。
最后，对所得的单克隆抗体进行扩增和保存，以备进一步的实验和应用。
二、制备方法。
1. 抗原免疫。
选择合适的实验动物，根据抗原的特性和研究需要，选择合适的免疫方案，包括抗原的种类、免疫的途径和次数等。
2. 细胞融合。
将获得的B细胞与骨髓瘤细胞进行融合，形成杂交瘤细胞。
融合细胞的筛选条件包括杂交瘤细胞的生长条件、培养基的成分和杂交瘤细胞的筛选方法等。
3. 筛选和鉴定。
通过特异性抗原的筛选和鉴定，筛选出产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞。
鉴定的方法包括ELISA、免疫印迹、免疫荧光等。
4. 扩增和保存。
对所得的单克隆抗体进行扩增和保存，以备进一步的实验和应用。
扩增的方法包括体外培养、动物体内生长等。
三、实验注意事项。
在进行单克隆抗体的制备过程中，需要注意以下几个方面的实验注意事项，实验动物的选择和管理、抗原的制备和纯化、细胞融合和杂交瘤细胞的培养条件、单克隆抗体的鉴定和保存等。
四、应用前景。
单克隆抗体作为一种重要的生物医药制剂，在疾病诊断、治疗和生物学研究等方面具有广阔的应用前景。
随着生物技术的不断发展，单克隆抗体的制备技术也在不断完善，相信在未来会有更多的应用领域被开发出来。
综上所述，单克隆抗体的制备原理及方法是一个复杂而又具有挑战性的过程，需要研究人员在实验操作中严格把关，以确保所得的单克隆抗体具有高度的特异性和亲和力。
单克隆抗体的制备方法与应用一、前言单克隆抗体是指一种具有高度特异性和亲和力的抗体，其来源于单个B细胞克隆。
相比多克隆抗体，单克隆抗体更加纯净、稳定和可靠，因此在生物医学研究、诊断和治疗等方面有着广泛的应用。
本文将介绍单克隆抗体的制备方法与应用。
二、单克隆抗体的制备方法1. 免疫动物首先需要选取适当的动物进行免疫，通常选择小鼠或大鼠。
在进行免疫前需要对动物进行预处理，例如注射低剂量的抗生素来消除潜在的感染。
2. 免疫原选择选择合适的免疫原是制备单克隆抗体的关键步骤。
常见的选择包括蛋白质、多肽、细胞表面分子等。
在选择时需要考虑到其特异性、稳定性和可重复性等因素。
3. 免疫程序在进行免疫前需要对动物进行预处理，例如注射低剂量的抗生素来消除潜在的感染。
接着，将免疫原注射到动物体内，通常需要多次免疫以增强免疫效果。
在免疫过程中需要对动物进行监测，例如采集血样检测抗体水平。
4. 融合细胞的制备在获得足够的抗体后，需要从动物体内采集B细胞并与骨髓瘤细胞进行融合。
常用的骨髓瘤细胞包括SP2/0和NS0等。
5. 单克隆抗体筛选通过限稀法或单一细胞分离法等方法将融合细胞分离为单个克隆，并通过ELISA、免疫印迹等方法筛选出特异性较高的单克隆抗体。
接着对筛选出的单克隆抗体进行扩增和纯化等处理。
三、单克隆抗体的应用1. 生物医学研究单克隆抗体在生物医学研究中有着广泛的应用，例如作为特定蛋白质或分子的检测工具、用于药物开发和治疗等。
2. 诊断单克隆抗体在诊断方面也有着重要的应用，例如用于肿瘤标志物的检测、病原体的检测等。
3. 治疗单克隆抗体在治疗方面也有着广泛的应用，例如用于治疗癌症、自身免疫性疾病等。
其中一些单克隆抗体已经被批准为药物并用于临床治疗。
四、总结单克隆抗体是一种具有高度特异性和亲和力的抗体，在生物医学领域中有着广泛的应用。
其制备方法包括适当动物选择、合适免疫原选择、多次免疫程序、融合细胞制备和单克隆抗体筛选等步骤。
【高中生物】高中生物知识点：单克隆抗体单克隆抗体：1、抗体：一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。
从血清中分离出的抗体产量低、纯度低、特异性差。
2、单克隆抗体的制备（1）制备产生特异性抗体的B淋巴细胞：向免疫小鼠体内注射特定的抗原，然后从小鼠脾内获得相应的B淋巴细胞（2）获得杂交瘤细胞①将鼠的骨髓瘤细胞与脾细胞中形成的B淋巴细胞融合；②用特定的选择培养基筛选出杂交瘤细胞，该杂种细胞既能够增殖又能产生抗体。
（3）克隆化培养和抗体检测（4）将杂交瘤细胞在体外培养或注射到小鼠腹腔内增殖（5）提取单克隆抗体：从细胞培养液或小鼠的腹水中提取3、单克隆抗体的应用(1)作为诊断试剂，具有准确、高效、简易、快速的优点。
(2)用于治疗疾病和运载药物。
血清抗体与单克隆抗体的比较：名称产生特点血清抗体由B淋巴一般从血清中分离，产量低、纯度低、特异性差单克隆抗体由杂交瘤细胞分泌特异性强，灵敏度高，能大量制备知识点拨：1、融合的结果是有很多不符合要求的；如有2个B淋巴细胞融合的细胞等，所以要进行筛选。
2、筛选出能够分泌所需抗体的杂种细胞。
3、杂交瘤细胞的特点：既能大量繁殖，又能产生专一的抗体。
4、单克隆抗体的优点：特异性强，灵敏度高，并能大量制备。
5、单克隆抗体的作用：作为诊断试剂：准确识别各种抗原物质的细微差异，并跟一定抗原发生特异性结合，具有准确、高效、简易、快速的优点。
用于治疗疾病和运载药物：主要用于治疗癌症治疗，可制成“生物导弹”，也有少量用于治疗其它疾病。
知识拓展：制备单克隆抗体过程中的筛选：筛选是将未融合的B淋巴细胞、骨髓瘤细胞以及BB融合、瘤瘤融合的细胞通过选择培养基淘汰，筛选出B瘤融合的细胞。
筛选是将产生特定抗体的B瘤细胞通过细胞培养用相应抗原检测的办法筛选出来。
因为从体内取免疫过的B淋巴细胞时取出很多种，形成的杂交瘤细胞有很多种，所以需筛选出产生特定抗体的杂交瘤细胞。
相关高中生物知识点：植物体细胞杂交技术植物体细胞杂交技术：1、植物体细胞杂交技术：就是将不同种的植物体细胞原生质体在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成完整植物体的技术。
单克隆抗体的应用及原理单克隆抗体是指由单一细胞株产生的、只针对特定抗原的抗体。
相对于多克隆抗体，单克隆抗体具有更高的特异性和稳定性，因此在医学、生物学、生物技术等领域有着广泛的应用。
本文将从单克隆抗体的原理、制备方法和应用三个方面进行介绍。
一、单克隆抗体的原理单克隆抗体的制备基于生物学中的免疫原理。
当机体受到外来抗原的侵袭时，免疫系统会产生对抗原的免疫应答，其中的一种反应是产生抗体。
抗体是一种由免疫细胞（主要是B细胞）合成的蛋白质，它可以结合到抗原表面的特定区域（抗原决定簇，Epitope），从而识别和中和抗原。
抗体的结构包括两个重链和两个轻链，每个链都含有一个可变区（variable region，V区）和一个恒定区（constant region，C区）。
V区是抗体分子中最为多样化的部分，它决定了抗体的特异性。
当抗原与B细胞表面的抗体结合后，B细胞会被激活并分化成浆细胞，进而产生大量的抗体分子。
单克隆抗体的制备过程中，需要先制备出特定的抗原。
然后，将该抗原注射到小鼠等动物体内，激活其免疫系统产生抗体。
接着，从动物的脾脏等淋巴组织中分离出B细胞，并将其与肿瘤细胞融合，形成一种称为杂交瘤（hybridoma）的细胞。
杂交瘤细胞既具有B细胞的抗体合成能力，又具有肿瘤细胞的无限增殖能力。
在一系列的筛选和鉴定过程中，可以筛选出只针对特定抗原的单克隆抗体细胞株，进而大规模制备单克隆抗体。
二、单克隆抗体的制备方法单克隆抗体的制备主要包括以下几个步骤：1. 抗原的制备：首先需要准备出特定的抗原，可以是蛋白质、多肽、糖类、药物等。
2. 动物免疫：将抗原注射到小鼠等动物体内，激活其免疫系统产生抗体。
注射的方式有多种，如皮下注射、腹腔注射、静脉注射等。
3. B细胞的分离：从动物的脾脏等淋巴组织中分离出B细胞，可以使用离心、梯度离心等方法。
4. 杂交瘤的制备：将B细胞与肿瘤细胞融合，形成一种称为杂交瘤的细胞。
杂交瘤细胞既具有B细胞的抗体合成能力，又具有肿瘤细胞的无限增殖能力。
一、单克隆抗体的概念和原理免疫反应是人类对疾病具有抵抗力的重要因素。
当动物体受抗原刺激后可产生抗体。
抗体的特异性取决于抗原分子的决定簇，各种抗原分子具有很多抗原决定簇，因此，免疫动物所产生的抗体实为多种抗体的混合物。
用这种传统方法制备抗体效率低、产量有限，且动物抗体注入人体可产生严重的过敏反应。
此外，要把这些不同的抗体分开也极困难。
近年，单克隆抗体技术的出现，是免疫学领域的重大突破。
（1）单克隆抗体的基本概念抗体主要由B淋巴细胞合成。
每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。
动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，含遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。
当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。
被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，即克隆由许多个被激活B细胞的分裂增殖形成多克隆，并合成多种抗体。
如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。
单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体，称为单克隆抗体。
（2）单克隆抗体技术的基本原理要制备单克隆抗体需先获得能合成专一性抗体的单克隆B淋巴细胞，但这种B淋巴细胞不能在体外生长。
而实验发现骨髓瘤细胞可在体外生长繁殖，应用细胞杂交技术-------------使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。
这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。
其制备原理示意如下：二、基本方法-------------1. 抗原提纯与动物免疫对抗原的要求是纯度越高越好，尤其是初次免疫所用的抗原。
如为细胞抗原，可取1×107个细胞作腹腔免疫。
可溶性抗原需加完全福氏佐剂并经充分乳化，如为聚丙烯酰胺电泳纯化的抗原，可将抗原所在的电泳条带切下，研磨后直接用以动物免疫。
选择与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠龄在8～12周，雌雄不限。
为避免小鼠反应而不佳或免疫过程中死亡，可同时免疫3～4只小鼠。
免疫过程和方法与多克隆抗血清制备基本相同，因动物、抗原形式、免疫途径不同而异，以获得高效价抗体为最终目的。
免疫间隔一般2～3周。
一般被免疫动物的血清抗体效价越高，融合后细胞产生高效价特异抗体的可能性越大，而且单克隆抗体的质量（如抗体的浓度和亲和力）也与免疫过程中小鼠血清抗体的效价和亲和力密切相关。
末次免疫后3～4天，分离脾细胞融合。
2. 骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备选择瘤细胞株的最重要的一点是与待融合的B细胞同源。
如待融合的是脾细胞，各种骨髓瘤细胞株均可应用，但应用最多的是SP2/0细胞株。
该细胞株生长及融合效率均佳，此外，该细胞株本身不分泌任何免疫球蛋白重链或轻链。
细胞的最高生长刻度为9×105/ml，倍增时间通常为10～15h。
融合细胞应选择-------------处于对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞（活性应大于95％）。
骨髓瘤细胞株在融合前应先用含8-氮鸟嘌呤的培养基作适应培养，在细胞融合的前一天用新鲜培养基调细胞浓度为2×105/ml，次日一般即为对数生长期细胞。
在体外培养条件下，细胞的生长依赖适当的细胞密度，因而，在培养融合细胞或细胞克隆化培养时，还需加入其他饲养细胞（feeder cell）。
常用的饲养细胞为小鼠的腹腔细胞，制备方法为用冷冻果糖液注入小鼠腹腔，轻揉腹部数次，吸出后的液体中即含小鼠腹腔细胞，其中在巨噬细胞和其他细胞。
亦有用小鼠的脾细胞、大鼠或豚鼠的腹腔细胞作为饲养细胞的。
在制备饲养细胞时，切忌针头刺破动物的消化器官，否则所获细胞会有严重污染。
饲养细胞调至1×105/ml，提前一天或当天置板孔中培养。
3. 细胞融合细胞融合是杂交瘤技术的中心环节，基本步骤是将两种细胞混合后加入PEG使细胞彼此融合。
其后用培养液稀释PEG，消除PEG的作用。
将融合后的细胞适当稀释，分置培养板孔中培养。
融合过程中有几个问题应特别注意。
①细胞比例：骨髓瘤细胞与脾细胞的比值可从1:2到1:10不等，常用1:4的比例。
应保证两种细胞在融合前都具有较高活性。
②反应时间：在两种细胞的混合细胞悬液中，第1min滴加4.5ml -------------培养液；间隔2min滴加5ml培养液，尔后加培养液50ml。
③培养液的成分：对融合细胞，良好的培养液尤其重要，其中的小牛血清、各种离子和营养成分均需严格配制。
如融合效率降低，应随时核查培养基情况。
4. 有限稀释法筛选阳性株一般选用的骨髓瘤细胞为HAT敏感细胞株，所以只有融合的细胞才能待续存活一周以上。
融合细胞呈克隆生长，经有限稀释后（一般稀释至0.8个细胞/孔），按Poisson法计算，应有36％的孔为1个细胞/孔。
细胞培养至覆盖0％～20％孔底时，吸取培养上清用ELISA检测抗体含量。
首先依抗体的分泌情况筛选出高抗体分泌孔，将孔中细胞再行克隆化，尔后进行抗原特异的ELISA测定，选高分泌特异性细胞株扩大培养或冻存。
5. 单克隆抗体的制备和冻存筛选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备，因为融合细胞随培养时间延长，发生污染、染色体丢失和细胞死亡的机率增加。
抗体制备有两种方法。
一是增量培养法，即将杂交瘤细胞在体外培养，在培养液中分离单克隆抗体。
该法需用特殊的仪器设备，一般应用无血清培养基，以利于单克隆抗体的浓缩和纯化。
最普遍采用的是小鼠腹腔接种法。
选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注-------------射，一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。
通常在接种一周后即有明显的腹水产生，每只小鼠可收集5～10ml的腹水，有时甚至超过40ml。
该法制备的腹水抗体含量高，每毫升可达数毫克甚至数十毫克水平。
此外，腹水中的杂蛋白也较少，便于抗体的纯化。
接种细胞的数量应适当，一般为5×105/鼠，可根据腹水生长情况适当增减。
选出的阳性细胞株应及早冻存。
冻存的温度越低越好，冻存于液氮的细胞株活性仅有轻微的降低，而冻存在－70℃冰箱则活性改变较快。
细胞不同于菌种，冻存过程中需格外小心。
二甲基亚砜（DMSO）是普遍应用的冻存保护剂。
冻存细胞复苏后的活性多在50％～95％之间。
如果低于50％，则说明冻存复苏过程有问题。
6. 单克隆抗体的纯化单克隆抗体的纯化方法同多克隆抗体的纯化，腹水特异性抗体的浓度较抗血清中的多克隆抗体高，纯化效果好。
按所要求的纯度不同采用相应的纯化方法。
一般采用盐析、凝胶过滤和离子交换层析等步骤达到纯化目的，也有采用较简单的酸沉淀方法。
目前最有效的单克隆抗体纯化方法为亲和纯化法，多用葡萄球菌A蛋白或抗小鼠球蛋白抗体与载体（最常用Sepharose）交联，制备亲和层析柱将抗体结合后洗脱，回收率可达90％以上。
蛋白可与IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3结合，同时还结合少量的IgM。
洗脱液中的-------------抗体浓度可用紫外光吸收法粗测，小鼠IgG单克隆抗体溶液在A280nm时，1.44（吸光单位）相当于1mg/ml。
经低pH洗脱后在收集管内预置中和液或速加中和液对保持纯化抗体的活性至关重要。
三、操作流程（一）脾细胞1．材料(1) 免疫过的血清抗体滴度高的BALB/c小鼠。
(2) 1640培养液(3) 2.5％FCS－1640营养液2．操作方法(1) 拉颈或用CO2处死小白鼠。
(2) 将小鼠放于70％酒精中浸泡消毒，取出固定于板上，在无菌条件下取脾。
(3) 把脾放入5ml含有2.5％FCS的1640液中，冰浴下轻轻洗去脾上的红血球。
-------------(4) 用镊子轻轻挤压脾，做成脾细胞悬液，用毛细管将悬液移入小试管中。
(5) 直立小试管3min，使大块的结缔组织下沉，把细胞悬液移入离心管中。
以2.5％FCS—1640充满离心管，并以400g离心7min～10min（与此同时应开始制备骨髓瘤细胞）。
(7) 把沉淀用约10ml的新鲜培养液再悬浮。
重复⑹、⑺步骤。
(9) 计算细胞，以台盼兰染色用相差显微镜检查，活细胞数应高于80％为合格。
（二）骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞能产生并分泌大量的免疫球蛋白，这样的瘤细胞融合后，可能影响或降低所分泌抗体的滴度，所以必须选育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤细胞。
选择骨髓瘤细胞的条件：①该瘤细胞系的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系，以便两者的组织相容性抗原一致；②骨髓瘤细胞必须是静息状态，不产生γ球蛋白或不分泌到细胞外；③骨髓瘤细胞生长需要一个较高的细胞密度,最好106个细胞/ml；-------------④生长速度快，繁殖时间短。
目前常用的BALB/c小鼠产生的骨髓瘤细胞株有：①S194/5XXO·BU·1；②SP2／0—Ag14（简称SP20）；③P2—X？—Ag8·6·5·3（简称653）；④FO以653最为常用，它是由矿物油4－甲基－15烷（Pristane，降植烷）诱发出来的一种浆细胞瘤（Minerol Oil plasmacytoma，MOPC）并经过培育形成一株8-氮鸟嘌呤有抵抗力的亚系。
骨髓瘤细胞一般由有关单位直接引入，保存于-195℃液氮罐中，试验时复苏、增殖、传代即可。
由于骨髓瘤细胞是半贴壁状态，很容易脱落，因此不需要胰酶处理。
为了防止出现返祖现象，在融合前，可将培养基内加入15μg/ml 8－氮鸟嘌呤。
取约1×107～6×107对数生长期（即培养15h～20h）的骨髓瘤细胞，在室温离心（400g）10min，沉淀以2.5％FCS—1640液再悬浮并计数。
（三）饲养细胞在体外的细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖，必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖，加入的细胞称之为饲养细胞（Feeder cell）。
在细胞融合和单克隆的选择过程中，就是在少量的或单个细胞的基础上使其生长繁殖成群体，因此在这一过程中必须使用饲养细胞。
许多种类的动物细胞都可以做饲养细胞，如正常的脾细胞、胸腺细胞、腹腔渗出细胞等，常选用腹腔渗出细胞，其中主要是巨噬-------------细胞和淋巴细胞。
应用腹腔渗出细胞的好处是：一方面做饲养细胞，另一方面巨噬细胞可以吞噬死亡的细胞和细胞碎片，为融合细胞的生长造成良好的环境。
腹腔细胞的来源可以是与骨髓瘤细胞同系鼠。
也可以是其他种类的小鼠，如C57鼠，昆明小白鼠等。
1．材料（1）小鼠（BALB/c或C57小白鼠）若干只。
（2）11.6％蔗糖溶液（经10磅30min高压灭菌）。
2．操作方法（1）拉颈处死小鼠。
（2）70％酒精浸泡消毒10min。
