单克隆抗体的制备

单克隆抗体制备方法1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。

这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。

采用杂交瘤技术制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤。

主要仪器设备：超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱（-70℃）、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机（水平转子，4000r/min）、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。

其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml细胞培养瓶，10ml、1ml刻度吸管，试管，滴管（弯头、直头），平皿，烧杯，500ml、250ml、100ml盐水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔细胞培养板，融合管（50ml圆底带盖玻璃或塑料离心管），眼科剪刀，眼科镊，血细胞计数板，可调微量加样器（~50ul，~200ul，~1000ul），弯头针头，200目筛网，小鼠固定装置等。

此外，一般的单克隆抗体制备方法大同小异。

方法动物的选择与免疫1. 动物的选择BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。

目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。

2. 免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。

一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。

（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。

常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。

初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点）↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml）↓3周后第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价）↓2～3周加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射）↓3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。

单克隆抗体制备单克隆抗体的制备是蛋白质工程技术的重要研究内容，有着重要的应用价值。

单克隆抗体的制备原理是：充分发挥宿主生物体（大肠杆菌、哺乳动物细胞等）免疫功能，运用宿主中细胞免疫反应产生浓缩单克隆抗体。

一、抗原介绍1、抗原的来源：单克隆抗体的抗原来源丰富，可以是完整的抗原蛋白、抗原酶、细胞因子、小分子物质以及抗原细胞等。

2、抗原的选择：在单克隆抗体制备的过程中，选择抗原是十分重要的，需要综合考察所选抗原的抗原性、可表达性、毒性及抗击物种的范围。

二、免疫动物1、种类：动物免疫是单克隆抗体制备中的重要步骤，常用的宿主有小鼠、大鼠、兔子、猪以及山羊等。

2、准备：在实验免疫之前，需要对动物体进行一定的准备，主要包括规范动物体衣服清洁、照明、温度调节以及饲养等。

三、免疫原剂的选择1、动力学考察：实验免疫之前，需要对实验免疫抗原和抗体的动力学机制进行考察，以确定细胞免疫强度和灌注次数。

2、选择：免疫原剂的选择要根据实验的需要以及实验动物的免疫能力，可以通过单克隆抗体表位等技术进行原剂优化。

四、免疫原剂的灌注1、灌注体积：灌注体积要根据实验动物的大小和重量以及抗体细胞水平调节，以保证药物的有效抗性。

2、体外灌注：为了提高抗体的产量，需要进行体外灌注，如采用实验室常用试管灌注等方式，将相应药物注入动物体内。

五、细胞免疫1、吞噬作用：属于免疫细胞，吞噬病原体是细胞免疫杀灭病毒的关键，充分发挥宿主生物免疫功能，进而形成抗体。

2、细胞免疫诱导：当病原体进入宿主体后，需要经过几个免疫过程，从而最终诱导细胞免疫，从而产生抗体。

六、浓缩抗体1、浓缩：通过单克隆抗体分离技术，将混杂在抗原的复合抗体进行浓缩，产生有针对性的单克隆抗体。

2、纯化：要获取单克隆抗体，必须对前期产生的抗体进行纯化处理，利用配体结合和抗原亲和纯化以及膜分离等技术，产生纯度较高的单克隆抗体。

单克隆抗体的主要制备步骤
1. 购买解抗原，根据所需克隆抗体设计免疫原；
2. 免疫动物（如家兔），使免疫动物产生抗体抗原反应；
3. 收集动物血清，并从血清中抽取单克隆抗体；
4. 把抽取到的单克隆抗体配制成适合应用的格式（液体、粉末、悬浮液等）；
5. 对单克隆抗体进行纯化并测定其纯度；
6. 用ELISA等多种方法进行交叉反应性测定；
7. 进行稳定性、非特异性结合和抗原竞争的测定；
8. 制备单克隆抗体的回收量检测及吸附实验；
9. 最后进行细胞实验，确保单克隆抗体与细胞结合稳定和特异。

单克隆抗体制备1. 免疫动物：三只Balb/c小鼠2. 佐剂：首先用完全弗氏佐剂（CFA），后用不完全弗氏佐剂（IFA）。

3. 免疫原：蛋白或KLH偶联多肽。

每次免疫使用50-100µg免疫原。

4. 免疫：用PBS稀释免疫原，然后与相应的佐剂1：1混合。

抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在小鼠双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后腿进行肌肉注射。

每个区域大约用1/8的免疫原。

接着将1/2的免疫原进行腹腔注射，这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。

以后每个星期进行腹腔注射直到达到要求的效价。

5. 第0星期预采血完全弗氏佐剂（CFA）混合的100µg抗原免疫小鼠。

第2星期完全弗氏佐剂（CFA）混合的50µg抗原免疫小鼠。

第3星期不完全弗氏佐剂（IFA）混合的50µg抗原免疫小鼠。

第4星期溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。

第5星期取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测，溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。

第X星期取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测，溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。

6. 杂交瘤融合和筛选：用PEG方法将效价最好的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞F0进行融合。

用抗原对融合的杂交瘤克隆进行筛选，检测它们的特异性和敏感性。

ELI SA阳性的克隆可用WB检测，筛选出来的克隆至少还需要亚克隆两次。

7. 大规模抗体生产：筛选得到两个克隆最后进行大规模培养（每个克隆1L）或者取腹水（每个克隆5只小鼠）。

用蛋白A/G对培养液或腹水进行纯化，平均每个克隆可以得到3-5mg 抗体。

8. 注意：每个融合平均可以得到900多个克隆，对于多肽抗原可以得到100个左右的ELISA阳性克隆，重组蛋白抗原可以得到100-150个ELISA阳性克隆。

亚克隆实验做的越早，越容易保存克隆。

因此，为了保存和复苏阳性克隆，尽早进行筛选检测是必需的。

单克隆抗体制备步骤及注意事项一、脾细胞的准备：1.将Balb/c小鼠拉颈脱臼处死，浸泡于75%酒精3～5min。

无菌操作取出脾脏，置于盛有5mL不完全培养液的平皿中，洗涤3次去除脾脏表面的脂肪和结缔组织。

2.将洗好的脾脏用剪刀剪成3～5个小块，然后将脾脏研碎，过细胞筛，收集细胞。

3.将脾脏细胞悬液在1000r/min条件下，离心5min，弃上清。

再以同样的方法洗涤离心一次。

4.将沉淀细胞重新悬浮于10mL不完全培养液中，计活细胞数，取108个脾淋巴细胞悬液备用。

注意事项：➢免疫脾细胞一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，因为此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。

二、骨髓瘤细胞的准备：1.选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞。

2.取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗2次。

3.制备细胞悬液，计活细胞数。

4.调整细胞浓度，取107细胞悬液备用。

注意事项：➢常用的骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2/0、X63、Ag8.653等。

➢骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内生产大量McAb。

➢骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI-1640基础培养液，DMEM培养基。

小牛血清的浓度一般在10～20%。

细胞的最大密度不得超过106个/mL。

➢一般扩大培养以1:10稀释传代，每3～5天传代一次。

细胞的倍增时间为16～20小时。

➢一般准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HA T的敏感性，每3～6个月应用8～AG（8氮杂鸟嘌呤）筛选一次，以防止细胞的突变。

➢保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95%，也是决定细胞融合的关键。

三、细胞融合：1.将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10 或1:5的比例混合，加入20～50mL RPMI-1640培养液。

2.在1000r/min条件下离心8min，弃上清，用滴管轻轻吸净残留液体。

杂交瘤技术制备单克隆抗体的主要步骤包括：（1）抗原制备；（2）免疫动物；（3）免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备；（4）细胞融合；（5）杂交瘤细胞的选择培养；（6）杂交瘤细胞的筛选；（7）杂交瘤细胞的克隆化；（8）单克隆抗体的检定；（9）分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立；（10）单克隆抗体的大量制备。

下面简要介绍单克隆抗体的制备过程：1、免疫动物免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。

一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。

抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。

2、细胞融合采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。

将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。

在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。

3、选择性培养选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT 选择性培养基。

在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。

未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。

只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。

4、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。

通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。

采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。

经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。

单克隆抗体的制备过程及原理单克隆抗体（monoclonal antibody，简称mAb）是指使用浓度较高的、单种类且结构恒定的抗体，它是具有特定抗原性和可重复使用的特殊免疫球蛋白分子。

单克隆抗体由于特异性、可重复使用、界限清晰等具有重要的理论意义和重要的经济意义，在生物分子的研究、疾病的检测和治疗中已经发挥出重要作用。

单克隆抗体制备的方法有奥托尔·米勒法、佩泰法和融合细胞法等。

其制备过程通常包括以下7个步骤：生物反应物的提取、细胞培养，抗体浓度的上升、表达工艺的改进、纯化工艺的筛选、反应物的表达和功能检测。

（1）生物反应物的提取。

抗体制备过程的第一步是提取有用的生物反应物，例如鼠、猴、牛等动物的血液或淋巴液中的B细胞，或者细菌中的免疫球蛋白定量因子（immunoglobulin，Ig）分子等。

（2）细胞培养。

细胞培养就是将这些细胞表现成抗体制备所需的反应物，而培养方法又分为实验室筛选（laboratory selection）和大规模培养（large-scale production）。

（3）抗体浓度的上升。

在细胞培养过程中，抗体浓度也会随着增加，完成这一步后可以得到单克隆抗体。

（4）表达工艺的改进。

表达工艺是抗体分离纯化的关键步骤。

一般来说，可以采用谷氨酸免疫池（Glu-immune pool）、数字筛选技术（digital selection）、高通量测序技术（high-throughput sequencing）和聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）等方法来筛选合适的抗体表达体。

（5）纯化工艺的筛选。

纯化工艺的筛选主要是为了分离抗体的原子或分子结构。

一般采用配体结合、离子交换和溶剂萃取等方法来实现这一步骤。

（6）反应物的表达。

在单克隆抗体表达之前，反应物需要进行细胞系建立和表达调控，以确保抗体的品质和产量。

（7）功能检测。

最后，需要进行单克隆抗体表达体的功能检测，以确定抗体是否具有良好的抗原性和稳定性。

1材料（1）培养基：RPMI 1640（购于HYCLONE公司）；GIT完全培养基（购于日本Nihon Seiyaku 公司）；（2）试剂：HAT（购于GIBCO公司）；HT（购于GIBCO公司）；聚乙二醇（购于MERCK 公司）；二甲亚砜（购于上海生工公司）；对硝基苯磷酸盐(pNPP)、弗氏完全佐剂及不完全佐剂（购于SIGMA公司）；（3）细胞系：瘤细胞为P3-X63-Ag8U1（P3U1）小鼠骨髓瘤细胞；（4）实验动物：Balb/C小白鼠，4周龄雌性，购于山东大学实验动物中心；（5）抗体：碱性磷酸酶（AP）标记的羊抗小鼠Ig（购于SIGMA公司）；（6）酶标仪（MD公司）（7）倒置相差显微镜（OL YMPUS公司）；（8）二氧化碳培养箱（SANYO公司）；2方法3.1.2.1免疫Balb/C小鼠调整牙鲆Ig的蛋白浓度为1 mg/mL，免疫四周龄Balb/C小鼠，共免疫4次。

具体免疫程序如下：基础免疫，将牙鲆Ig悬液与弗氏完全佐剂等比混匀，采用腹腔注射方法，注射剂量为0.1 mL；2周后加强免疫，将牙鲆Ig悬液与弗氏不完全佐剂等比混匀，腹腔注射；1周后再加强免疫1次，采用尾静脉直接注射牙鲆Ig原液，注射剂量为0.1 mL，无佐剂；再1周后加强免疫第2次；第4次免疫后的第3天，将小鼠脱颈椎处死，无菌取脾脏用于细胞融合。

3.1.2.2骨髓瘤细胞的复苏和培养将冷冻的P3U1骨髓瘤细胞从超低温冰箱(-80℃)中取出，立即放入37℃水浴中，融化后，离心（1000rpm，3min），弃上清，加入GIT培养液，在CO2浓度为4.5%的培养箱中37℃培养。

复苏的细胞活力有所下降，死亡细胞较多，应注意适时换液和细心观察。

如细胞数低于104/ml时，细胞生长缓慢，一般在1×104~5×105/ml时呈对数生长，此时细胞浑圆，透亮，大小均一，排列整齐，呈半致密分布。

当细胞密度超过106/ml以上时，细胞便停止分裂，表现皱缩、发暗、细胞浆中出现颗粒。

单克隆抗体的制备与应用单克隆抗体是一种高度特异性的生物分子，能够识别并结合特定的抗原，对于现代生命科学研究和临床医学诊治具有重要意义。

一、单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备主要包括以下几个步骤：（1）选择合适的免疫原：免疫原应具有较好的生物学活性、易于纯化，并且可以诱导动物产生足够的免疫反应。

常用的免疫原包括蛋白质、多肽、糖类、DNA等。

（2）免疫动物：将免疫原注射到小鼠、大鼠、兔子等动物身上，诱导其产生免疫反应。

此过程需要严格控制免疫剂量及免疫间隔时间，以保证动物身体内产生充分的免疫反应。

（3）筛选克隆：从免疫动物获得脾细胞，与骨髓瘤细胞进行融合，生成杂交瘤细胞。

将杂交瘤细胞进行分离、克隆和筛选，最终获得单克隆细胞系。

（4）制备单克隆抗体：将单克隆细胞系进行扩增，并通过细胞培养和大规模发酵获得充足的单克隆抗体产物。

二、单克隆抗体的应用（1）免疫诊断：通过单克隆抗体对特定分子的识别和结合能力，可以用于免疫诊断。

例如，通过检测患者体液中特定抗原的单克隆抗体结合情况，可以诊断疾病，并对病情进行判断。

（2）药物研发：单克隆抗体在药物研发中具有广泛的应用前景。

例如，在抗肿瘤药物的开发中，单克隆抗体可以针对肿瘤细胞特异性抗原，实现有选择性地杀伤肿瘤细胞。

（3）免疫治疗：单克隆抗体可以作为一种抗体治疗手段，对病原体或某些癌细胞进行特异性杀伤。

例如，在肿瘤治疗中，单克隆抗体能够选择性地结合癌细胞表面的受体，阻断其信号传递，从而抑制肿瘤细胞的生长和扩散。

（4）生物学研究：单克隆抗体可以用于生物学研究中的诸多方面。

例如，通过单克隆抗体对特定蛋白的结构和功能进行研究，可以深入了解其生物学特性和作用机制。

三、单克隆抗体的前景与挑战单克隆抗体拥有广泛的应用前景，近年来，其在医学、生命科学研究领域得到了广泛的应用。

然而，单克隆抗体的研发仍面临着一些挑战。

（1）制备难度：单克隆抗体的制备要求高度的技术和设备支持，需要在动物免疫、细胞融合、细胞培养等环节中严格把控。

简述单克隆抗体制备原理。

单克隆抗体是一种通过人工合成而获得的高度特异性的抗体,通常用于检测、诊断和治疗各种疾病。

单克隆抗体的制备原理主要涉及以下几个步骤:
1. 细胞培养:选择适当的细胞系,如B细胞或T细胞等,将其培养在适宜条件下。

2. 分子标记:使用一定的技术和分子标记技术,如荧光标记、放射性标记等,将目标分子或目标分子的基因编码序列引入细胞中。

3. 基因重组:利用基因工程技术,如基因重组载体、基因编辑工具等,将目标分子的基因与相应的单克隆抗体基因进行重组。

4. 表达和处理:将重组后的单克隆抗体基因导入细胞中,使其表达目标分子。

随后,对表达后的单克隆抗体进行筛选和纯化。

5. 扩增和制备:利用适当的扩增技术和设备,如PCR、冻存技术等,将筛选得到的单克隆抗体进行扩增,并制备成所需的浓度和规模。

单克隆抗体制备的原理是基于人工合成抗体的概念,通过分子标记和基因工程技术,将目标分子的基因与单克隆抗体基因进行重组,
使其在细胞中表达并产生高特异性的抗体。

随后,通过筛选、纯化和扩增等技术,获得所需的单克隆抗体。

第十一章单克隆抗体的制备1975年Kǒhler和Milstein首先报道用细胞杂交技术使经绵羊红细胞（SRBC)免疫的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,建立起第一个B细胞杂交瘤细胞株,并成功地制得抗SRBC的单克隆抗体（monlclonalantibody,McAb）。

迄今世界已研制成数以千计的McAb。

单克隆抗体的理化性状高度均一，生物活性单一，与抗原结合的特异性强，便于人为处理和质量控制，并且来源容易，所以一问世便受到欢迎和重视。

在医学领域中，McAb在诊断疾病、判断预后、防治疾病以及疾病机制研究等方面起着巨大的促进作用。

为此，两位发明者于1984年获得诺贝尔医学奖。

第一节杂交瘤技术的基本原理杂交瘤抗体技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。

这两种细胞分别是经抗原免疫的小鼠细胞作小鼠骨髓瘤细胞。

脾淋巴细胞的主要特征是它的抗体分泌功能和能够在选择培养基中生长（选择原理后见），小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，即所谓永生性。

在选择培养基的作用下，只有B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交才具有持续增殖的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。

其原理从下列几个主要步骤阐明。

（一）细胞的选择与融合建立杂交瘤技术的是制备对抗原特异的单克隆抗体，所以融合细胞一方必须选择经过抗原免疫的B细胞，通常来源于免疫动物的碑细胞。

脾是B细胞聚集的重要场所，无论以何种免疫方式刺激，脾内皆会出现明显的抗体应答反应。

融合细胞的另一方则是为了保持细胞融合后细胞的不断增殖，只有肿瘤细胞才具备这种特性。

选择同一体系的细胞可增加融合的成功率。

多发性骨髓瘤是B细胞系恶性肿瘤，所以是理想的脾细胞融合伴侣。

目前常用的B细胞瘤株有：P3-X63-Ag8(KǒhlerandMilstein，1975)，P3-NSI/1-Ag4-1(KǒhlerandMilstein，1976)，X63-Ag8.563(Kearneyetal，1979)，Sp2/0-Ag14(Schulmanetal，1978)等，这些细胞株皆为HAT敏感细胞株。

单克隆抗体制备方法一、免疫原制备免疫原是用于免疫动物产生特异性抗体的物质。

可以是蛋白质、多肽、核酸或糖类等。

首先要选择合适的免疫原，并通过相关方法纯化和检测其质量。

二、小鼠免疫将制备好的免疫原注射到小鼠体内，激活免疫系统产生特异性抗体。

一般来说，每只小鼠需要多次免疫以达到免疫效果。

在注射免疫原之前，需要预先给小鼠注射适量的完全佐剂（如弗氏佐剂），以增强免疫反应。

随后，根据实验需要，在一定时间间隔内给小鼠免疫原重复注射。

三、细胞融合在小鼠免疫充分后，需要将小鼠的脾脏细胞（主要包括淋巴细胞）和肿瘤细胞进行融合，形成杂交瘤细胞。

常用的肿瘤细胞系包括骨髓瘤细胞系（如SP2/0）和癌细胞系（如NS0）。

此过程中可以使用聚乙二醇或电脉冲等方法来提高细胞融合效率。

四、筛选杂交瘤细胞形成后，需要筛选出产生所需单克隆抗体的杂交瘤细胞。

其中一种常用的筛选方法是HAT选择法，该法基于杂交瘤细胞能在含有嘌呤类似物和嘧啶类似物的培养基上生长的特性，将未与小鼠脾细胞融合的肿瘤细胞杂交瘤细胞去除，只保留了真正融合了小鼠脾细胞的杂交瘤细胞。

五、克隆通过稀释法将杂交细胞逐个分装到微孔板上，使每个孔里只有一个细胞，然后将其培养扩增。

经过培养一段时间，单个细胞会形成克隆的细胞群。

随后，从每个孔中取出一个细胞，继续进行培养，直至得到所需的单克隆抗体。

六、克隆鉴定对所获得的克隆细胞进行鉴定，包括酶联免疫吸附测定法（ELISA）、细胞膜免疫荧光法（FACS）以及免疫组织化学法等，以确定细胞制备的单克隆抗体的种类、亚型和亲和力。

七、单克隆抗体制备与纯化将获得的单克隆细胞进行扩培，大规模培养，收集其培养上清液，通过蛋白A或蛋白G亲和层析柱进行纯化。

根据不同的抗体结构和特性，采用不同的纯化方法，如离子交换层析、尺寸排斥层析等。

八、活性检测通过ELISA、西方印迹、免疫荧光等方法对纯化后的单克隆抗体进行活性检测，确定其亲和力和抗原特异性。

以上就是单克隆抗体制备的一般方法。