精氨酸双水解酶试验标准操作规程

四、双酶切鉴定㈠双酶切反应(Double Digests)1、同步双酶切同步双酶切是一种省时省力的常用方法。

选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。

NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer，以保证100%的酶活性。

NEBuffer的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性见《内切酶在不同缓冲液里的活性表》及每支酶的说明书。

能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。

由于内切酶在非最佳缓冲液条件下的切割速率会减缓，因此使用时可根据每种酶在非最优缓冲液中的具体活性相应调整酶量和反应时间。

2、分步酶切如果找不到一种可以同时适合两种酶的缓冲液，就只能采用分步酶切。

分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始，酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要求，然后加入第二种酶完成双酶切反应。

3、使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切（图）使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切也不复杂。

在大多数情况下，采用标准缓冲液的酶也能在这些特殊缓冲液中进行酶切。

这保证了对缓冲液有特殊要求的酶也能良好工作。

由于内切酶在非最佳缓冲液中进行酶切反应时，反应速度会减缓，因此需要增加酶量或延长反应时间。

通过《内切酶在不同缓冲液里的活性表》可查看第二种酶在特殊缓冲液相应盐浓度下的作用活性。

双酶切建议缓冲液注：只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反应体系中加入BSA。

BSA不会影响任何内切酶的活性。

注意将甘油的终浓度控制在10%以下，以避免出现星号活性，详见《星号活性》。

可通过增加反应体系的总体积的方法实现这一要求。

某些内切酶的组合不能采用同步双酶切法，只能采用分步法进行双酶切。

上表中这些组合以“seq”标注。

㈡连接反应1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI，HindIII，提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。

假单胞菌属检验标准操作规程1．概述假单胞菌属包括铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、斯氏假单胞菌等。

铜绿假单胞菌是假单胞菌属的代表菌种。

2．标本类型血液、尿液、痰、脑脊液、穿刺液、脓液等标本。

3．鉴定3.1形态与染色革兰阴性杆菌。

3.2培养特性在血琼脂平板上35℃培养18~24小时，形成蓝绿色、透明溶血环的菌落，有生姜味。

在麦康凯琼脂平板上，可形成5种不同的菌落。

①典型型：菌落不规则，边缘呈伞状伸展；②大肠菌样型：菌落圆形凸起，无色透明，似大肠埃希菌菌落；③粗糙型：菌落呈钮扣状，表面粗糙，或菌落中央隆起边缘扁平；④黏液型：菌落光滑，隆起，呈粘液状，嵌入培养基中，不易挑起，似肺炎克雷伯菌，但是无色；⑤侏儒型：生长缓慢，培养18小时尚不见菌落，24小时后才有细小菌落。

3.3生化特性氧化酶试验阳性；分解葡萄糖，不分解乳糖、麦芽糖、甘露醇和蔗糖；动力、枸橼酸盐、精氨酸双水解酶和硝酸盐还原试验均为阳性；吲哚、赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶试验阴性。

3.4鉴别要点3.4.1 本菌属特征蓝绿色或荧光色菌落、有生姜味，动力和氧化酶试验阳性，在4℃时不生长而在42℃时可以生长。

3.4.2 与荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌的鉴别三者均可产生荧光色素，但铜绿假假单胞42℃时生长，后两者则不能生长。

3.5 操作步骤3.5.1 氧化酶试验参见《氧化酶试验标准操作规程》3.5.2 鉴定从麦康凯琼脂平板上挑取可疑菌落，用微生物鉴定仪或传统生化反应进行细菌鉴定。

4．质控参见《药物敏感性试验标准操作规程》及CLSI M100-S20最新版本文件。

5．质量控制见《质量管理程序》6．检验结果解释与分析感染铜绿假单胞菌的病人，经抗生素治疗3-4日后，易产生耐药性。

因此对铜绿假单胞菌要经常做抗生素药敏试验。

7．临床意义铜绿假单胞菌广泛分布于水、空气、土壤以及正常人体皮肤、呼吸道与肠道黏膜中，为条件致病菌。

当手术、化疗、放疗、激素治疗等原因使人体抵抗力下降时容易引起感染。

苯丙氨酸脱氨酶试验标准操作规程
1．目的
规范苯丙氨酸脱氨酶试验标准操作规程。

2．原理
某些细菌能产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱去氨基生成苯丙酮酸，与三氯化铁作用形成绿色化合物。

3．试剂
3.1 苯丙氨酸琼脂成分
DL-苯丙氨酸2g 氯化钠5g
酵母浸膏3g 磷酸氢二钠1g
琼脂12g 蒸馏水1000ml
PH 7.3
3.2 制备除琼脂外其他的成分加热溶解，调PH至7.3，再加入琼脂溶解后分装，每管约4ml,置120℃灭菌15分钟，置成斜面，凝固后冰箱保存，备用。

4．质控
大肠埃希菌ACTT 25922为黄色，阴性；普通变形杆菌CMCC49001为绿色，阳性。

5.操作步骤
将待检菌接种至苯丙氨酸琼脂斜面，35℃孵育18～24小时，在生长的菌苔上滴加三氯化铁试剂，即刻观察结果。

6.结果判断
斜面呈绿色者为阳性。

7.注意事项
7.1 注意接种菌量要多，否则出现假阴性反应。

7.2 苯丙氨酸脱氨酶试验需在加入三氯化铁试剂后，立即观察，因为绿色易很快褪去，不管阳性或阴性结果，都必须在5分钟内作出判断。

8.临床意义
本试验特异性较高，主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。

变形杆菌、普罗威登斯菌和摩根摩根菌均为阳性，肠杆菌科其他细菌则为阴性。

一、精氨酸鸟氨酸赖氨酸（1）氨基酸脱羧酶试验原理：具有氨基酸脱羧酶的细菌，能分解氨基酸使其脱羧生成胺（赖氨酸→尸胺，鸟氨酸→腐胺，精氨酸→精胺）和二氧化碳，使培养基变碱，使培养基中的溴甲酚紫指示剂变紫色。

加石蜡油是为了造成一个厌氧环境．因为只有在厌氧环境下生成的胺才稳定．（2）培养基：氨基酸脱羧酶培养基和氨基酸对照培养基（对照培养基不加氨基酸）。

（3）方法：将被检菌分别接种于赖氨酸（或鸟氨酸或精氨酸）培养基和氨基酸对照培养基中，并加入无菌液体石蜡或矿物油（氨基酸类反应要与空气隔绝），于35℃培养1～4d，每日观察结果（4）结果：对照管应呈黄色，测定管呈紫色（指示剂为溴甲酚紫）为阳性，若测定管呈黄色为阴性。

阴性者无碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。

对照管应为黄色。

若对照管呈现紫色则试验无意义，不能作出判断。

（5）应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。

如沙门菌属中除伤寒和鸡沙门菌外，其余沙门菌的赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶均为阳性。

志贺菌属除宋内和鲍氏志贺菌外，其他志贺菌均为阴制法除氨基酸以外的成分加热溶解后，分装每瓶100mL，分别加入各种氨基酸：赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸。

L－氨基酸按0.5%加入，DL－氨基酸按1%加入。

再行校正pH至6.8。

对照培养基不加氨基酸。

分装于灭菌的小试管内，每管0.5mL，上面滴加一层液体石蜡，115℃高压灭菌10min。

试验方法：从琼脂斜面上挑取培养物接种，于36±1℃培养18～24h，观察结果。

氨基酸脱羧酶阳性者由于产碱，培养基应呈紫色。

二、枸橼酸盐利用试验(1)原理：某些细菌能利用枸橼酸盐作为唯一碳源，而在此培养基上生长，并分解枸橼酸盐生成碳酸钠，使培养基变碱性。

(2)方法：将待检菌接种于枸橼酸盐培养基上，置35℃孵育1~4d，逐日观察结果。

(3)结果：若用溴麝香草酚兰（ph6.0以下黄色，ph7.6以上蓝色）指示剂，斜面出现菌落或菌苔，培养基变蓝色为阳性；无菌落生长，培养基绿色为阴性。

肌酐测定试剂盒（肌氨酸氧化酶法）标准化操作规程1目的规范实验室操作，保证检验工作顺利有效进行特制定此规程。

2授权操作人经培训且考核通过的临床检验人员。

3适用范围本试剂适用于体外定量检测人血清、血浆或尿液中肌酐的浓度。

4检验方法本试剂采用酶法测定肌酐的浓度。

5检验原理样本中的肌酐在试剂中肌酐酰胺水解酶的催化下水解成肌酸，肌酸在试剂中肌酸脒基水解酶的催化作用下，被水解成肌氨酸和尿素，肌氨酸在肌氨酸氧化酶的作用下，生成的肌氨酸与水和氧反应，产生甘氨酸、甲醛和过氧化氢，生成的过氧化氢在过氧化物酶的催化下与苯胺类色原物质和4-氨基安替比林作用产生水和醍亚胺色素，醍亚胺色素的生成量与样本中总肌酐的含量成正比，通过测定特定波长处反应最终生成的色素量，可以计算出样品中总肌酐的浓度。

肌酐H O肌酐酰胺水解酶肌酸2"肌酸H O肌酸脒基水解酶，肌氨酸+尿素2肌氨酸+H O+O 肌氨酸氧化酶甘氨酸甲醛H O22'22H O +4-氨基安替比林+苯胺类色原物质过氧化物酶醌亚胺色素+H O22*26检验标本要求6.1样本为血清、血浆或尿液。

6.2血浆样本采用EDTA抗凝，应不溶血。

样本采集后应尽快分析。

6.3肌酐样本在2°C〜8°C可稳定7天。

7试剂及配套品7. 1试剂来源长春迪瑞医疗科技股份有限公司肌酐试剂盒（酶法）7.2试剂组成7.3试剂的稳定性与贮存：7.3.1试剂在2C8C条件下，干燥、避光、密封贮存，有效期为12个月。

7.3.2试剂开封后在2C8C条件下可稳定30天。

7.4试剂的变质指示：若试剂混浊，不能再使用。

8实验仪器及性能指标8.1实验仪器迪瑞CS系列全自动生化分析仪8.2试剂性能指标8.2.1空白吸光度：A<0.1o8.2.2分析灵敏度：测试1pnol/L被测物时，吸光度变化△ A>0.01。

8.2.3线性范围：30pnol/L〜25 pnol/L区间内，线性相关系数I r > 0.99;[30, 70] pnol/L区间内，线性偏差应不超过±7 mol/L; (70, 25] pnol/L区间内，线性偏差不超过±10%。

沙门氏菌生化试验判定步骤三糖铁琼脂原理分析：本培养基适合于肠杆菌科的鉴定。

用于观察细菌对糖的利用和硫化氢（变黑）的产生。

该培养基含有乳糖、蔗糖和葡萄糖的比例为10:10:1，只能利用葡萄糖的细菌，葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。

而发酵乳糖的细菌(e.coli)，则产生大量的酸，使整个培养基呈现黄色。

如培养基接种后产生黑色沉淀，是因为某些细菌能分解含硫氨基酸，生成硫化氢，硫化氢和培养基中的铁盐反应，生成黑色的硫化亚铁沉淀。

底层产酸：是因为细菌分解糖类物质使酚红退色变黄。

斜面产碱，低层产酸：是细菌分解葡萄糖(不能分解乳糖和蔗糖),由于量较少进而分解蛋白胨而产碱变红。

因为底层是厌氧环境，葡萄糖分解慢，２４小时培养后还没分解蛋白胨产碱；而斜面是需氧环境分解较快，一般８小时左右就把葡萄糖分解完（此时斜面也是酸性），但继而分解蛋白胨产碱，斜面又转为碱性。

2－志贺氏菌：都能分解葡萄糖，产酸不产气，大多不发酵乳糖，不产生H2S。

4－大肠杆菌：能分解葡萄糖产酸产气，大多数能分解乳糖，不产生H2S。

3－沙门氏菌：能分解葡萄糖，不发酵乳糖，大多数产生H2S，多数产气。

赖氨酸脱羧酶试验1、试验管及对照管均要加一层约10mm厚的灭菌石蜡或矿物油以覆盖表面，此可使培养基中的溶解氧通过细菌消耗掉，并控制培养基的pH。

2、阳性试验管培养初期（10—12h）因发酵葡萄糖产酸变黄，继续培养由于氨基酸脱羧产生胺类而使培养基由酸变碱，故又由黄变为紫色。

阴性试验管则始终呈黄色。

氨基酸脱羧酶试验?(1)原理：某些细菌可产生氨基酸脱羧酶使氨基酸脱羧生成胺和二氧化碳。

由于胺的生成使培养基变为碱性，可用指示剂指示出来。

?(2)方法：将待检菌分别接种于1支氨基酸（赖氨酸，鸟氨酸或精氨酸）脱羧酶试验管和1支氨基酸脱羧酶对照管（无氨基酸），各覆盖至少0.5cm高度的无菌石蜡油，35℃孵育1~4d，观察结果。

第1篇一、目的本规程旨在规范脲酶试验的操作流程，确保试验结果的准确性和可靠性。

二、原理脲酶是一种催化脲分解成氨和二氧化碳的酶。

在本试验中，脲酶将脲分解，产生的氨与酸化后的水杨酸酚反应，生成紫色化合物，通过比色法测定脲酶的活性。

三、试剂与材料1. 试剂：- 脲酶试剂：含有脲、水杨酸酚、氢氧化钠、硫酸铜等成分的溶液。

- 酸化试剂：含有硫酸的溶液。

- 标准氨溶液：已知浓度的氨溶液。

- 比色试剂：用于比色的溶液。

- 比色仪：用于测定吸光度的仪器。

2. 材料：- 试管：用于加样和反应的容器。

- 移液器：用于精确量取试剂的仪器。

- 磁力搅拌器：用于混合溶液的仪器。

四、操作步骤1. 标准曲线制备：- 准备一系列已知浓度的氨溶液。

- 将氨溶液加入试管中，每组加入2ml。

- 加入等体积的酸化试剂，混匀。

- 加入等体积的脲酶试剂，混匀。

- 在室温下反应30分钟。

- 使用比色仪测定吸光度，以氨浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

2. 脲酶活性测定：- 准备待测样品，按需稀释。

- 将样品加入试管中，每组加入2ml。

- 加入等体积的酸化试剂，混匀。

- 加入等体积的脲酶试剂，混匀。

- 在室温下反应30分钟。

- 使用比色仪测定吸光度。

- 根据标准曲线，计算样品中脲酶的活性。

五、注意事项1. 试剂应保存在阴凉、干燥、避光处，避免与有机溶剂接触。

2. 操作过程中应避免样品污染，确保实验结果的准确性。

3. 试剂加入顺序应严格按照操作规程进行，避免产生误差。

4. 实验过程中，严格控制反应时间，确保反应完全。

5. 使用比色仪时，注意校准仪器，确保测量结果的准确性。

六、结果记录与分析1. 记录每组实验的吸光度值。

2. 根据标准曲线，计算样品中脲酶的活性。

3. 对实验结果进行统计分析，判断脲酶活性是否符合预期。

七、质量控制1. 定期进行空白试验，以排除试剂和操作过程中的干扰。

2. 使用已知脲酶活性的标准样品，对实验结果进行校准。

3. 定期对仪器进行维护和校准，确保实验结果的准确性。

医院检验中心脯氨酸肽酶测定(Prolidase Test Kit)操作规程
脯氨酸肽酶(PLD)是参与胶原蛋白胞内最后一步降解的酶，将富含(羟)脯氨酸的末端氨基二肽水解，富含于肝细胞浆中临床与实验研究均证实，血清PLD活性与肝纤维化有关，同时肝细胞炎症坏死时释放该酶，因而又可反映肝损害程度．故广泛用于各类急，慢性肝病的诊断和预后观察．（1）试剂组成：
1)样品稀释液：7Oml
2)基质液：使用前加5ml稀释液溶解
3)终止液：100ml
4)标准脯氨酸溶液：3ml
5)显色液：100ml 1瓶使用前摇匀。

二、操作方法：
1）样品稀释：取0．1ml血清加0.5ml稀释液，37℃水浴24h(稀释血清)
2）活性测定(单位： ul)
充分混匀，88—90℃水浴10min(准确计时)冷水冷却至室温用空白管调零，在分光光度计515nm比色(A) 3）活性计算：
A测定管—A对
照管
血清PLD活性(U/L)= ──────
─
×
[标准浓
度]
×24
00
A测定管（0.65）
4）正常人参考值：
932土236U/L,无明显性别，年龄差异。

（3）注意事项：
1)由于对照管A值平均0.010土0．005，常规检测时可
免设讨对照而按0.01计；
2)空腹静脉血清，—20℃保存半个月活性无变化，溶血
标本结果偏高；
3)当A测定管＞1．8时，血清宜用冰醋酸倍比稀释后再
测定.。

赖氨酸脱酸主要用于肠杆菌科细菌的鉴定，也可用于某些非发酵菌。

试验关培养基中含有赖氨酸和葡萄糖，酸碱指示剂为溴甲酚紫（中性和碱性时紫色，酸性黄色），未用时为紫色。

如果待测细菌将赖氨酸脱羧，则产生胺，为碱性，溴甲酚紫保持紫色，如果不脱羧，肠杆菌科的细菌都能分解葡萄糖，产酸，溴甲酚紫变为黄色。

氨基酸脱羧的对照管其实就是一个葡萄糖发酵管，不含氨基酸。

由于实验结果阳性的为保持紫色不变，阴性结果为黄色，为保证结果的可靠性，须同时接种对照管，如对照管变为黄色，说明细菌接种成功，证实试验管紫色（不变色）却为阳性，而非未接种好细菌。

此外，由于氨基酸脱羧的产物为尸胺、腐胺等，遇氧不稳定，故各管接种完细菌后，需加入几滴液体石蜡隔绝空气，保持胺的稳定性。

法国梅里埃公司API20E 肠道菌试剂鉴定条上面就是API20E 的鉴定试剂条，也就是用来鉴定肠道细菌之用途的。

一共是20 种生化反应再加手工操作的氧化酶试验（ARA 后面的OX）。

非常赞叹梅里埃公司的厉害，能把非常复杂的生化反应做成那么小的试剂条，而且还做了细菌生化反应数据库，好庞大的工作量和好精细的工作…………下面我来分别介绍一下这20 种生化反应原理以及用途：复杂但是很有趣味……1）ONPG 试验翻译成中文是：邻硝基苯-半乳糖苷酶试验。

用来检测细菌是否发酵乳糖。

原理是因为乳糖发酵过程中需要乳糖通透酶和β －半乳糖苷酶才能快速分解，但是有些细菌没有乳糖通透酶，只有半乳糖苷酶，所以会导致迟缓发酵。

由此可得，如果某种细菌能够发酵乳糖，那么一定会产生β －半乳糖苷酶。

ONPG 试验是将ONPG 作为底物，如果细菌产生β －半乳糖苷酶，那么会水解ONPG 为半乳糖和黄色的邻-硝基苯酚（ONP），培养液会变成黄色。

因此试验结果为阳性。

2）ADH 精氨酸双水解酶试验:某些细菌能产生精氨酸水解酶，先水解精氨酸生成瓜氨酸和氨，再水解瓜氨酸生成鸟氨酸、氨和二氧化碳。

因此使培养基呈碱性。

一、摘要本实验旨在探究双切酶在蛋白质消化过程中的作用，通过观察不同酶切条件下蛋白质的降解情况，分析双切酶的特异性和酶活性。

实验过程中，我们使用了胰蛋白酶和胃蛋白酶作为双切酶，通过测定酶解产物的分子量变化，得出实验结论。

二、实验目的1. 探究双切酶在蛋白质消化过程中的作用。

2. 分析双切酶的特异性和酶活性。

3. 了解酶解产物的分子量变化。

三、实验原理蛋白质在消化过程中，首先在胃中受到胃蛋白酶的作用，将其分解为较小的肽段；随后在小肠中，胰蛋白酶和胰蛋白酶原进一步分解蛋白质，最终形成氨基酸。

本实验采用双切酶（胰蛋白酶和胃蛋白酶）作用于蛋白质，观察其降解情况。

四、实验材料与仪器1. 实验材料：- 胰蛋白酶- 胃蛋白酶- 蛋白质溶液- 水浴锅- 分光光度计- 蛋白质分子量标准品2. 实验仪器：- 离心机- 移液器- 容量瓶- 烧杯- 酶标仪五、实验步骤1. 配制蛋白质溶液：将蛋白质溶解于适量缓冲溶液中，调整pH值至适宜范围。

2. 分组处理：将蛋白质溶液分为四组，分别加入不同浓度的胰蛋白酶和胃蛋白酶，作为实验组；另外设置两组未加酶的蛋白质溶液作为对照组。

3. 酶解反应：将实验组和对照组溶液置于水浴锅中，在一定温度下进行酶解反应。

4. 离心分离：酶解反应结束后，将溶液离心分离，取上清液进行后续实验。

5. 蛋白质浓度测定：利用分光光度计测定各组的蛋白质浓度。

6. 蛋白质分子量测定：将各组的蛋白质溶液与蛋白质分子量标准品进行凝胶电泳，比较酶解产物的分子量变化。

六、实验现象1. 实验组蛋白质溶液的酶解程度高于对照组，说明双切酶对蛋白质具有降解作用。

2. 随着酶浓度的增加，蛋白质的降解程度也随之增加，说明酶活性与酶浓度呈正相关。

3. 不同酶对蛋白质的降解效果存在差异，胰蛋白酶和胃蛋白酶对蛋白质的降解效果较好。

七、结论与应用1. 本实验结果表明，双切酶在蛋白质消化过程中具有重要作用，能够有效降解蛋白质。

2. 酶活性与酶浓度呈正相关，因此在实际应用中，可根据需要调整酶的浓度。