原位杂交protocol
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原位所需试剂用dH2O 配置，溶液高压灭菌40min 即可。
材料固定材料放入固定液中，抽真空1hr 至材料完全浸末到固定中，更换新的固定液，室温放置3~6hr 。
Fixative ：4% paraformaldehyde, 0.25% glutaraldehyde (EM grade), 2.5ml 10XBuffer, 12.5ml distilled water, pH 7.2~7.4 Check pH10% paraformaldehyde: 10 grams paraformaldhyde in ~70ml distilled water. Add 1 drop of 10N NaOH to stimulate solving and place for 20min at 70℃ (in waterbath).Adjust pH to 6.8 and volume to 100ml. (Solution can be stored in the dark at 4℃ up to one month)10XBuffer =100mM sodium Phosphate pH 6.8 supplemented with 1M NaCl68.4ml 0.1M Na 2HPO 431.6ml 0.1M NaH 2PO 45.84g NaCl脱水、浸蜡1) Remove fixative and pass through the following dehydration steps:- 1X Buffer, H2O,10% ethanol, 30% ethanol, 50% ethanol, 70% ethanol, 80% ethanol, 90% ethanol and 96% ethanol for 20min; 100% ethanol for 3X1h2) Remove ethanol and replace subsequently with xylene:- 1:3, 1:1, 3:1 ethanol:xylene; 2X100% xylene, 60min for each step3) Overlay xylene with molten paraffin. 3:1, 1:1, 1:3 xylene:paraffin, for two days at 60℃.100% paraffin for two days, and be replaced at least 4 times- 石蜡在脱水前要置于60℃融化，过夜。
- Transfer the vials to 60℃ and pour off the paraffin-xylene solution quickly.包埋适量60℃的石蜡放入预热的锡箔纸模具中，在石蜡的中的材料倒入其中。
用解剖针和镊子摆好材料的方向。
模具放入冰上，待石蜡凝固后，4℃保存。
以上过程需要时间为一周左右。
在此过程中，材料在固定液、100%乙醇、以及3：1的二甲苯和石蜡的混合液中可以过夜。
浸蜡过程需要4-5天时间。
准备1.5mlEp 管，DEPC 处理的枪头，dH2O ，DEPC 水100ml ，1M Tris-HCl pH8.0Preparation of sildes （需要2天时间）1) 盖玻片、载玻片的处理- 洗洁精清洗载玻片（100片）和盖玻片（300片），自来水缓慢水流冲洗2hr ，10%HCl 浸泡过夜。
市售盐酸浓度为36%。
- 载玻片装入提篮中，流水冲洗2hr ，晾干。
盖玻片流水冲洗2hr ，100%乙醇漂洗，100%丙酮dip ，晾干。
锡箔纸包好载玻片和盖玻片，180℃烘烤3hr 。
K a k a2) 载玻片放入含有100ug/ml poly-L-lysine (sigma) solution in 10mM Tris-HCl for at least 10min. Slides are air dried to obtain even coating of the slides. Store coated slides at -20℃ in a box sealed with tape.- Poly-L-lysine can be stored at -20℃, preferably as a stock of 4 mg/ml切片、脱蜡、检片（2天以上）- 将材料从4℃拿出，室温放置1hr 左右。
- Cut 8μm think sections with steel knife, 连续切片。
切好的蜡带置于电光纸上。
- coat 好的载玻片放于42℃的烫台上，加1ml DEPC 水。
用针头把蜡带切成盖玻片长度，挑取置于载片上。
摆好蜡带之后，用吸水纸吸干载玻片上的水。
- 片子42℃烘烤过夜。
- Put slides in 100% xylene for 30min; transfer the slides to 50% xylene (in 100% ethanol) for 20min; transfer the slides to 100% ethanol for 10min; Air dry the slides.- 镜检需要的片子，-20℃保存，待用。
探针标记（标记时间为2天）1) 探针长度一般500~1000kb ，连入T-easy vector 。
鉴定插入的方向。
SP6作为引物测序，如果方向与基因方向相反，则用SP6 polymerase 合成出来的为antisense probe ，质粒用NcoI 酶切。
T7 polymerase 则用SalI 酶切质粒。
Polymerase 在转录过程中，以3’-5’的链为模板，转录出5’-3’的链。
（Promega 公司酶不错，NEB 的酶不好用，切记）2) 原位探针标记体系:DNA template 9μl (1μg)5XTrans Buffer 4μlDTT(100mM) 2μlRNA polymerase 2μlRNA Inhibitor 1μlrNTP-DIG labeling 2μltotal 20μl37℃ incubate 2.5hr3) 反应结束后加RNase free H2O 33ulDNaseI 2μlDNaseI Buffer 6μlTotal 60μl37℃ incubate 1hr ，取1μl 电泳检测DNA 是否消化完全。
（是否有DNA 残余，对后继实验影响不大）4) 在剩余溶液中加0.5M EDTA 7.5μl4M LiCl 7.5μl100% Ethanol 225μl-20℃ overnight5) 12000g 4℃离心 20min ，70% ethanol wash 沉淀，风干后溶于20μl DEPC 水中，取1μl 电泳检测，并测OD 定量(77B antisense 940ng/1μl, clone 8; sense 860ng/1μl, clone 4)。
-20℃保存备用。
K a k aDAY1:杂交前处理、探针消化、杂交过程一天内完成。
早晨来后需打开37℃水浴，蛋白酶K buffer 预热，准备至少6个缸（可加400ml 溶液），1L 、500ml 、200ml 干烤的玻璃两桶各3~4个，需1XPBS 大约6L ，sterile water 6L 。
杂交前处理1) 镜检的片子从-20℃拿出，室温放置至少1hr 再打开锡箔。
2) 乙醇梯度：2X100%、90%、70%、50%、30%、10%、3Xsterile water ，每个梯度2~3min 。
乙醇梯度可以重复使用于后面的脱水过程，100% ethanol 更换即可。
3）100mM Tris-HCl pH 7.5、50mM EDTA 溶液先37℃预热，用前再加入1μg/ml Proteinase K ，枪头搅拌混匀。
片子放入后，37℃处理30min 。
4) 2mg/ml glycine in PBS 溶液中 2min ；PBS 溶液中2minX2 （PBS 配制见前固定材料） 5）4% paraformaldehyde in PBS 10 min; PBS 溶液 5minX26）0.1M triethanolamine in PBS 中，pH 8.0 at room temperature for 10min 。
3-乙醇胺为液体，M=149.称取5.96g 要缓慢逐滴加入到400ml PBS 中，并加入1.6ml 浓HCl 调节pH 。
7）在同一个缸中加入0.25% acetic anhydride （400ml 溶液加1ml ）and incubate for 10min.8) Sterile water wash 2minX39) Ethanol series: 10%、30%、50%、70%、90%、100%X2，各2min 。
10）真空干燥，大于1hr 。
探针消化长片段的探针消化为大约150bp 的片段，后面杂交实验，需要与没有消化的探针混合在一起做杂交反应。
因此只需消化一半用量的探针即可。
1) Mix 50μl labeled RNA with 301μl 0.2M Na 2CO 3 and 0.2M NaHCO 30.2M Na 2CO 3 M=105.99 1.06g/50ml 0.2M NaHCO 3 M=84.01 0.84g/50ml2) Incubate at 60℃ for the time calculated according to the formula:t=(L0-Lf)/(KXL0XLf)t= time in min, L0=starting length (in Kb), Lf=desired final length (in Kb), K=0.113) Stop the reaction by adding 3μl 3M sodium acetate (pH 6.0) and 5μl 10% glacial acetic acid.80ml 水中加入40.18g 三水乙酸钠，冰乙酸调pH 值6.0，定容到100ml。
分装灭菌。
每张片子100ng 探针。
Antisense 27张，sense 3张。
1.5μl antisene +48.5μlDEPC+30μl Na 2CO 3+20μl NaHCO 30.1875μl sense+5μl DEPC+3μl Na 2CO 3+2μl NaHCO 3Ka k a杂交 每张片子按所需杂交液为150μl 计算，其中SolutionA:SolutionB 为9:1，即135μl+15μl 1) Solution A for 30 slides (135μl/slide)： Formamide 2250μl 3M NaCl 450μl 1M Tris-HCl pH 7.5 45μl 0.5M EDTA 9μl 100XDenhardt 45μl 50%Dextran sulfate 900μl H2O 351μl Total 4050μl Incubate solution A at 37℃ until use. 2) Solution B antisense for 27 slides (15ul/slide): Solution B sense for 3 slides: 10μg/μl Yeast tRNA 60.75μl 6.75μl 20μg/μl PolyA 101.25μl 11.25μl Probe mix （消化的探针） 108μl 10.8μl 未消化Probe 1.5μl 0.187μl H2O 135μl 16.2μl Total 405μl 45μl 3) Solution B 加入到A 中，and apply to slides. Cover the solution with a coverslip and keep the slides in a closed moisture chamber with paper wetted with 2XSSC. 20XSSC 800ml 水中溶解175.3g NaCl （3M ）和88.2g 柠檬酸三钠，以10mol/LNaOH 调pH7.0，定容到1L ，高压灭菌4) Incubate at 42℃ O/N, in the dark because ionization of formamide is enhanced by light.DAY 2:需准备大于2L 的PBS ；1.6L 4XSSC ；2L RNase Buffer ，打开水浴锅，预热buffer洗片、Anti-DIG-AP 处理1) 在4XSSC 中滑落盖玻片，并把载玻片放入置于4XSSC 中的铁架台上。
