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昆虫原位杂交一、昆虫原位杂交是什么呢？哎呀，小伙伴们，昆虫原位杂交可有趣啦！简单来说呢，就是一种在昆虫身体里直接做的杂交技术。
你想啊，昆虫那么小一只，要在它身体里搞这么复杂的事情，就像在一个小小的城堡里进行一场神秘的魔法实验一样。
这个技术啊，就像是给昆虫细胞里的基因们安排了一场相亲大会。
科学家们呢，要找到那些来自不同地方的基因“小帅哥”和“小美女”，然后让它们在昆虫细胞这个特殊的“相亲场地”里见面，看看能不能擦出爱的火花，组合成新的基因组合。
二、昆虫原位杂交的步骤有哪些呢？1. 准备工作首先得抓昆虫啦，不过这可不能乱抓哦。
要根据研究的目的，选择合适的昆虫种类。
比如说，如果是研究某种蝴蝶翅膀颜色的基因，那就得专门去找那种蝴蝶。
然后呢，要把昆虫处理一下，让它的细胞能够乖乖听话，就像要把调皮的小孩子哄好，才能让他们配合做游戏一样。
还得准备各种试剂呢。
这些试剂就像是做菜的调料，少了哪一种都不行。
像有一些可以让细胞的结构更清晰的试剂，还有能标记基因的特殊试剂。
2. 杂交过程要把昆虫的细胞或者组织小心翼翼地放在一个特制的环境里。
这个环境的温度、湿度什么的都得控制得很好，就像给小婴儿营造一个舒适的小床一样。
然后把那些带有标记的基因片段放进去，让它们去找自己的“另一半”。
这个过程有点像在大海里捞针，但是科学家们有自己的小窍门，能让这个过程更顺利。
在杂交的时候，还要时刻盯着，就像守着一个小火炉，火候不对就不行。
要保证基因们能够准确地结合，不能让它们乱搭伙。
3. 检测环节杂交完了之后，要看看有没有成功呀。
这时候就需要用到一些特殊的仪器了，这些仪器就像超级侦探一样，能够发现那些成功结合的基因组合。
如果没有检测到，那可能就得重新来一遍，就像做饭没做好，得重新下锅一样。
三、昆虫原位杂交有啥用呢？1. 研究昆虫的进化你知道吗？通过昆虫原位杂交，我们可以了解昆虫的基因是怎么变化的。
就像看一部昆虫家族的历史纪录片一样，能知道它们是怎么从古老的祖先慢慢变成现在各种各样的模样的。
分子生物学实验中的原位杂交技术使用方法介绍分子生物学是一门研究生物分子结构、功能和相互作用的科学。
原位杂交技术是其中一种常用的实验方法，用于研究DNA或RNA在细胞或组织中的位置和表达情况。
本文将介绍原位杂交技术的使用方法，包括样品准备、探针设计、杂交条件和信号检测等方面。
一、样品准备在进行原位杂交实验前，首先需要准备样品。
样品可以是细胞、组织或整个生物体。
对于细胞和组织样品，需要进行固定和切片处理。
固定可以使用甲醛或乙醛等化学试剂，切片则需要使用显微刀或切片机。
对于整个生物体样品，需要进行组织切片或冰冻切片处理。
二、探针设计探针是原位杂交实验中的重要部分，用于与目标DNA或RNA序列特异性结合。
探针可以是DNA或RNA，通常标记有荧光染料或放射性同位素。
在设计探针时，需要考虑目标序列的长度、GC含量、互补性和特异性等因素。
同时，还需要选择适当的标记方法和标记物，以便在实验中检测到探针的信号。
三、杂交条件杂交条件是决定原位杂交实验结果的关键因素之一。
杂交温度、盐浓度和杂交时间等参数需要根据目标序列的特性进行优化。
通常情况下，较高的杂交温度和适当的盐浓度有助于提高探针与目标序列的互补性结合。
杂交时间一般在数小时到数天之间，具体根据实验需要进行调整。
四、信号检测信号检测是原位杂交实验中的最后一步，用于观察和记录探针与目标序列的结合情况。
常用的信号检测方法包括荧光显微镜观察、放射性计数和原位杂交染色等。
荧光显微镜观察是最常见的信号检测方法，可以通过荧光染料的发射和目标序列的位置来确定探针的结合情况。
放射性计数则是使用放射性同位素标记的探针进行测量，通过探针的放射性衰减来判断探针与目标序列的结合情况。
原位杂交染色是一种较为传统的信号检测方法，通过染色剂与探针结合来观察目标序列的位置和表达情况。
原位杂交技术在分子生物学研究中具有广泛的应用。
它可以用于研究基因表达、基因定位、基因组结构和染色体变异等方面。
通过合理设计实验方案和优化实验条件，原位杂交技术可以提供有关生物分子在细胞和组织中的空间分布和功能调控的重要信息。
RNA原位杂交的原理及应用概述RNA原位杂交（RNA in situ Hybridization）是一种常用的生物学技术，用于研究细胞和组织中特定RNA序列的存在和分布情况。
该技术通过将标记有合适探针的RNA与待检测样品中的互补RNA序列进行杂交，并利用探针的标记信号进行可视化，从而实现对特定RNA的检测和定位。
原理RNA原位杂交技术的基本原理主要包括以下几个步骤：1. 制备探针首先，需要制备用于杂交的RNA探针。
探针可以通过合成DNA或RNA，然后标记上荧光染料、辣根过氧化物酶（HRP）等信号源。
这些标记物的选择要根据具体实验需求和信号检测方法来确定。
2. 样品固定待检测的细胞或组织样品需要进行固定处理，以保持其形态和RNA分子的空间分布。
通常使用化学固定剂（如乙醛、甲醛）对样品进行固定。
3. 样品预处理为了提高杂交效率和信号强度，样品需要进行一定的预处理。
通常包括脱水、脱脂、蛋白酶消化等步骤，以去除样品中的干扰物质，提高标记物与目标RNA的结合。
4. 杂交将步骤1中标记的RNA探针与样品中的互补RNA序列进行杂交。
通常杂交反应在适当的温度下进行，可以使用特定的杂交缓冲液来提供合适的反应条件。
5. 信号检测与可视化通过标记物的信号来检测并可视化目标RNA的存在位置和数量。
常用的信号检测方法包括荧光显微镜观察、酶标法等。
对于荧光显微镜观察，可以利用荧光染料的特异性标记来检测目标RNA的存在。
应用RNA原位杂交技术在生物医学研究中有着广泛的应用。
以下列举几个主要应用领域：1. 基因表达和调控研究通过RNA原位杂交可以定位和检测特定基因在不同组织和器官中的表达情况，从而了解基因的空间和时间表达模式，探究基因调控机制。
2. 肿瘤研究RNA原位杂交可用于对肿瘤标志物基因的检测，帮助早期诊断和预测肿瘤发展的趋势。
此外，RNA原位杂交技术还可用于研究肿瘤相关基因的表达和定位。
3. 发育生物学研究通过RNA原位杂交可以跟踪特定基因在胚胎发育过程中的表达及细胞定位，揭示基因在发育和器官形成中的作用机制。
原位杂交原理和应用原位杂交（in situ hybridization）是一种用于研究生物体（如细胞或组织）中特定核酸序列的定位和检测的技术。
它利用了DNA和RNA分子的互补性，使我们能够确定这些分子在细胞中的位置和表达情况。
原位杂交在遗传学、分子生物学和医学研究中有着广泛的应用。
原位杂交的原理可以简要概括为以下几个步骤：1. 表征目标序列：首先，需要确定要检测的目标DNA或RNA序列的特定片段。
这一步可以通过已知序列的引物（probe）引导进行聚合酶链式反应（PCR）扩增，或通过分子克隆等技术获得目标序列的标记。
2.杂交：目标序列的标记探针与待检测的样本的DNA或RNA进行杂交。
标记探针通常通过标记物（如荧光染料或放射性同位素）标记，以便于检测。
3.条件选择：杂交后，需要通过选择性条件，将未杂交的探针从样本中去除。
这个步骤可以通过洗涤样本，以去除杂交失败的探针。
4.可视化：通过适当的检测方法，可以观察到成功杂交的探针。
这可以通过显微镜观察样本，或通过特定仪器检测标记物的信号来实现。
原位杂交技术有着广泛的应用，在遗传学、分子生物学和医学研究中发挥着重要的作用。
以下是一些原位杂交技术的应用：1.基因定位和映射：原位杂交可以帮助研究人员定位和映射特定的基因序列。
通过将标记探针与目标基因的DNA序列杂交，可以确定该基因在染色体上的具体位置。
2.基因表达分析：原位杂交可以用于研究基因在细胞或组织中的表达情况。
通过将标记探针与目标基因的RNA序列杂交，可以观察到基因在细胞中的表达水平和模式。
3.癌症诊断：原位杂交技术在癌症诊断中有着重要的应用。
通过检测癌细胞中特定基因的表达情况，可以确定肿瘤的类型和严重程度，并帮助制定相应的治疗方案。
4.病毒检测：原位杂交也可以用于病毒的检测和诊断。
通过检测感染细胞中病毒基因组的特定序列，可以确定病毒是否存在以及感染的程度。
5.基因组分析：原位杂交可以帮助研究人员对整个基因组进行分析。
荧光原位杂交法 pcr-荧光对比荧光原位杂交法（FISH）和PCR-荧光对比（PCR-FLP）都是分子生物学中常用的技术，可以用于基因定位、染色体结构和功能等方面的研究。
本文将分别介绍这两种技术的基本原理、应用场景和优缺点。
一、荧光原位杂交法1.基本原理荧光原位杂交法是一种基于DNA序列互补碱基配对原理的技术，利用荧光探针对染色体上的特定区域进行标记，以便于观察和分析。
该技术主要包括以下几个步骤：（1）制备探针：将已知序列的DNA片段与荧光标记分子连接，生成荧光标记的DNA探针。
（2）加热解离：将待检样品中的DNA加热，使其解离成两条单链DNA。
（4）荧光显色：利用显微镜观察染色体上的荧光标记，并确定标记位置及数目。
2.应用场景荧光原位杂交法可用于以下方面的研究：（1）核型分析：检测染色体数目、大小和形态等信息。
（2）染色体重排：观察染色体间的换位、倒位等结构改变。
（3）基因定位：确定特定基因在染色体上的位置。
（4）肿瘤诊断：检测肿瘤细胞染色体的数目和结构变化。
3.优缺点（1）高灵敏度：能够检测到细胞核中的单个分子。
（2）高特异性：探针与目标序列可以实现完全互补。
（3）数据可视化：能够直观地呈现染色体结构及荧光信号大小。
而其缺点主要包括：（1）长时间实验：需要多个步骤和时间，且荧光信号非常容易被淬灭。
（2）需要DNA标记：需要荧光标记作为探针，费用较高。
二、PCR-荧光对比PCR-荧光对比（PCR-FLP）是一种应用荧光标记测量PCR产物数量的技术，能够在短时间内准确、可靠地检测和测量DNA的含量和变异。
具体操作过程如下：（1）样品制备：将待测DNA标记荧光标记，与另一非标记探针PCR反应。
（2）荧光PCR扩增：通过PCR反应增生DNA分子。
（3）荧光观察：利用荧光标记观察PCR产物。
（1）定量PCR：准确检测PCR反应中模板DNA的数目。
（2）基因表达：测量基因在不同实验条件下的表达水平。
（3）点突变检测：定性判断DNA中的单个碱基是否发生变异。
HPV原位杂交检测步骤
步骤1：搜集样本
首先，需要从病人体内采集合适的样本。
常用的样本包括宫颈细胞刮片、尿液、唾液、阴道液等，取样前需确保病人不要进行洗涤阴道、尿生
理清洗等活动。
步骤2：样本处理
将采集到的样本进行处理，以获取细胞纤毛。
对于宫颈细胞刮片样本，使用生理盐水或细胞培养液等缓冲溶液进行细胞纤毛的脱落和悬浮。
步骤3：固定细胞
将样本中的细胞固定在载玻片上，通常使用95%的乙醇或乙醚固定细胞。
步骤4：去除细胞膜
通过去除细胞膜，使得封闭DNA在细胞核内。
步骤5：杂交反应
将HPVDNA探针与上述固定的样本进行杂交反应。
该探针通常使用标
记有荧光物质的HPVDNA特异性引物，使其与样本中的HPVDNA发生特异性
的结合。
步骤6：洗涤
对杂交后的载玻片进行洗涤，去除探针杂交过程中的非特异性结合。
步骤7：显微镜观察
使用显微镜观察载玻片上的细胞，看是否有荧光标记。
在有荧光标记的细胞中，说明有HPV感染。
步骤8：结果分析
根据显微镜观察的结果，进行结果的分析和判读。
根据荧光标记的程度和分布情况，可以对HPV感染的类型进行初步的判定。
通常，分析人员需要有经验才能准确判断。
步骤9：结果报告
根据分析结果，写出报告。
报告中应包括所检测的HPV类型、感染程度以及可能的临床推断等信息。
步骤10：质控。
染色体原位杂交技术染色体原位杂交技术是一种重要的分子生物学技术，它被广泛应用于基因组研究、遗传疾病诊断和进化研究等领域。
本文将介绍染色体原位杂交技术的原理、应用和发展前景。
一、染色体原位杂交技术的原理染色体原位杂交技术是利用DNA杂交的原理，通过将标记有特定探针的DNA与靶染色体进行杂交，从而实现对染色体结构和功能的研究。
具体来说，染色体原位杂交技术主要包括以下几个步骤：1. 探针标记：首先需要选择合适的DNA探针，可以是标记有荧光染料或放射性同位素等物质的DNA片段。
这些探针可以与目标染色体上的特定序列发生互补杂交。
2. 样品制备：将待研究的细胞或组织进行适当的处理，如固定、裂解和去除细胞核等步骤，以便探针能够与染色体上的目标序列充分杂交。
3. 杂交反应：将探针与样品中的染色体进行杂交，通过一定的温度和时间条件，使探针与目标序列发生特异性的互补杂交。
4. 洗涤和检测：将未与目标序列杂交的探针洗去，只留下与目标序列杂交的探针。
然后利用荧光显微镜或放射性测量等方法，检测和定位目标序列的位置。
染色体原位杂交技术在生物学研究中有着广泛的应用。
以下是几个具体的应用领域：1. 基因组研究：染色体原位杂交技术可以用于研究基因组的结构和功能，如染色体定位、基因定位和基因组重组等。
通过探针与目标序列的杂交，可以确定染色体上特定基因的位置，从而进一步研究其功能和调控机制。
2. 遗传疾病诊断：染色体原位杂交技术可以用于遗传疾病的诊断和预测。
例如，通过对胎儿进行羊水或绒毛样本的染色体原位杂交分析，可以检测出染色体异常和遗传疾病的存在与否，为临床诊断和遗传咨询提供重要依据。
3. 进化研究：染色体原位杂交技术可以用于研究物种的进化关系和染色体演化。
通过比较不同物种的染色体结构和序列，可以揭示物种间的亲缘关系、基因组重组和染色体演化等现象，为进化生物学的研究提供重要线索。
三、染色体原位杂交技术的发展前景随着分子生物学和生命科学的发展，染色体原位杂交技术也在不断演进和改进。
原位杂交步骤自己整理的精讲荧光原位杂交试剂及其配制方法（以下试剂均需用RNase-free水配制）：1×PBS：NaCl 8g∕L、KCl g∕L、Na2HPO4 g∕L、KH2PO4 g∕L，溶于DEPC处理的去离子水中，用pH计测其pH，再用NaOH调其pH为；PBST：PBS加%吐温-20；LiCI：配4M LiCI 100ml需要LiCI．H20 ，配好后加入千分之一的DEPC，37℃，12h放置，高温灭菌。
4%多聚甲醛（4%PFA）：准确称取40g多聚甲醛，溶于1000ml的1×PBS中，避光于摇床（37℃，160r∕m）上，待其全部溶解后，用棕色瓶分装成小体积包装，保存于－20℃。
（注：本方法与其他一些文献用NaOH和HCl先后调节pH而促其溶解的方法略有不同，因是考虑到pH的稳定性；另外之所以采用上述方法使多聚甲醛缓慢溶解而没有采用文献中提及的用NaOH调节其pH至10促其溶解后再用HCl调节pH的原因，除了用一般的pH试纸测量配置好的4%多聚甲醛的pH不够准确外，也因为不能用pH计对其酸碱度进行测量，因为它会损坏pH 计）。
取以上各成分，溶于DEPC处理过一定量的纯水（或双蒸水）中，测定其pH(放置一段时间待其pH稳定后)，据此以HCl或NaOH来调节其pH值至，定容至所要求的体积。
（注：根据实际情况，因DEPC处理过的水其pH会下降，故本实验中实际上是用1mol∕L的NaOH来调节其pH）。
75%甲醇／PBST：将无水甲醇按75%（V／V）比例溶于PBST；50%甲醇／PBST：将无水甲醇按50%（V／V）比例溶于PBST；25%甲醇／PBST：将无水甲醇按25%（V／V）比例溶于PBST；【HYB－溶液：50%甲酰胺（V／V）、5×SSC（终浓度）、%吐温-20（终浓度）、RNase-free水（－20℃）HYB＋溶液：HYB－溶液、500ug／ml酵母tRNA、50ug／ml （终浓度）肝素，（－20℃）；50%甲酰胺／2×SSCT：50%甲酰胺（V／V），2×SSCT（终浓度）；2×SSCT：2×SSCT（终浓度），%吐温-20；MAB马来酸缓冲液（Maleic acid buffer）：100mM maleic acid，150mM NaCl，pH (20℃)，溶于双蒸水，用浓缩或固体的NaOH调节pH为，并过滤除菌（sterile）MABT:MAB，使用前加入%吐温-20；10×Blocking reagent（阻断剂）：将阻断试剂（Blocking reagent）溶于马来酸缓冲液中，摇晃并在加热器或微波炉上加热，使其终浓度为10％（w/v）；此储存液（原液）需高温除菌（is autoclaved）并分装后保存于－20℃。
原位杂交技术（ISHH）一、核酸分子杂交技术原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价键的形成，出现稳定的双链区，形成杂交的双链。
按其作用方式可大致分为两种：液相杂交——指参加反应的两条核酸链都游离在溶液中；有吸附杂交、发光液相杂交、液相夹心杂交和复性速率液相分子杂交等；固相杂交——将参加反应的一条核酸链固定在固体的支持物上常用的有硝酸纤维素滤膜，其它如尼龙膜、乳胶颗粒和微孔板等），另一条参加反应的核酸链游离在溶液中。
有菌落原位杂交、斑点杂交法（Dot blot）、Southern印迹杂交（Southern blot）、Northern印迹杂交（Northern blot）和组织原位杂交（Tissue in situ hybridization），即原位杂交组织（或细胞）化学技术。
二、原位杂交组织化学技术由来菌落杂交是将细菌裂解释放出DNA，然后进行杂交。
Southern印迹杂交法是以鉴定DNA中某一特定的基因片段。
Norhtern印迹杂交法是用以检测某一特定的RNA片段的。
它们都只能证明该病原体、细胞或组织中是否存在待测的核酸而不能证明该核酸分子在细胞或组织中存在的部位。
原位杂交可以显示该核酸分子在细胞或组织中存在的部位。
核酸探针根据标记方法的不同可分为放射性探针（如同位素标记的探针）和非放射性探针两类。
由于同位素标记探针具有放射性既污染环境，又对人体有害，且受半衰期限制等缺点，科学工作者们开始探索用非放射性的标记物标记核酸探针进行原位杂交;荧光素标记cRNA探针做原位杂交，然后用荧光显微镜观察获得成功。
2，4二硝基苯甲醛（DNP）标记DNA探针，使该DNA探针具有抗原性，然后用兔抗DNP的抗体来识别杂交后的探针，最后经免疫过氧化物酶的方法来定位杂交探针。
这两种方法至今仍有采用，但因敏感度不够高，应用不够普遍。
磺基化DNA探针来做细胞或组织原位杂交的方法，其基本原理是使DNA探针的胞嘧啶磺基化，利用单克隆抗体识别磺基化探针，再通过免疫组化方法显示结合的单克隆抗体，从而对杂交结合的探针进行定位。
荧光原位杂交操作步骤荧光原位杂交听起来很复杂呢，其实操作步骤也有章可循啦。
一、样本准备。
要做这个实验，先得把样本处理好。
如果是细胞样本的话，就得把细胞乖乖地固定在载玻片上，就像把小娃娃放在小床上一样安稳。
这一步可不能马虎，固定不好后面就不好办啦。
要是组织样本呢，得把组织切成薄片，薄到像纸片一样精致才行。
然后同样把它固定好，这就为后面的杂交打下了好基础。
二、探针准备。
接下来就是探针啦。
探针就像是专门去找目标的小侦探。
得按照实验要求把探针配好，浓度要刚刚好哦，太浓了可能会乱了阵脚，太稀了又可能找不到目标。
把探针在合适的缓冲液里调配好，就像给小侦探准备好装备一样。
三、杂交反应。
然后就到了杂交这一步啦。
把准备好的探针滴到有样本的载玻片上，再盖上盖玻片。
这时候就像把小侦探放到了有目标的地方，让它们去寻找匹配的东西。
然后把载玻片放到一个合适温度的环境里，这个温度很关键呢，就像给小侦探们创造一个舒适的工作环境。
在这个环境里让探针和样本中的目标DNA或者RNA去结合，这个过程需要一点时间，就像小侦探寻找目标也不能太着急呀。
四、洗涤。
杂交完了之后呢，就要把那些没有结合的多余探针洗掉。
这就像是把那些凑热闹的家伙赶走，只留下真正找到目标的小侦探。
用合适的洗涤液轻轻地洗，可不能太粗暴，不然把已经结合好的也冲走了就糟糕啦。
五、检测。
最后就是检测啦。
这时候要用专门的荧光显微镜去看。
打开显微镜，就像打开一个神秘的宝藏盒子。
如果杂交成功了，就能看到漂亮的荧光信号啦，就像在黑暗中看到了闪闪发光的小星星。
那些荧光信号所在的地方就是探针找到目标的地方呢。
荧光原位杂交虽然有点复杂，但是按照这些步骤一步一步来，就像照顾小宠物一样细心，也能顺利完成这个有趣的实验啦。
原位杂交组织（或细胞）化学（In situ Hybridization Histochemistry，ISHH）简称原位杂交（In Situ Hybridization），属于固相分子杂交的范畴，它是用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。
根据所用探针和靶核酸的不同，原位杂交可分为DNA-DNA 杂交，DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交三类。
根据探针的标记物是否直接被检测，原位杂交又可分为直接法和间接法两类。
直接法主要用放射性同位素、荧光及某些酶标记的探针与靶核酸进行杂交，杂交后分别通过放射自显影、荧光显微镜术或成色酶促反应直接显示。
间接法一般用半抗原标记探针，最后通过免疫组织化学法对半抗原定位，间接地显示探针与靶核酸形成的杂交体。
原位杂交最初是以同位素标记探针进行的。
尽管同位素标记（如35S，3H，32P等）仍然广泛使用，但非同位素标记探针的迅速发展（尤其是生物素标记探针和地高辛标记探针），更引起科技工作者的极大兴趣。
一、基本要求1. 组织取材：组织取材应尽可能新鲜。
由于组织RNA降解较快，所以新鲜组织和培养细胞最好在30 min 内固定。
2. 固定目的是：（1）保持细胞结构；（2）最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平；（3）使探针易于进入细胞或组织。
最常用的固定剂是多聚甲醛，与其它醛类固定剂（如戊二醛）不同，多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，因而不会影响探针穿透入细胞或组织。
3. 增强组织的通透性和核酸探针的穿透性：（1）稀酸处理和酸酐处理：为防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合，以降低背景，杂交前标本可用0.25%乙酸酐处理10 min，经乙酸酐处理后，组织蛋白中的碱性基团通过乙酰化而被阻断。
组织和细胞标本亦可用0.2 M HCl处理10 min，稀酸能使碱性蛋白变性，结合蛋白酶消化，容易将碱性蛋白移除。
（2）去污剂处理：去污剂处理的目的是增加组织的通透性，利于杂交探针进入组织细胞，最常应用的去污剂是Triton X-100。
注意：过度的去污剂处理不仅影响组织的形态结构，而且还会引起靶核酸的丢失。
（3）蛋白酶处理：蛋白酶消化能使经固定后被遮蔽的靶核酸暴露，以增加探针对靶核酸的可及性。
常用的蛋白酶有蛋白酶K（proteinase K），还有链霉蛋白酶（pronase）和胃蛋白酶（pepsin）等。
4. 杂交缓冲液孵育：杂交前用不含探针的杂交缓冲液在杂交温度下孵育2 hr，以阻断玻片和标本中可能与探针产生非特异性结合的位点，达到减低背景的目的。
5. 防止污染：由于在手指皮肤及实验室用玻璃器皿上均可能含有RNA酶，为防止其污染影响实验结果，在整个杂交前处理过程中都需要戴消毒手套，实验所用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温烘烤（180℃）以达到消除RNA酶的目的。
杂交前及杂交时所用的溶液均需经高压消毒处理。
6. 双链DNA探针和靶DNA的变性：杂交反应进行时，探针和靶核酸都必须是单链的。
如果用双链DNA探针进行杂交（包括检测RNA时），双链DNA探针在杂交前必须进行变性。
探针变性后要立即进行杂交反应，不然解链的探针又会重新复性。
杂交液：杂交液内除含一定浓度的标记探针外，还含有较高浓度的盐类、甲酰胺、硫酸葡聚糖、牛血清白蛋白及载体DNA或RNA等。
杂交液中含有较高浓度的Na+可使杂交率增加，可以减低探针与组织标本之间的静电结合。
甲酰胺可使Tm降低，杂交液中含每1%的甲酰胺可分别使RNA：RNA，RNA：DNA，DNA：DNA的杂交温度降低0.35℃，0.5℃和0.65℃。
所以，杂交液中加入适量的甲酰胺，可避免因杂交温度过高而引起的组织形态结构的破坏以及标本的脱落。
硫酸葡聚糖能与水结合，从而减少杂交液的有效容积，提高探针有效浓度，以达到提高杂交率的目的（尤其对双链核酸探针）。
在杂交液中加入牛血清白蛋白及载体DNA或RNA等，都是为了阻断探针与组织结构成分之间的非特异性结合，以减低背景。
探针的浓度：探针浓度依其种类和实验要求略有不同，一般为0.5~5.0 μg/ml（0.5~5.0 ng/μl）。
最适宜的探针浓度要通过实验才能确定。
探针的长度：一般应在50-300个碱基之间，最长不宜超过400个碱基。
探针短易进入细胞，杂交率高，杂交时间短。
二、试剂准备1. 0.1 M PBS (pH7.2)：Na2HPO4•12 H2O 61.6 g、NaH2PO4•2 H2O 5.6 g、NaCl 9 g，加ddH2O 至2000 ml，高压灭菌。
2. 0.2 M PB ((pH7.2)：Na2HPO4•12 H2O 61.6 g、NaH2PO4•2 H2O 5.6 g 加ddH2O至1000 ml，高压灭菌。
3. 0.1 M甘氨酸：0.75g甘氨酸溶于0.1 M PBS，定容至100 ml，高压灭菌。
4. 4%多聚甲醛：多聚甲醛40 g加ddH2O 400 ml，加热至70℃左右，用1 M NaOH调pH至7.0，用ddH2O定容至500 ml，再加0.2 M PBS 500 ml，总体积为1000 ml。
5. 16×Denhardt溶液：聚乙烯吡咯酮0.4 g、小牛血清白蛋白（BSA）0.4 g、聚蔗糖0.4 g，加dd H2O至10 ml，无菌抽滤、分装，-20℃保存备用。
6. 预杂交液：去离子甲酰胺10 ml、50%硫酸葡聚糖4 ml，于50℃促溶后，再依次加入16×Denhardt液0.2 ml、1 M Tris-HCl(pH 8.0) 0.2 ml、5 M NaCl 1.2 ml、0.5 M EDTA(pH 8.0) 0.04 ml、0.1 M 二硫苏糖醇2 ml、ddH2O 2.21 ml，总体积为10 ml。
无菌抽滤、分装，-20℃保存备用。
临用前加入50 mg/ml 变性鲑鱼精DNA 75 μl/ml。
7. 20×SSC: NaCl 175.3 g、柠檬酸三钠88.2 g，加水至800 ml，用2 N NaOH调pH至7.0，再用ddH2O定容至1000 ml。
8. 抗体稀释液：Triton X-100 80 μl、BSA 0.2 g，以0.05 M PBS定容至20 ml。
9. TSM1：1 M Tris-HCl(pH 8.0)10 ml、5 M NaCl 2 ml、1 M MgCl2 1ml，加ddH2O 100 ml。
TSM2（新鲜配制）：1 M Tris-HCl(pH 9.5)10 ml、5 M NaCl 2 ml、1 M MgCl2 1 ml，加ddH2O至100 ml。
显色液（临用前现配）：5 ml TSM2 加显色液原液（NBT/BCIP）150 μl，并加适量左旋咪唑使其终浓度为0.24 μg/ml，避光。
三、操作步骤（一）取材、冰冻切片：将动物以3%戊巴比妥钠麻醉，打开胸腔，暴露心脏，刺破右心耳，将针尖刺入左心室用生理盐水灌注（灌注量约为动物体重的2倍），再注入等量的4%多聚甲醛。
（见图2-7）。
取材，置于4%多聚甲醛中后固定4hr。
以0.1M PBS浸泡冲洗4-5次（换液：1次/hr）。
将组织块入30%蔗糖/0.1M PBS液（4℃），1-2天后冰冻切片，将切片裱贴于原位杂交专用玻片上，切片厚度为15-20μm。
（二）探针制备与检测（定量）：1. 随机引物制备cDNA核酸探针以DIG DNA 标记检测试剂盒为例：（1）探针制备：①模板DNA(0.5-3 μg) 15 μl，100℃变性10 min，冰浴5 min。
②在冰浴中加：Hexanucleotide mix 2 μl，dNTPmix 2 μl，Klenow Enzyme 1 μl，反应总体积为20 μl。
37℃孵育过夜。
③在上述20 μl 的标记产物中加4 M LiCl 2.5 μl，75 μl（无水乙醇预冷，轻轻混匀，-20℃放置2 hr。
4℃离心12 000 g×15 min，弃上清。
70%乙醇（预冷）50 μl 洗涤，7 500 g×5 min，弃上清，晾干沉淀，加TE 50 μl 溶解沉淀，-20℃保存备用。
（2）探针敏感性检测：①样品稀释：取dig-标记探针1 μl 用ddH2O以1：10、1：100、1：1000、1：1000、1：10000梯度稀释。
②取一张与点样器大小相近的尼龙膜，标记方向，ddH2O中浸泡1 min，6×SSC中浸泡10 min，置点样器上，负压抽吸5 min。
③将上述样品点于尼龙膜上，继续抽吸10 min。
④取下尼龙膜，置紫外灯下10 cm 处照射5 min，晾干。
⑤将膜置于适量预杂交液（5-10 ml）中，37℃预杂交10 min。
⑥加入Anti-dig 抗体（1：5000），37℃杂交30 min。
⑦洗膜：2×SSC/0.1%SDS室温洗10 min×2次。
⑧显色：15 ml TSM2中加300 μl 显色液（NBT/BCIP），37℃避光显色30 min。
2. PCR法制备cDNA核酸探针：（1）探针制备：以PCR DIG Probe Synthesis Kit 为例：在0.5 ml 离心管中，依次加入：PCR引物1（10 pM）2 μl；PCR引物1（10 pM）2 μl；质粒DNA 模板（10-100 pg） 2 μl；PCR DIG mix 2 μl (含dNTP和DIG-11-dUTP)；dNTPmix 2 μl；10×PCR buffer 5 μl；Taq 酶（2 u/μl）1 μl；加入适量ddH2O，使总体积达50 μl。
①将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。
一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃45 s →58℃45 s →72℃60 s，循环30-35次，最后在72℃保温7 min。
②在上述PCR产物中加入4 M LiCl 12.5 μl、预冷无水乙醇375 μl，轻轻混合后置于-20℃2 h，12 000g×15 min，弃上清。
70%乙醇(预冷) 120 μl 洗涤沉淀，离心7500g×5 min，弃上清，晾干沉淀，加TE 50 μl 溶解，-20℃保存备用。
（2）探针检测：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察DIG-DNA探针含量（采用目测法）。
（三）原位杂交反应（以DIG-cDNA探针为例）：1. 0.1 M PBS (pH 7.2) 浸5-10 min。
2. 0.1 M甘氨酸/0.1 M PBS 浸5 min。
3. 0.3%TritonX-100/0.1 M PBS 浸10-15 min。
4. 0.1 M PBS 洗5 min×3次，加蛋白酶K(1 μg/ml)，37℃孵育30 min。
