荧光原位杂交(FISH)实验步骤

羊水细胞荧光原位杂交（FISH）实验步骤未培养羊水细胞荧光原位杂交（FISH）实验步骤一、羊水标本玻片制备1.Hanks胰酶消化：5-8ml未培养羊水标本离心（1000rpm×10min）去上清，向沉淀物中加入5ml水浴加热至37℃的Hanks胰酶溶液（0.25%），充分混匀，37℃水浴25min；2.低渗：离心（1000rpm×10min）去上清，向沉淀物中加入8ml水浴加热至37℃的低渗液（0.075M KCL），充分混匀，37℃水浴30min；3.预固定：迅速加入1ml新鲜配制的固定剂（甲醇∶冰乙酸=3∶1），并立即轻柔混匀细胞悬液，2500转/分钟离心10min，弃上清；4.固定：加入8ml新鲜配制的固定剂，轻柔吹散细胞，并混匀，固定30分钟以上或放置过夜，2800转/分钟离心10min弃上清，加入8ml新鲜配制的固定剂，轻柔吹散细胞，并混匀，2800转/分钟离心10 min弃上清，根据细胞多少加入0.2-0.5ml新鲜配制的固定剂，调至适宜浓度后滴片；5.滴片：将2-3滴细胞悬液滴加在用冰水预冷的干净载玻片上，并立即将玻片放入75℃的烤箱中，待表面干燥后取出编号；6.烤片：将玻片放入60℃烤箱中烘烤2 hr；7.Rnase A处理：标本玻片杂交区用40μl 0.1mg/ml RNAase A 溶液（溶解于2×SSC）于37℃处理30-50min，再用2×SSC于室温洗2min，依次放入70%，90%，100%的酒精中脱水各2min，室温晾干玻片。

8.胃蛋白酶消化：将玻片放入水浴加热至37℃的胃蛋白酶溶液（0.25%）中处理5min,立即取出玻片，在室温条件下，依次将玻片放入2×SSC、70%、90%、100酒精中各处理2分钟，气干玻片。

二、探针、玻片变性及杂交9.探针变性：按试剂说明书配制探针液，于75℃水浴变性5min；10.玻片变性：玻片于75℃变性液（70%甲酰胺/2×SSC）中变性5min，酒精梯度脱水迅速风干玻片；11.将已变性探针5μl加在玻片标本区，依次盖上小、大两层蜡膜，将大的那层四周压紧，再用透明胶包扎密封玻片，放入湿盒中于37℃杂交过夜；二、杂交后洗脱、DAPI复染和荧光显微镜观察信号12.洗脱：小心揭去透明胶和蜡膜，玻片依次于洗脱液I(WS-I)中45℃洗3次×2min，洗脱液II(WS-II)中25℃洗3次×2min,洗脱液III(WS-III)中25℃洗1次×2min，酒精梯度脱水风干玻片；13.结果观察：加5μl DAPI（0.5mg/ml）复染，盖上盖玻片，20min后用荧光显微镜观察信号，照像并计数。

荧光原位杂交FISH操作规程
一、主要试剂
1变性液20SSC 4ml ddH 2O 8ml甲酰胺28ml
2PBD液 1000ml 20SSC中加入1.25gTween20
二、操作流程
1硅化玻片切片烤片60过夜
2脱蜡入水斜置切片空干
32SSC洗涤三次每次5min下简写为35
4 0.2M HCl处理室温10接步骤3
5 0.25mg/ml 蛋白酶K处理室温1530接步骤3
6切片入20梯度酒精脱水各2空干
7切片入85变性液8
8迅速入20梯度酒精脱水各2空干
9杂交液85变性50冰浴10滴加至切片加盖玻片
37过夜
10反应体系中加入等体积的甲酰胺4510
112SSC洗涤405min2SSC洗涤375min
12PBD洗涤切片32
13滴加异硫氢酸荧光素标记的亲和素Avidin FITC,塑膜封
片3730min
14洗涤同步骤12
15滴加抗亲和素Anti Avidin, 3730min
16) 重复步骤121312
17滴加DAP/I(二脒基二苯基吲哚/碘化丙啶)直接封片荧光
镜检
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FISH技术全攻略FISH技术，即荧光原位杂交技术，是一种常用于细胞和组织中DNA 和RNA分子的定位和检测的方法。

它利用荧光标记的探针与待测物（DNA 或RNA）特异性结合，并通过显微镜观察荧光信号的强弱、位置等特征，从而实现对目标分子的检测和定位。

下面是FISH技术的全攻略。

一、实验准备1.准备标记探针所需的DNA或RNA杂交模板。

2.选择适合的荧光标记物，如荧光素或荧光染料。

根据待测物的特异性，选择合适的探针序列。

3.选择适当的杂交缓冲液和嵌合反应缓冲液。

4.准备样本制备所需的试剂和器材，如细胞培养液、组织切片等。

二、标记探针1.获得待测物的DNA或RNA序列，并设计与之特异性结合的引物。

2.利用引物将待测物扩增，并进行纯化。

3.利用PCR或反转录-PCR等方法将引物和合适的荧光标记物连接起来，形成标记探针。

4.对标记探针进行纯化和定量，确保其纯度和浓度适当。

三、样本制备1. 细胞样本制备：将待检测的细胞培养在无菌条件下，收集并进行固定处理，如用甲醛溶液固定细胞，并进行膜通透处理，如用0.1% Triton X-100等溶液处理。

2.组织样本制备：将待检测的组织收集起来，并进行固定处理和脱水处理，如用乙醚和乙醇等溶液处理。

四、杂交反应1.准备杂交缓冲液：根据具体要求配制适当的杂交缓冲液，如SSC缓冲液（含盐和柠檬酸），并加入适量含有探针的杂交模板。

2.加热探针和杂交目标：将探针和待测物的杂交模板一起加热处理，使其变性。

3.杂交：将变性后的标记探针与杂交模板进行杂交，使其重新结合。

4.温度控制：根据具体情况选择合适的杂交温度和时间，并进行合适的温度控制。

五、信号检测与图像分析1.温度冲洗：在特定的温度和缓冲液条件下进行冲洗，去除未结合的探针和杂交模板。

2.荧光显微镜观察：将样本放在显微镜下，观察和记录荧光信号的强度和位置。

3.图像分析：利用图像分析软件对荧光显微镜下观察到的图像进行处理和分析，如测量信号的强度和位置。

(1) 玻片预处理玻片清洗：载玻片与盖玻片用热肥皂水刷洗干净，清水浸泡过夜；1%的盐酸浸泡24小时，蒸馏水清洗干净后置0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）中浸泡过夜。

硅化处理：将载玻片和盖玻片用1%的盐酸煮沸10min后，用0.1%DEPC处理的蒸馏水冲洗，60℃烘干。

盖玻片用锡纸包好4℃保存备用。

黏附剂涂片制备：载玻片放入APES与丙酮的1:50溶液中约1min，取出用灭菌处理过的蒸馏水清洗后于室温下干燥，然后置4℃保存备用。

(2) 样品采集和预处理取样：用经高压灭菌的聚乙烯管子取湿地基质并称量，加灭菌蒸馏水适量振荡混匀，超声波处理使细菌分散。

取清洗下来的悬浊液约1ml进行后续处理。

样品固定与清洗：悬浊液中按1:1加入4%多聚甲醛于4℃固定24小时；将固定样本用磷酸缓冲液(PBS)10000r/min离心漂洗二次，弃去上清液。

用PBS与乙醇的1:1溶液稀释定容至1ml于-20℃保存备用。

热固定与脱水：取10μl样品在载玻片上涂抹24mm×24mm大小，37℃的烘箱热固定2h 后依次用50%，80%，96%乙醇室温下脱水3min，室温干燥。

(3) 杂交反应硝酸菌的探针见表4.2：杂交液配置：总细菌、硝酸细菌、亚硝酸细菌杂交液中去离子甲酰胺（DAF）浓度分别为20%、40%或55%去离子甲酰胺（DAF），其余的相同，SDS 0.1%，Tris-HCl（pH8.0）20mmol/L，NaCl 900mmol/L。

表5-1硝酸菌与亚硝化细菌探针序列Tab. 5-1 Probe and sequences of nitrifying bacteria, denitrifying bacteria and total bacteria 细菌探针名称探针序列（5’—3’）5’—标记总细菌EUB338 GCTGCCTCCCGTAGGAGT HEM硝酸细菌NIT3 CCT GTG CTC CA T GCT CCG FITCCNIT3* CCT GTG CTC CAG GCT CCG亚硝酸细菌NSO190 CGA TCC CCT GCT TTT CTCC HEXCNIT3* 为硝酸菌探针NIT3的竞争探针探针浓度均为50ng/μl。

荧光原位杂交（FISH）1.样品处理与固定(约4h，可提前准备)（1）用纯水清洗样品数次，加1×PBS，涡旋悬浮样品，离心（2000r/min）5min 弃去上清液；（2）在样品中加入4%多聚甲醛（终浓度4%），置于4℃固定3小时左右；（3）离心（12000r/min）5min，弃去上清液；（4）加1×PBS摇匀清洗3次，离心（10000r/min）5min弃去上清液；（5）加0.5mL1×PBS和0.5mL乙醇，重悬样品，-20℃可保存6个月。

2.载玻片涂层处理（约2.5h，可提前准备）（1）将载玻片用盐酸乙醇溶液中（1份盐酸2份乙醇）浸洗10min，然后用自来水水充分清洗，再用纯水清洗2-3遍，100%乙醇中贮存备用；（2）拿出玻片晾干后，滴一滴poly-L-lysine（0.1mg/mL）溶液于载玻片上，覆盖样品孔，室温放置10-30min分钟；（3）吸去多余的溶液，用无菌水冲洗表面数次；（4）接种前至少室温干燥1小时或过夜晾干。

3.透化与脱水（约1h）现配proteinase k buffer：50mL1M Tris/HCl0.5mL0.5M EDTA1mL5M NaCl1mL10%SDS 2.5mLdd H2O to50mL pro.k(20mg/mL)25μL（1）取适量固定后样品于载玻片上（可提前超声破碎），放入46℃孵育箱中烘干10分钟；（2）将样品浸入蛋白酶k缓冲液中，37℃，20min，然后浸入灭菌水中清洗3次，每次1min。

（3）再依次浸入50%、80%、100%乙醇中脱水，每次3min，最后在空气中晾干。

4.杂交（约2h）（1）加9μL杂交缓冲液到载玻片的样品上，尽量让样品全被覆盖；（2）（此步之后，保证样品充分避光）在杂交缓冲液上加1μL探针（终浓度5ng/μL）；（3）将载玻片水平放在有2×SSC的湿盒中，盖盖，然后一起放入46℃孵育箱中，杂交1.5小时；（4）将冲洗缓冲液预热到48℃，备用。

荧光原位杂交(FISH)实验操作步骤荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH)是一个很重要的生物学实验技术，它的特点是原位，无需经过PCR，可以用于对环境样品中特定的微生物进行定量分析。

下面是以活性污泥为例的FISH实验步骤及方法。

非生物学专业的同学请不要往下看了。

1 载玻片涂层处理（Slide coating）(1) 将载玻片置于盐酸乙醇溶液（1%HCl in 70% Ethanol）中清洗(2) 晾干后放入poly-L-lysine(0.01%)溶液中5分钟(3) 放入60℃烘箱60分钟烘干或者放在室温过夜晾干2样品固定（Sample fixation）(1) 在样品（活性污泥）中加入3倍体积的4% 多聚甲醛（paraformaldehyde），置于4℃冰箱固定3小时以上或者过夜(2) 离心，弃去多聚甲醛，加入相同体积的PBS(3) 离心，弃去PBS，加入相同体积的乙醇+PBS(w/w 1:1)(4) 固定后的样品放入-20℃冰箱保存。

3 脱水（Dehydration）(1) 将适量固定后的样品放在载玻片上，(2) 放入46℃烘箱烘干10分钟(3) 依次浸入50%，80%，96%的乙醇溶液，各3分钟(4) 在空气中晾干4 杂交（Hybridization）(1) 加10微升Hybridization buffer（配制方法见下面表格）到玻璃片的样品上，尽量让样品全被覆盖(2) 在Hybridization buffer上加1微升探针（Probe）(3) 在50ml离心管中放一张润湿的吸水纸，将玻璃片放入，然后一起放到46℃恒温箱，杂交1.5小时(4) 将Washing buffer（配制方法见下面表格）预热到48℃，准备下一步使用5冲洗(1) 杂交1.5小时之后，快速将玻璃片放入48℃Washing buffer(2) 在48℃恒温箱中放置30min(3) 用超纯水润洗玻璃片，然后再空气中晾干6镜检晾干后，将样品用适量的antifading reagent 覆盖，盖上盖玻片，然后就可以放到共聚焦显微镜（Confocal laser scanning microscopy）下观察了。

荧光原位杂交实验具体步骤及详细说明荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）是一种用于确定DNA或RNA序列在细胞或组织中的位置的技术。

下面将详细介绍荧光原位杂交的具体步骤和相应的详细说明。

1.细胞准备首先，需要准备细胞样本。

可以选择使用原代细胞，细胞悬液或切片等。

2.固定将细胞固定在载玻片或载玻片上面。

固定通常使用的试剂是乙酸乙酯和甲醇的混合物，通常比例为1:33.水合将载玻片中的组织或细胞水合处理。

这一步可以通过将载玻片浸泡在去离子水或缓冲液中进行。

4.处理将载玻片进行预处理，以使DNA或RNA序列更易于杂交。

常用的预处理方法有：-煮沸：将载玻片浸泡在2×SSC（1×SSC：0.15MNaCl,0.015MNa3C6H5O7·2H2O,pH7.0）中，然后置于热盖板上加热至100°C，持续约10-20分钟。

-碱性水解：将载玻片浸泡在10%NaOH中，进行碱性水解，然后在盐溶液中冲洗。

5.杂交探针准备荧光探针或荧光标记的引物。

探针的选择取决于要检测的DNA或RNA序列。

探针的设计通常基于目标序列的序列信息，并且通过化学修饰和荧光标记以增加其杂交效率和检测灵敏度。

6.杂交将探针加到载玻片上的样本上，并与目标序列进行杂交。

杂交过程中，探针与目标序列进行互补配对，形成探针-目标复合物。

杂交的温度取决于探针的碱基组成和目标序列的GC含量。

7.洗涤将载玻片在洗涤缓冲液中进行洗涤，以去除未与目标序列杂交的探针。

8.检测使用荧光显微镜观察载玻片上的标记。

荧光标记的探针将通过荧光显微镜检测获得荧光信号。

根据荧光信号的数量和强度，可以确定目标序列的位置和数量。

9.成像和分析通过拍摄荧光显微镜图像来记录荧光信号。

使用图像处理软件进行图像分析，包括亮度分析和定量信号分析。

总结：荧光原位杂交是一种用于确定DNA或RNA序列在细胞或组织中位置的强大技术。

仪器设备1、医用微波炉；2、水浴锅；3、OL YMPUS BX51荧光显微镜；4、OL YMPUS DP11数字显微照相机。

FISH试剂（1）1×PBS：由10×PBS溶液稀释而成，储存于4℃；（2）20×SSC（pH7.0）；（3）2×SSC，由20×SSC溶液稀释而成；（4）25mg/ml蛋白酶K消化液。

（5）变性液(70％甲酰胺+2×SSC，pH7.0)：4ml 20×SSC；8ml蒸馏水；28ml甲酰胺。

每次新鲜配制。

（6）杂交后洗涤液：20×SSC 4ml；蒸馏水16ml；甲酰胺20ml。

每次新鲜配制。

调节pH前升至室温。

实验步骤1、脱蜡：1）二甲苯脱蜡3次，每次5min；2）100％酒精两次，每次2min；3）移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。

2、蛋白酶处理:1）每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40ml倒人Facal管，在水浴槽中预热。

将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。

2）37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。

37℃孵育20min。

3）×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1min。

4）梯度酒精脱水（-20℃预冷）。

3、变性：1）每一个立式染色缸配制40ml变性溶液；2）78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸；3）78℃孵育8min；4）即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内，每缸2min；5）空气干燥。

4、杂交：1）准备探针；2）取一个较大的湿盒，交叉放置切片；3）滴10μl探针在切片的组织上，加盖玻片；4）盖上湿盒盖，37℃孵育12h～16h。

杂交后的水洗：5）镊子小心去除盖玻片；6）43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min；7）2×SSC(37℃)洗两次，每次10min；8）切片放人染色缸的1×PBS内待检测，勿使切片干燥。

荧光原位杂交（FISH）1.样品处理与固定(约4h，可提前准备)（1）用纯水清洗样品数次，加1×PBS，涡旋悬浮样品，离心（2000r/min）5min 弃去上清液；（2）在样品中加入4%多聚甲醛（终浓度4%），置于4℃固定3小时左右；（3）离心（12000r/min）5min，弃去上清液；（4）加1×PBS摇匀清洗3次，离心（10000r/min）5min弃去上清液；（5）加0.5mL1×PBS和0.5mL乙醇，重悬样品，-20℃可保存6个月。

2.载玻片涂层处理（约2.5h，可提前准备）（1）将载玻片用盐酸乙醇溶液中（1份盐酸2份乙醇）浸洗10min，然后用自来水水充分清洗，再用纯水清洗2-3遍，100%乙醇中贮存备用；（2）拿出玻片晾干后，滴一滴poly-L-lysine（0.1mg/mL）溶液于载玻片上，覆盖样品孔，室温放置10-30min分钟；（3）吸去多余的溶液，用无菌水冲洗表面数次；（4）接种前至少室温干燥1小时或过夜晾干。

3.透化与脱水（约1h）现配proteinase k buffer：50mL1M Tris/HCl0.5mL0.5M EDTA1mL5M NaCl1mL10%SDS 2.5mLdd H2O to50mL pro.k(20mg/mL)25μL（1）取适量固定后样品于载玻片上（可提前超声破碎），放入46℃孵育箱中烘干10分钟；（2）将样品浸入蛋白酶k缓冲液中，37℃，20min，然后浸入灭菌水中清洗3次，每次1min。

（3）再依次浸入50%、80%、100%乙醇中脱水，每次3min，最后在空气中晾干。

4.杂交（约2h）（1）加9μL杂交缓冲液到载玻片的样品上，尽量让样品全被覆盖；（2）（此步之后，保证样品充分避光）在杂交缓冲液上加1μL探针（终浓度5ng/μL）；（3）将载玻片水平放在有2×SSC的湿盒中，盖盖，然后一起放入46℃孵育箱中，杂交1.5小时；（4）将冲洗缓冲液预热到48℃，备用。

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