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活性污泥样品荧光原位杂交实验方法研究

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通 过调 整样 杂交图片 ，可以清晰的辨别被 杂 交细菌的大 小、形 态
及 分布 ，但 与探 针 Ｅ Ｂ ３ Ｕ ３ ８杂 交 的 细 胞 和 被 Ｄ Ｐ 染 色的 细 胞 尚不 能 完全 重合 ， 因此 仍 需进 一 步 改进 实 验 方 法 。 ＡＩ 关 键 词 ：活 性 污 泥 ；固定 ； 交 ；自发 荧 光 杂 文献标识码 ： Ａ 文章 编 号 ：０ １３４ （０ １ ０ － ０ －４ １０ － ４ ２ １ ）４０ ５０ ６ ０ 中 图分 类 号 ： 一３ ； ７ Ｑ ３６ Ｘ１２
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（ ．天津创业环保集 团股份有 限公 司 ，天津 １
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３０ ７ ） ００ ４
３０ ８ ； ．中国市政工程华北设计研究 总院 ， ０３１ ２ 天津
摘 要 ：采 用 细 菌 通 用探 针 Ｅ Ｂ ３ ，结 合 Ｄ Ｐ 全 细 胞 染 色技 术 ，探 讨 了针 对 活 性 污 泥 样 品 的 荧 光 原 位 杂 交 实验 方 法 ， Ｕ ３８ ＡＩ
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第 ３ 第 ４期 Ｏ卷
２１年 ０１ ８月
四
川
环
境
Ｖ ｏ． ０ ． ． １ ３ Ｎｏ ４ Ａｕ ｕ ｔ２ １ ｇ ｓ ０ １
Ｓ ＣＨＵＡＮ ＥＮＶＩ Ｉ Ｒ０ＮＭＥＮＴ
・
试 验 研究 ・
活 性 污 泥 样 品 荧 光 原 位 杂 交 实 验 方 法 研 究
聂 英进 ，孙 晓 莹 ， 张 轶 凡 ，林
ｃ ｎ ｂ ｉ ｅ ｎ ｄ ｃｅ ｒ ．Ｈｏ ｅ ｅ ，ｔ ｅ ｃ ｌ ｙ ｒｄｚ ｄ ｂ ｒ ｂ Ｂ３ ８ ｗ ｒ ｏ ｎ ｉ ｌ ｎ ａ ｃ ｒ ａ ｃ ｔ ｈ ｅ ｌ ｓ ｉ ｅ ａ ｅ ｄ ｓ ｒ ｅ ｌａ ｌ ｃ ｙ ｗ ｖ ｒ ｈ ｅ ｌ ｈ ｂ ｉｅ ｙ ｐ ｏ ｅ ＥＵ ３ ｅ ｅ ｎ ｔｅ ｔ ｅｙ ｉ ｃ ｏ ｄ ｎ ｅ ｗｉ ｔ ｅ ｃ ｌ ｔ ｎ ｄ ｓ ｉ ｒ ｈ ｓ ａ
（ 如活性 污 泥 ） 检测 中 的应 用仍 不 成 熟 ，易 受 到样
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荧 光 原位 杂交 （ ｌｏｅｃｎｅＩ ｉ ｙｒ ｉ — Ｆｕｒｓｅｃ ｎＳｔ Ｈ ｂｉ ｚ ｕ ｄａ
的 ｒＮ Ｒ Ａ寡核苷酸探针进行细菌 的显微镜观察 ， Ｊ 随后该技术在系统发育微生物学、微生物生态学、
微生 物 的诊断 和周 围环境 的研 究 中得 到 了迅 速 的发 展 。 目前 在单 一样 品 （ 纯 培 养 菌 种 ） 检 测 中的 如 应 用 已十分 普遍 ，准 确度 较 高 ． ，但 在 复 杂 样 品 ４ ｊ

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[工作]FISH技术的探针要求必须具有较好的特异性

[工作]FISH技术的探针要求必须具有较好的特异性

F ISH 技术的探针要求必须具有较好的特异性、灵敏性和良好的组织渗透性。

根据需要合成的DNA或RNA寡核苷酸探针可识别靶序列内一个碱基的变化, 能够用酶学或化学方法进行非放射性标记。

F ISH 技术不仅能提供静止的实验结果, 还可以动态地观察流动水体中的微生物种群变化, 因此FISH 技术被用于监测环境中微生物在时间或空间上的动态变化, 以帮助人们理解环境中微生物种群的组成和生长动力学。

FISH 的首次应用是在1980 年，Bauman [1]等用荧光染料直接标记探针RNA的3'端，检测到了特异的DNA，1988 年Giovnanoni [2]等将FISH 技术引进到了细菌学，他第一次用放射性同位素标记已知的rRNA寡核苷酸探针进行细菌的显微镜观察，随后该技术在系统发育微生物学、微生物生态学、微生物的诊断和周围环境的研究中得到了迅速的发展。

目前在单一样品( 如纯培养菌种) 检测中的应用已十分普遍，准确度较高［3，4］，但在复杂样品( 如活性污泥) 检测中的应用仍不成熟，易受到样品中所含杂质的影响，出现假阳性或假阴性信号［5］。

本文采用细菌通用探针EUB338，结合DAPI全细胞染色技术，探讨了针对活性污泥样品的荧光原位杂交实验方法，并对自发荧光和真实信号的辨别要点进行了讨论。

[7] Bauman J G J ，Wiegant J ，V an Duijn P . Cytochemical hybridization with fluorochromelabeled RNA. Ⅲ. Increased sensitivity by the use of anti-fluorescein antibodies［J］. Histochemistry，1981，73（4）: 181-193［8］Giovannoni S J ，DeLong E F ，Olsen G J ，Pace N R . Phylogenetic group-specific oligodeoxynucleotide Probes for identification of single microbial cells［J］. Bacteriol，1988，170（21）: 720-726.［3］万春黎. 同步脱氮脱硫工艺生物强化及种群动态分析初探［M］. 哈尔滨:哈尔滨工业大学，2006.123-127［4］任艳红. 降解五氯酚厌氧生物反应器微生物种群结构的分子特性研究［M］. 浙江: 浙江大学，2004.342-145［5］王明义，袁晓燕，宋雪珍，等. 荧光原位杂交法在检测硫酸盐还原菌中的应用［J］.中国现代医学杂志，2008，18( 3) :302-304.荧光原位杂交技术结合分子生物学的精确性和显微镜的可视性, 可进行微生物的空间分布情况分析和特征性微生物的鉴定与定量分析。

荧光原位杂交技术在活性污泥菌群识别中的研究进展_费学宁

荧光原位杂交技术在活性污泥菌群识别中的研究进展_费学宁

关键词 荧光原位杂交（ FISH） 活性污泥 微生物菌群 生物标记 靶向性
Advances in Identification of Activated Sludge Bacteria by Fluorescence in situ Hybridization
Fei Xuening1 ，Cao Yang1 ，Hao Yachao1 ，Chi Yongzhi1 ，Li Yuyou2
FISH 所采用的探针必须具有特异性强，灵 敏 度 高，良 好 的 组 织 渗 透 性。 一 个 典 型 的 寡 核 苷 酸 探 针 长度一般是 15 ～ 30bp［16］。FISH 技术的常用探针可分为 3 类：第 1 类是包括 α 卫星和卫星 Ш 类 的 染 色 体特异重复序列探针；第 2 类是全染色体或染色体区域特异性探针，由一条染色体或其上某一区域几段 不同的核酸片段组成；第 3 类是位点特异性探针，这类探针由 1 个或几个克隆序列组成［15］。
（ 1 Tianjin key laboratory，Department of Environmental and Municipal Engineering，Tianjin Institute of Urban Construction，Tianjin 300384； 2 Department of Civil Engineering，Tohoku University，Sendai 980-8576 Japan ）
摘 要 荧光原位杂交技术（ FISH） 广泛地应用于分析环境微生物的群 落 组 成，能 够 同 时 对 微 生 物 进 行 定 性、定量分析，并确定微生物群落空间分布情况。本文阐述了 FISH 法应用于活性污泥处理系统的重要作用，综 述了 FISH 法在活性污泥及生物膜微生物 菌 群 的 组 成、结 构 与 功 能 的 研 究 和 应 用，同 时 讨 论 了 其 在 应 用 中 存 在 的不足，并在此基础上总结了一系列可供改进的措施，最后对 FISH 的灵敏度、靶向性的改性等进行了展望。
活性污泥样品荧光原位杂交实验方法研究

活性污泥样品荧光原位杂交实验方法研究

活性污泥样品荧光原位杂交实验方法研究聂英进;孙晓莹;张轶凡;林姣【摘要】Bacterial universal probe EUB338 and DAPI total cell-staining technology were used to research a fluorescence in situ hybridization experimental method for active sludge.By changing pre-treatment procedure and type of fixative,a series of ideal pictures of fluorescence in situ hybridization were obtained,in which the size,shape and distribution of the hybridized cells can be discerned clearly.However,the cells hybridized by probe EUB338 were not entirely in accordance with the cells stained by DAPI,so the experimental method should be improved further.%采用细菌通用探针EUB338,结合DAPI全细胞染色技术,探讨了针对活性污泥样品的荧光原位杂交实验方法,通过调整样品预处理方法及固定剂类型得到了较理想的荧光原位杂交图片,可以清晰的辨别被杂交细菌的大小、形态及分布,但与探针EUB338杂交的细胞和被DAPI染色的细胞尚不能完全重合,因此仍需进一步改进实验方法。

【期刊名称】《四川环境》【年(卷),期】2011(030)004【总页数】4页(P5-8)【关键词】活性污泥;固定;杂交;自发荧光【作者】聂英进;孙晓莹;张轶凡;林姣【作者单位】天津创业环保集团股份有限公司,天津300381;天津创业环保集团股份有限公司,天津300381;天津创业环保集团股份有限公司,天津300381;中国市政工程华北设计研究总院,天津300074【正文语种】中文【中图分类】Q-336;X172荧光原位杂交 (Fluorescence In Situ Hybridization，FISH)是把非放射性的荧光信号基团标记在特异性碱基序列的核酸探针上，再用带有荧光标记的探针与固定在玻片或滤膜上的细胞中特定的核苷酸序列进行杂交，然后在荧光显微镜下对荧光信号进行辨别和摄像。

荧光原位杂交

荧光原位杂交

荧光原位杂交(FISH)实验操作步骤荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH)是一个很重要的生物学实验技术，它的特点是原位，无需经过PCR，可以用于对环境样品中特定的微生物进行定量分析。

下面是以活性污泥为例的FISH实验步骤及方法。

非生物学专业的同学请不要往下看了。

1 载玻片涂层处理（Slide coating）(1) 将载玻片置于盐酸乙醇溶液（1%HCl in 70% Ethanol）中清洗(2) 晾干后放入poly-L-lysine(0.01%)溶液中5分钟(3) 放入60℃烘箱60分钟烘干或者放在室温过夜晾干2样品固定（Sample fixation）(1) 在样品（活性污泥）中加入3倍体积的4% 多聚甲醛（paraformaldehyde），置于4℃冰箱固定3小时以上或者过夜(2) 离心，弃去多聚甲醛，加入相同体积的PBS(3) 离心，弃去PBS，加入相同体积的乙醇+PBS(w/w 1:1)(4) 固定后的样品放入-20℃冰箱保存。

3 脱水（Dehydration）(1) 将适量固定后的样品放在载玻片上，(2) 放入46℃烘箱烘干10分钟(3) 依次浸入50%，80%，96%的乙醇溶液，各3分钟(4) 在空气中晾干4 杂交（Hybridization）(1) 加10微升Hybridization buffer（配制方法见下面表格）到玻璃片的样品上，尽量让样品全被覆盖(2) 在Hybridization buffer上加1微升探针（Probe）(3) 在50ml离心管中放一张润湿的吸水纸，将玻璃片放入，然后一起放到46℃恒温箱，杂交1.5小时(4) 将Washing buffer（配制方法见下面表格）预热到48℃，准备下一步使用5冲洗(1) 杂交1.5小时之后，快速将玻璃片放入48℃Washing buffer(2) 在48℃恒温箱中放置30min(3) 用超纯水润洗玻璃片，然后再空气中晾干6镜检晾干后，将样品用适量的antifading reagent 覆盖，盖上盖玻片，然后就可以放到共聚焦显微镜（Confocal laser scanning microscopy）下观察了。