牙周膜干细胞的研究

有限稀释法分离纯化人牙周膜干细胞的实验研究目的体外分离培养人牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）并进行鉴定。

方法采用有限稀释法分离和纯化PDLSCs并通过克隆形成及多向分化实验，鉴定所得细胞的增殖和分化能力。

结果分离纯化所得细胞均为长梭形或者不规则形，克隆细胞呈旋涡状集落生长趋势，体外诱导条件下可向成骨细胞、脂肪细胞分化，具有干细胞增殖和多向分化的特性。

结论有限稀释法分离纯化的PDLSCs具有间充质干细胞的表型及增殖和多向分化的生物学特性。

Abstract：Objective To isolate and culture the human periodontal ligament stem cells（PDLSCs）in vitro and to identify them.Methods PDLSCs were isolated and purified by limiting dilution method.The proliferation and differentiation ability of the obtained cells were identified by clonal formation and multidirectional differentiation experiments.Results The purified cells were fusiform or irregular in shape，cell clone was spiral colony growth trend under induction to osteoblasts，adipocytes，with characteristics of proliferation and multi cell differentiation.Conclusion PDLSCs isolated and purified by limited dilution method have the phenotype of mesenchymal stem cells and the biological characteristics of proliferation and multi-directional differentiation.Key words：Finite dilution method；Human periodontal ligament stem cells；Clonal formation；Induction differentiation牙周病是一种慢性炎症骨吸收疾病，是造成成年人牙齿丧失最主要的原因[1-2]。

牙周干细胞---郭娜(1)牙周干细胞是一种可以自我更新、多向分化和功能多样的细胞，可以分化为骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞等。

近年来，科学家在牙周干细胞的研究领域取得了一些重要进展。

一、牙周干细胞的定义和发现牙周干细胞是指存在于成人牙周组织中的一类多能干细胞，其具有自我更新、多向分化和功能多样性。

牙周干细胞最早是在 2000 年由中国香港大学的研究人员郭娜和她的团队首次发现的。

二、牙周干细胞的应用1. 治疗牙周炎：牙周干细胞可以分化为成骨细胞和软骨细胞，这些细胞可以促进骨组织和软骨组织的生成，对于治疗牙周炎有很好的效果。

2. 治疗骨骼疾病：牙周干细胞可以分化为成骨细胞，有助于骨骼再生和骨折愈合。

3. 神经再生：牙周干细胞可以分化为神经细胞，有助于神经再生和神经系统疾病的治疗。

4. 美容修复：牙周干细胞可以分化为皮肤细胞，可以用于皮肤修复和美容。

三、牙周干细胞与牙周炎牙周炎是一种常见的口腔疾病，如果不及时治疗，会导致牙齿松动、牙龈退缩等问题。

研究发现，牙周干细胞可以分化为成骨细胞和软骨细胞，有助于骨组织和软骨组织的生成，可以用于治疗牙周炎。

四、牙周干细胞的提取牙周干细胞的提取可以通过口腔牙周组织或冠周膜活组织的手术获得。

在采集后，可以通过分离、扩增和培养等方法获得足够的牙周干细胞。

在使用前，需要进行充分的检测和鉴定，以确保其安全性和有效性。

五、结语牙周干细胞是一种极具潜力的多能干细胞，具有广泛的应用前景。

目前，科学家正在进一步探索其在医学上的应用，相信这些研究会为我们带来更多的医疗突破和创新。

人牙周膜干细胞培养
上了研究生就开始养牙周膜干细胞，经历了小半年无数次的失败，可能有快100颗牙齿了吧，那些个无助和绝望的黑夜之后，最近终于摸到规律细胞大批量出来了，总结以下几点，个人觉得能较大幅度的提高成功率，希望对大家有帮助：
1.牙齿的来源当然是最重要的，越年轻的牙齿出来细胞越容易，成功率也越高，13岁以下的正畸牙和20岁以下的智齿都算是活性很好的，当然25岁以下的牙齿基本上都能出，这里只讨论相对较优的情况；
2.收牙的时候DMEM培养基＋10%双抗，最好2小时以内就处理了，记得离心管盖子要封口膜封上，而且牙齿直接从牙钳放入准备好的离心管，尽量减少污染风险，毕竟口腔三大菌。

3.具体操作分别有酶消化和组织块翻瓶酶消化这两种，就我的结果来说，翻瓶的成功率相对高些。

0.2ml血清铺瓶后尽量将组织块分的十分小，且组织块与组织块之间离得近些，这样万一其中某个出来了，其他的也会受它影响。

加入4ml20%培养基后，3.5-4小时翻瓶，翻了瓶之后就不要动它了,这点很重要，千万千万不要因为关心经常去看，5天后（也就是隔4天）再拿出来看，一般就能看到奇迹啦img（中间可以远远看看培养液干没，没干就等着）。

细胞出来之后每3天换一次液。

切记，一开始一定不要动它，让小宝宝自己好好的发挥，这点超级重要；
4.消化的时候1颗牙0.5ml I型胶原酶＋0.5ml中性酶，记得是根中1/3的牙周膜，不要太使劲刮下来牙骨质啦，刮的太靠根颈部和根尖则有可能导致其他细胞污染（牙龈上皮细胞、牙髓干细胞）。

5.牙周膜干细胞成功率本来就比较低，文献上说大概是30%，如果出不来也不要着急，你用心的话小细胞一定不会辜负你的。

来源于丁香园论坛nadiaa。

牙周膜干细胞的研究进展牙周组织工程是牙周病治疗研究的热点，牙周膜干细胞是其关键种子细胞之一。

本文就牙周组织工程的相关研究和牙周膜干细胞的来源、分离与培养、细胞表型、生物学特性、功能影响因素和分子调控进行综述，并对其面临的挑战和前景作一讨论。

标签：牙周组织工程；牙周膜干细胞；挑战；展望Research progress on periodontal ligament stem cellsDong Zhengmou1，2, Liu Luchuan1.（1. Dept. of Stomatology, Institute of Field Surgery, Daping Hospital, The Third Military Medical University, Chongqing 400042, China; 2. Dept. of Stomatology, People’s Hospital of Hongan, Huanggang 438400, China）[Abstract]The periodontal tissue engineering has been a striking research on the treatment of periodontal dis－ease, and the periodontal ligament stem cell is one of the key seed cells on the periodontal tissue engineering. In this study, a related research on periodontal tissue engineering, and the source, isolated and cultured, cell pheno－type, biological characteristics, influential factor of function, molecular regulation on the periodontal ligament stem cells would be reviewed, meanwhile the challenges and prospects on it would be discussed.[Key words]periodontal tissue engineering；periodontal ligament stem cell；challenge；prospect牙周病是人类口腔疾病中的常见病和多发病，常导致牙周支持组织破坏或缺损，严重影响人类的生理和心理健康。

3D培养促进牙周膜干细胞矿化及抗炎特性的实验研究的开题报告研究背景：牙周膜（periodontal ligament，PDL）是牙齿根部与牙槽骨之间的重要连接组织，其中含有牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs），具有多向分化和自我更新的潜能。

牙周炎是PDL发炎，导致牙周膜中的各种成分遭受破坏，最终导致牙齿松动脱落的一种慢性疾病。

目前，牙周炎已成为全球性公共卫生问题。

传统的牙周膜干细胞培养方式多为二维培养，但这种方式在维持细胞生长和功能上存在一定局限性。

而采用3D培养模式，能够更加真实地模拟生物体内的细胞环境，提高细胞的生长和分化能力，并增强其抗炎和矿化能力。

研究目的：本文旨在研究3D培养模式对PDLSCs的影响，探究其矿化和抗炎作用，为牙周炎的治疗提供新的基础研究理论和实践依据。

研究方法：1. 制备3D培养体系：利用培养基与牙周膜细胞外基质（extra-cellular matrix，ECM）的共同作用，在含有ECM的培养基内制备3D培养体系。

分别以二维培养和常规3D培养方法为对照组。

2. 分离和鉴定PDLSCs：从人口腔组织中分离PDLSCs，并鉴定其干性和分化潜能。

用多色流式细胞仪测定其表面标志物CD90、CD146和CD105的表达情况。

3. 比较细胞增殖率：采用CCK8试剂盒测定培养物中不同培养条件下PDLSCs的增殖率。

4. 矿化和抗炎作用的研究：采用碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色和荧光共聚焦显微镜检测PDLSCs的矿化能力。

同时检测细胞中多肽因子IL-6和TNF-α的表达量，用以观察其抗炎作用。

研究意义：通过研究3D培养模式对PDLSCs的影响，探究其矿化和抗炎作用，对于研究牙周炎的病因及治疗提供理论基础和实践依据，具有重要的研究意义和应用价值。

牙周膜细胞功能研究总结牙周膜是位于牙根和牙槽骨之间的一种结缔组织，其中的细胞成分在维持牙周组织的健康和稳定方面发挥着至关重要的作用。

牙周膜细胞主要包括成纤维细胞、成骨细胞、破骨细胞、成牙骨质细胞以及牙周膜干细胞等。

对这些细胞功能的深入研究，有助于我们更好地理解牙周疾病的发生机制，以及开发新的治疗策略。

成纤维细胞是牙周膜中最丰富的细胞类型，它们合成和分泌胶原蛋白、弹性纤维等细胞外基质成分，为牙周组织提供支持和韧性。

成纤维细胞还参与牙周组织的修复和再生过程，当牙周组织受到损伤时，成纤维细胞会增殖并迁移到损伤部位，合成新的基质以促进愈合。

此外，成纤维细胞还能通过分泌细胞因子和生长因子，调节其他牙周膜细胞的功能。

成骨细胞负责骨的形成和矿化，在牙周膜中，它们参与牙槽骨的重塑和修复。

成骨细胞能够合成骨基质蛋白，如骨钙素和Ⅰ型胶原蛋白，并在骨基质矿化过程中发挥关键作用。

当牙周组织受到炎症刺激或机械损伤时，成骨细胞的活性会受到影响，导致牙槽骨吸收和破坏。

破骨细胞则与成骨细胞的功能相反，主要负责骨的吸收和降解。

在正常的生理过程中，破骨细胞和成骨细胞协同工作，维持牙槽骨的动态平衡。

然而，在牙周疾病中，破骨细胞的过度活化会导致牙槽骨的快速破坏和吸收，加重病情。

成牙骨质细胞是形成牙骨质的主要细胞类型，它们能够合成和分泌牙骨质基质，将牙根固定在牙槽骨中。

成牙骨质细胞的功能异常可能导致牙骨质的形成障碍，影响牙齿的稳定性和牙周组织的健康。

牙周膜干细胞是一种具有自我更新和多向分化潜能的细胞群体。

它们可以分化为成纤维细胞、成骨细胞、成牙骨质细胞等牙周膜细胞类型，为牙周组织的再生提供了细胞来源。

近年来，对牙周膜干细胞的研究成为了牙周组织工程领域的热点，通过体外培养和扩增牙周膜干细胞，并将其移植到受损的牙周组织中，有望实现牙周组织的完全再生。

在研究牙周膜细胞功能的过程中，科学家们采用了多种实验技术和方法。

例如，细胞培养技术可以在体外模拟牙周膜细胞的生长环境，研究细胞的增殖、分化和功能；免疫组织化学和原位杂交技术可以用于检测细胞中特定蛋白和基因的表达；动物实验则可以在体内观察牙周膜细胞在生理和病理状态下的行为和作用。

牙周膜干细胞论文：牙周膜干细胞的培养和鉴定【中文摘要】本研究从离体牙的牙周膜上分离出牙周膜细胞群,并对其进行纯化；在此基础上,对纯化后的细胞进行鉴定。

证实该细胞为“干细胞性”细胞,为后续牙周组织工程研究提供实验基础。

方法：1.分离纯化人牙周膜干细胞收集临床因正畸或阻生拔出的无龋病、无牙周病的恒牙,取根中1/3的牙周膜,采用酶解组织块法分离到牙周膜细胞群,然后有限稀释克隆法对牙周膜细胞群进行纯化,通过MTT法分析牙周膜细胞群与纯化后的牙周膜细胞的生长情况。

2.牙周膜来源干细胞的初步鉴定采用流式细胞仪分析细胞周期和细胞表面标记物,经成骨诱导液诱导细胞,对细胞进行初步鉴定。

结果：1.有限稀释克隆纯化后的细胞呈长梭形,通过MTT检测,证明该细胞是慢增殖周期的细胞。

2.流式细胞仪检测纯化后的细胞的周期特点和细胞表面标志物,证实其符合干细胞特性。

3.诱导纯化后的细胞成骨分化,细胞出现单极化,其间有针尖大小的钙结节形成,证实纯化后的细胞具有分化潜能。

结论：1.酶解组织块法有效分离到人牙周膜细胞群,有限稀释克隆纯化获得的牙周膜干细胞保持了其生物学特性。

该细胞具有干细胞周期特点,且有成骨分化潜能。

2.培养出牙周膜干细胞,可为组织工程提供基础。

【英文摘要】:Periodontal ligament cell populations were isolated from the periodontal membrane of extracted teeth and were purified; On this basis, the purified cells wereidentified. This paper confirmed that the cells were “stem cells” cells, to provide a basis for follow-up study of periodontal tissue engineering experimental.Methods:1. Separation and purification of human periodontal ligament stem cells Collecting the permanent teeth removal, without caries and periodontal disease, was indicated in the clinical cases due to orthodontic or impacted. Take the periodontal membrane on the middle 1/3 of the root surface. We separated cells within the periodontal tissue membrane by enzymatic, purified cells by limiting dilution cloning. The growth of periodontal ligament cell populations and purified periodontal ligament cells were analyzed by MTT.2. preliminary identification of Periodontal ligament stem cells:Cell cycle and cell surface markers were detected by flow cytometry. Osteogenic medium induced cells to identified cells.Results:1. Cells purified by limiting dilution cloning appeared Spindle. The results show that the cell is a slow proliferation cycle stem cells by MTT detection.2. The cells purified were detected cell surface markers and cell cycle characteristics by flow cytometry. The result demonstration that the cells accordance with characteristics of stem cell.3. Purified cells were induced by osteogenic medium, cells were unipolar, there have been needlethe size of calcium nodules, confirmed that the purified cells possess differentiation potential.Conclusion:1. Cells which maintain their biological characteristics were effectively isolated by Enzymatic and purified by limiting dilution cloning. And the cells have characteristics of stem cell cycle and potential of Osteogenic differentiation.2. Cultured periodontal ligament stem cells provide the basis for tissue engineering.【关键词】牙周膜干细胞组织工程细胞鉴定【英文关键词】Periodontal ligament stem cells Tissue Engineering Cell identification【目录】牙周膜干细胞的培养和鉴定摘要3-4ABSTRACT4-5缩略词表7-8第1章引言8-9第2章人牙周膜干细胞的分离培养和鉴定9-18第一部分分离纯化人牙周膜细胞9-13 1 材料和方法9-11 1.1 主要试剂和仪器9-10 1.2 细胞的分离和纯化10-11 2 结果11-12 2.1 细胞生长的情况11 2.2 细胞的克隆形成情况11 2.3 细胞生长曲线11-12 3 讨论12-13第二部分筛选纯化后的人牙周膜干细胞的鉴定13-18 1 材料与方法13-15 1.1 主要试剂与仪器13-14 1.2 方法14-15 2 结果15-16 2.1 流式细胞仪分析结果15 2.2 成骨分化诱导后细胞形态15-16 3 讨论16-18第3章结论与展望18-19致谢19-20参考文献20-22附图22-24攻读学位期间的研究成果24-25综述25-34参考文献32-34。

人牙周膜干细胞的分离培养及生物学特性研究目的：分离筛选人牙周膜干细胞，研究其生物学特性并进行初步鉴定。

方法：采用STRO-1为标记物以免疫磁珠分离筛选人牙周膜干细胞，观察细胞生长及克隆形成情况，流式细胞仪细胞周期、细胞表型分析，免疫细胞化学染色技术检测STRO-1、Vimentin表达，并测定细胞体外多向分化能力。

结果：免疫磁珠法可获得人牙周膜干细胞，细胞具有克隆形成能力，增殖速度低。

细胞周期分析大多数细胞处于G0/G1期,为慢周期性;细胞表型分析证实CD146、CD44高表达，CD34、CD45低表达。

STRO-1及Vimentin均为阳性染色，矿化诱导和成脂诱导证实该细胞具有多向分化能力。

结论：免疫磁珠法是有效的分离纯化牙周膜干细胞的方法。

所分离细胞具有干细胞的细胞周期、表型特点及多向分化能力。

Abstract:ObjectiveTo isolate and identify the periodontal ligament stem cells and demonstrate its bionomics. MethodsPDLSCs were isolated by immunomagnetic method. The flow cytometry and immunocytochemistry procedure were used to disclose the cell cycle and surface marker of the PDLSCs.Osteoinduction and adipoinduction were done to conform the multidirectional differentiation of PDLSCs. ResultsThe acquired cells had clonality and low proliferation. Most of the cells were in phase G0 /G1 and there were high expression of CD146 and CD44 on these cells, meanwhile, CD34 and CD45 were of low expression. The cells were Vimentin and STRO-1 positive while their multidirectional differentiation ability was confirmed in vitro. Conclusionimmunomagnetic method was an effective way to isolate and purify the PDLSCs. The acquired cells showed the characteristics of stem cells.Key words:stem cell;human periodontal ligament stem cell;immunomagnetic beads;flow cytometry;immunocytochemistry研究证实牙周膜内存在具有横向分化能力的干细胞(牙周膜干细胞)，在体外微环境作用下还可分化为成牙骨质细胞或成骨细胞[1-2]。