细胞培养与病毒培养实验步骤

病毒TCID50测定病毒TCID50测定是一种常见的病毒滴度测定方法。

下面将介绍具体的操作步骤。

首先，需要准备好细胞。

取出一块细胞培养板，每个孔铺成单层大约60％丰度即可接种病毒。

对照选取16个孔即可。

注意不要窜孔，保证实验条件一致。

其次，稀释待测病毒液。

可以采用A法或B法。

在A法中，向每支试管中加入1.8ml病毒稀释液，依次10倍系列稀释至适宜浓度。

在B法中，可以根据病毒大致的滴度确定稀释的倍数，并根据接种的孔数稀释病毒。

接下来，进行接种。

用多道加样器吸去96孔板中的培养液，吸取孵育液加在每孔中再轻轻吹打一次，然后吸出孵育液。

将稀释好的病毒液加到96孔板上，每孔100µl，根据观察的惯，一般从右到左，从上到下，从高稀释度到低稀释度到原液加样。

切记要设置正常的细胞对照，每次实验要重复4次，计算标准差。

最后，进行培养。

37℃CO2培养箱中孵育1h，取出培养板吸去病毒液，加入维持液200µl继续在37℃CO2培养箱中培养。

实验方法将待检病毒接种于细胞培养物中，培养时间为5天，培养温度为37℃，CO2浓度为5%。

测定结果取出培养板，使用显微镜观察细胞病变情况。

根据病变程度，计算出病毒的浓度。

计算方法1) ___-Karber法利用病变程度计算出病毒的50%细胞传染量（CCID50），计算公式为：LgCCID50/0.2ml= -（X-d/2 + d×∑R1/N1）,其中X代表全部病变最低稀释度对数，d代表稀释因数对数，N1代表每个稀释度所种的孔数，R1代表病变孔数，∑代表积和。

2) Reed-Muench法观察细胞病变情况，找出能引起半数细胞感染的病毒稀释倍数，按照Reed和Muench公式计算出该病毒液的50%细胞传染量（TCID50）。

根据实验结果，能使50%细胞感染的病毒稀释度在10^-4~10^-5之间，根据Reed和Muench公式计算出TCID50.。

细胞免疫检测注意事项：
1. 分离淋巴细胞的速度要快，避免体外长时间操作导致
过多淋巴的活性降低和死亡。
2. 台盼蓝染色计数，保证实验组间有效细胞的数量相同。 3. 准备免疫原性较好的刺激，并通过预实验确定最佳刺 激剂量。 4. RNA提取时，不丢弃24孔板中淋巴细胞上清。 5. 严格按照细胞因子ELISA试剂盒操作步骤实验。
ELISA抗体
1. 制备良好的抗原包被ELISA板—纯化的蛋白或病毒
（1）蛋白质与酶标板的结合主要是靠疏水作用的物理吸附，而包被液 的PH大于蛋白的PI，有利于蛋白质疏水键的适当暴露。 （2）酶标板聚苯乙烯表面暴露的主要是C－H键，包被液PH大于蛋白 PI，使蛋白质带上负电荷，有利于蛋白质与酶标板的牢固结合，提 高包被效率。
Sf9 or Sf21 cells ——主要用于转染，空斑实验和滴度测定 High Five™ cells or Mimic™ Sf9 cells ——转染效率低，主要用于蛋白表达
Grace's Insect Medium with L-glutamine and
supplemented with（pH 6.5）：
BacPAK™ Rapid Titer Kit
本测定方法，以针对杆状病毒囊膜蛋白gp64的 单克隆抗体标记被病毒感染的细胞，然后以HRP-标 记的二抗与感染细胞进行染色。通过底物显色，在
光学显微镜下计数感染斑点的数量，经过稀释倍数
的换算，即可得出病毒的滴度（IFU/ml）。
注意事项：
1. 细胞铺板5 ×106 cells/well，细胞计数要准，台盼蓝染 色，保证细胞活力≥ 95%。
获得重组杆状病毒——转染Sf9 cells
1. 小提好的Bacmid DNA，置4 ℃不超过1周 2. 转染试剂：Cellfectin® ⅡReagent 3. 转染后细胞的形态变化

利用293T细胞扩增腺病毒CCL22操作步骤（1）在100mm培养皿或75cm2培养瓶中加入10ml DMEM5%培养5×106 293T细胞。

（2）取0.5ul首次扩增的病毒保存液，加入DMEM5%至1ml，混匀，这样稀释应得到的MOI值约为5。

（3）移去培养液，小心加入病毒混合液，切勿破坏细胞单层，十字形慢慢晃动3次，37℃ CO2孵箱中培养90分钟。

（4）加入9ml DMEM5%。

（5）再培养72小时，这时在10ml溶液中大约有5×109~5×1010个病毒颗粒，进行MOI测定以估计病毒颗粒。

注：如果此时得到的病毒量已足够，可立即进行病毒滴度测定。

收集细胞，600×g离心5分钟沉淀细胞，去上清后加入最小体积（一般为原始体积的1/10即1ml）病毒保存溶液重悬细胞。

-20℃/37℃冻融3次，台式离心机上以最大速率离心去除细胞碎片，收集上清，然后进行病毒滴定。

（6）-20℃/37℃冻融3次。

（7）转入15ml无菌离心管中，台式离心机上以最大速率离心10分钟，收集上清冻存于-20℃或-80℃。

（8）3个175cm2培养瓶中各加入107 293T细胞进行培养。

（9）将3ml细胞裂解液上清加入12ml DMEM5%中，混匀。

移去细胞培养液，每瓶小心加入5ml混合液，十字形慢慢晃动混匀3次，37℃CO2孵箱中培养90分钟。

此时MOI值约为25。

（10）加入DMEM5%至30ml。

（11）再培养48~72小时。

此时10ml培养液病毒量约为3×1010~3×1011。

若需要，进行MOI测定以估计病毒滴度。

注：此时如果病毒量已足够，则可立即进入病毒滴定步骤。

600×g离心5分钟收集细胞，弃上清，加入1/10原始体积的溶液重悬细胞。

-20℃/37℃冻融3次，台式离心机上以最大速率沉淀细胞碎片，收集上清，进行病毒滴定。

（12）移入50ml离心管中，台式离心机上最大速率离心10分钟，取出上清保存。

实验步骤：
1．准备目的细胞
1.1 细胞复苏 1) 从液氮罐中取出细胞冻存管 2) 迅速放入37℃水浴中，并不时摇动使其尽快解冻 3) 完全解冻后，1000rpm，离心2min 4) 70%酒精擦拭冻存管消毒后，移至超净台 5) 吸去冻存液上清，加入1ml 新鲜的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种至含有3 ml 含 完全培养基的6-cm dish 中，轻轻晃匀后置于37℃、5%CO2 培养箱培养 6) 次日更换一次培养液后再继续培养 1.2 细胞传代 1) 将生长90%汇合的细胞进行传代 2) 弃去旧培养液，加入2 ml 灭菌的D-Hank’s 溶液，洗涤细胞生长面，然后弃去该溶液 3) 加入1 ml 胰酶消化液，37℃消化约1-2 min，直到细胞完全消化下来 4) 加入完全培养基2ml，用刻度吸管吹打数次，将壁上的细胞冲洗下来 5) 混匀细胞后分至两个新的6-cm dish 中，补足完全培养基至4ml，继续培养
慢病毒感染细胞 操作手册
实验流程描述
培养生长状态良好的目的细胞，病毒感染前一天将目的细胞分入6-well 培养板培养，感染 当天按实验设计的组别加入慢病毒颗粒进行目的细胞的感染实验。感染3 天后荧光显微镜下 观察GFP 表达情况，荧光率达80％以上，待细胞长满培养板收集细胞检测。
实验材料：
试剂
试剂名称 胎牛血清 FBS DMSO DMEM 胰酶 Opti-MEM
2． 目的细胞慢病毒感染
1) 处于对数生长期的目的细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液 2) 将细胞悬液（细胞数约为5×104）接种于6-well 中，37℃ 5%CO2 培养箱培养待细胞融 合度达到约30% 3) 根据细胞MOI 值，加入适宜量的病毒 4) 12h 后观察细胞状态：如果没有明显的细胞毒性作用，继续培养24h 后更换培养基；如 果有明显的细胞毒性作用，立即更换培养基 5) 感染3 天后观察慢病毒上报告基因GFP 的表达情况，荧光率大于80%者，将细胞分成两 分，一份分于12孔培养板中待长满后收集细胞用于RNA提取，一份分于6孔板中待长满后收集 细胞用于蛋白提取；感染效率低于80%的实验组，重新进行感染实验 6) 以上的操作是针对贴壁细胞设计的。悬浮细胞的区别主要在细胞分盘上，它不需要提前 一天分盘。操作时将细胞离心后悬浮在不同的培养基中，计数分盘后，就可以加入病毒。 操作时污染了病毒的管子和枪头以及培养基和最后的细胞都CO2 培养箱 生物安全柜

系列稀释的病毒液
单层细胞
接种病毒
10-1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 -8 -9 -10 -11 -12
观察CPE
37℃培养
1. Reed法 lg TCID50 = CPE>50%稀释度对数 + 距离比例×稀释倍比数对数
距离比例 = CPE>50%百分数-50% CPE>50%百分数-CPE<50%百分数
lg TCID50 = CPE>50%稀释度对数 + 距离比例×稀释倍比数对数
= -3 + 0.29 ×(-1) = -3.29
TCID50 = 10-3.29,0.1mL 含义：该病毒稀释至10-3.29,每孔细胞接种0.1mL，半数细胞孔
出现CPE。 病毒毒价:通常以每mL含多少TCID50表示.
4.微载体培养
是在悬浮培养的基础上，结合微载体的细胞培养技术。
微载体直径应为60～105nm，无毒性，透明，颗粒密度与培 养液密度相近似，略重于液体，低速搅拌即能悬浮，不吸收 培养液和化学反应，细胞可贴附其上长成单层。
由于微载体数量较大，所获得的细胞数也比上述常规方法大 为增加，对规模化的细胞或疫苗生产很有吸引力，但增高了 生产成本。微载体有若干型号，已商品化。
0
10-3
5
3
10-4
1
7
10-5
0
8
累计 CPE孔数 无CPE孔数
22
0
14
0
出现CPE孔 比例
100(22/22)
100(14/14)
6
3
1
10
0
18
66.7(6/9) 9.1(1/11)
0(0/18)

病毒的分离与鉴定简介：病毒是一种微生物，属于病原体的一种。

它可以寄生于宿主细胞中，并利用宿主细胞的代谢系统繁殖。

为了进行研究和控制病毒的传播，科学家们需要对病毒进行分离和鉴定。

本文将介绍病毒的分离和鉴定的方法和步骤。

一、病毒的分离病毒的分离是指将病毒从混合物中单独提取出来。

以下是一些常用的病毒分离方法：1. 细胞培养法：这是一种常用的病毒分离方法。

首先，将病毒样本接种到细胞培养基中培养，待病毒感染细胞后，观察细胞形态的改变、病毒颗粒的释放等现象，进而证实病毒的存在。

2. 动物接种法：这是一种直接将病毒样本接种到实验动物体内的方法。

通过观察动物是否出现病征，如发热、无食欲等，可以初步判断病毒的存在。

3. 超速离心法：这是一种利用离心的原理将病毒从样本中分离出来的方法。

通过对病毒样本进行一系列的离心操作，可以使病毒沉积于管底，从而得到纯净的病毒悬液。

二、病毒的鉴定病毒的鉴定是指确定分离的病毒属于哪一种或某一类病毒的过程。

以下是一些常用的病毒鉴定方法：1. 电子显微镜观察法：使用电子显微镜观察病毒的形态、结构和大小等特征。

这种方法可以给出病毒的直接信息，帮助科学家们确定病毒的种类。

2. 免疫学方法：通过免疫学方法如酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光等，检测病毒与抗体的特异性反应。

根据反应结果，可以初步鉴定病毒的种类。

3. 分子生物学方法：利用PCR、基因测序等分子生物学方法，可以对病毒样本进行基因分析，进一步确认病毒的物种。

这些技术可以检测病毒的基因序列，通过与已知病毒的序列进行比对，鉴定病毒的种类和亲缘关系。

结论：病毒的分离和鉴定是研究和控制病毒传播的重要步骤。

通过适当的分离方法，可以有效地将病毒从样本中提取出来，并通过鉴定方法确定病毒的种类和特性。

病毒的分离和鉴定是研究和治疗病毒相关疾病的基础，也为疾病的监控和防控工作提供了重要的支持。

注意，为了确保实验室安全，病毒的分离和鉴定应在合适的实验条件下进行，并且遵循相关的实验规范和操作流程。

贴壁细胞慢病毒转染步骤及方法
一、细胞培养Panc-1 细胞，常规培养使用含10% FBS (GIBCO) 的DMEM 培养基（含1.5 mg/L-Glutamine，100 U/mL penicillin，100 μg/mL Streptomycin) 中，37ºC 5% CO2饱和湿度培养箱中培养。

二、病毒侵染实验材料及试剂DMEM培养基+ 10% FBSPBS（Life Science Products&Services）Trypsin-EDTA Solution (Gibco)24孔板（Corning）Lentivirus-NC 病毒液（GenePharma，1×109 TU/mL）
三、步骤
1. 将状态良好的Panc-1 消化后重悬，取适量细胞接种至24 孔板中，37°C培养箱中过夜；
2. 取阴性对照病毒，按1:10、1:100、1:1000 与DMEM培养基混合稀释，总体积约500 μL，并加入终浓度5 μg/mL Polybrene；
3. 吸去24 孔板中原培养基，换入阴性对照病毒梯度稀释液，37°C培养箱中培养；
4. 24h 后吸去阴性对照病毒稀释液，换入500 μL新鲜培养基，37°C培养箱中培养；
5. 48-96h 于荧光倒置显微镜下观察并记录结果。

人呼吸道合胞病毒大规模培养的方法与流程Respiratory Syncytial Virus (RSV) is a common respiratory viral infection that affects individuals of all age groups. In order to study and understand the virus, large-scale cultivation becomes essential in order to obtain sufficient quantities for research purposes. Here, we will discuss the methods and processes involved in the large-scalecultivation of RSV.我的问题是：人呼吸道合胞病毒大规模培养的方法与流程RSV的宿主细胞主要为肺上皮细胞，这些细胞可在培养皿中进行无限制增殖。

我们需要选择适合的宿主细胞株来实现RSV的大规模培养。

一般而言，常见的肺上皮细胞系例如A549和HEp-2被广泛使用。

The host cells for RSV are primarily lung epithelial cells, which can be proliferated indefinitely in culture dishes.To begin with, it is important to choose an appropriatehost cell line for the large-scale cultivation of RSV. Commonly used lung epithelial cell lines such as A549 andHEp-2 are widely employed in this process.将选定的宿主细胞种植在含有适当培养基和添加剂的组织培养皿中。

293T细胞培养说明书一、实验简介293T细胞是由肾脏细胞系统转染外源基因而产生的细胞系，具有较好的培养性和转染性。

因此，293T细胞常用于基因表达研究，尤其是蛋白表达和病毒载体的构建。

二、培养条件1. 培养基：293T细胞培养最常用的培养基是Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)，其次是RPMI-1640培养基。

2. 氧气浓度：293T细胞培养一般需要一个较高的氧气浓度，如5%~10%。

3. 温度：293T细胞的培养温度一般为37℃。

4. 水分：293T细胞的培养液中的水分一般为95%~100%。

5. 添加物：293T细胞的培养液中通常会添加10%的牛血清，以促进细胞生长。

三、细胞培养步骤1. 将293T细胞从细胞库中取出，放入清洗后的培养皿中，以DMEM培养基浸泡；2. 将培养皿放入培养箱，调节温度为37℃，氧气浓度为5%~10%；3. 将添加10%牛血清放入培养液中，搅拌均匀；4. 用细胞活性检测试纸测定细胞活性；5. 根据细胞活性的变化情况，调整培养液中的水分，以维持细胞的生长；6. 将培养液更换，每1~2天更换一次；7. 定期观察细胞形态，记录细胞生长情况。

四、注意事项1. 在培养293T细胞时，需要注意细胞的温度、氧气浓度以及水分，以保证细胞的正常生长；2. 培养液的清洗和更换要及时，以保证细胞的正常生长；3. 在操作293T细胞时，一定要注意实验室的清洁卫生，以防止细胞的污染。

五、总结293T细胞培养是一种常用的培养方法，在培养293T细胞时，要注意培养液的温度、氧气浓度以及水分，并及时更换培养液，以保证细胞的正常生长。

在实验操作中，还要注意实验室的清洁卫生，以防止细胞的污染。

慢病毒纯化
慢病毒纯化是指从慢病毒病毒培养物中分离和纯化出慢病毒颗粒的过程。

这个过程通常包括以下步骤：
1.细胞培养：首先，需要将慢病毒所感染的细胞系培养到适
当的细胞密度和病毒扩增时间，以确保足够的病毒产量。

2.细胞裂解：将培养的细胞收集并经过离心等方法分离，然
后使用裂解缓冲液裂解细胞，释放出细胞内的慢病毒。

3.离心和过滤：经过细胞裂解后，样品需要进行离心，以去
除细胞碎片和核酸残余物。

然后，可以使用过滤器对澄清
的上清液进行过滤以去除大颗粒物质。

4.病毒浓缩：慢病毒通常是低浓度的，因此需要进行浓缩。

可以使用超滤、离心和沉淀等方法，将病毒颗粒从大量液
体中浓缩到较小的容量中。

5.梯度离心：为了进一步纯化病毒，可以使用梯度离心技术，
如葡聚糖梯度离心或离心浓缩。

这个过程可将纯化的病毒
与细胞碎片、蛋白质和其他污染物分离开来。

6.病毒沉淀：经过梯度离心后，可以进行病毒的最终沉淀。

使用离心来将病毒沉淀到盘底或在离心管底端形成浓缩的
沉淀。

7.再悬浮：将病毒沉淀用缓冲液再悬浮，以便进行后续实验
应用。

在整个慢病毒纯化的过程中，必须遵守基本的生物安全措施，
并使用无菌操作、合适的缓冲液和处理设备。

每一步之间的温度、离心速度和离心时间等参数也需要根据具体的实验条件和病毒类型进行优化和调整。

22
23
….. 211
212
盐 水 250μL 250 μL 250 μL ….. 250 μL 250 μL
收获 尿囊液 250μL 250 L 250 L
….. 250μL 250μL
1% RBC
250μL 250μL 250μL ….. 250μL 250μL
振荡混匀15秒，37C感作10-20分钟。 弃250微升
（一）步骤
3、体温测定：接毒后分别在12、12、6、 6、6、6、6、6h…测定家兔体温。 4、判定标准：从接毒时间算起，体温超 过正常体温1℃或1℃以上连续3次或3次 以上，判定为稽留热型。
（一）步骤
5、病毒收获：选择出现典型稽留 热型的家兔，体温开始下降的24h内 扑杀，无菌采取脾、淋巴结，加5倍 体积的灭菌生理水及适量的抗生素， 制成乳剂备用。
第五讲 病毒的培养与鉴定
一、病毒培养载体类型
☞动物 ☞鸡胚 ☞细胞
二、病毒的动物培养
• 1、优点：对病毒敏感，可以培养其他方法无 法培养的病毒，培养的病毒量大，可以用于研 究病毒的致病作用等。
• 2、缺点：费用较大，不便于管理，容易造成 环境污染。由于动物机体存在免疫力而干扰试 验结果等。
三、猪瘟病毒的家兔培养
1、细胞分散液：取10倍浓缩的含有胰蛋白酶和EDTA的传 代细胞分散液，以无菌三馏水稀释10倍。
2、细胞生长液：在MEM中分别按比例加入下列成分：8％ FCS、2％双抗、1％谷氨酰胺，上述液体按顺序加入后，最后 采用NaHCO3调整pH值。
（三）细胞传代：弃取细胞培养液，加入培养瓶体积0.5％ 的10倍稀释的传代细胞分散液，消化三次，第一次冲洗整个 瓶体，第二、三次平遥细胞培养瓶消化细胞。易消化细胞可 能会出现云雾状，弃去消化液，振克细胞瓶使细胞脱离瓶壁， 并迅速加入细胞生长液终止胰酶。不易消化的细胞第三次消 化后，加入2滴消化液，37 ℃感作一定时间，时常显微镜观 察，当大部分细胞变圆并脱离瓶壁时，振克细胞瓶使细胞脱 离瓶壁，并迅速加入细胞生长液终止胰酶反应。根据细胞量 和生长速度决定分瓶数量。

293T细胞中包装慢病毒的方法慢病毒包装实验方案实验步骤一、细胞培养1、用含10% FBS的H-DMEM培养基于37 °C、5% CO2培养箱中培养293T细胞，其中加100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素和10 μg/ml ciprofloxacin防止支原体污染，2、待10cm皿中细胞融合度到80%左右，用0.25%胰酶消化293T细胞，分到两个6cm皿中，另一盘10cm 293T作同样处理，使细胞在接种之后的18-24 h达到70%融合度。

●注意事项293T细胞转染慢病毒24h之前，培养液中停止使用抗生素和ciprofloxacin，减少对病毒转染的影响；注意接种后的293T细胞密度，过高和过低的细胞密度都会导致转染后细胞死亡。

二、细胞转染3、每个6-cm培养皿在转染之前4 h用5 ml 不含血清的H-DMEM培养基换液，4、应用500 μl Optimum和14.18 μl Lipofactamine2000混匀于室温静置5 min，将500 μl Optimum、1.7 μg 慢病毒载体、1.13 μg psPAX2和0.57 μg MD2.G混匀配制成DNA mixture，然后与静置 5 min的Optimum/Lipofactamine2000混匀，于室温静置20 min后，将混匀后的mixture加入到培养基中。

5、6 h之后将培养基更换为含10% FBS的H-DMEM完全培养基，6、分别收集48 h、72 h和96 h的细胞上清液。

●注意事项①293T细胞容易脱落皿底，加H-DEME沿皿侧壁缓慢加入，并且边加边轻微摇晃使培养基均匀分布皿底防止细胞无培养基死亡②质粒换算要准确，③将mixture加入培养基中要边滴边摇晃培养皿使其mixture与培养基混匀，这样直至结束。

慢病毒感染细胞具体方法及详细步骤
材料和试剂
1. 6 cm细胞培养皿(Fiosher).
2. 人类或小鼠细胞系，细胞试验所需要的生长培养基。

3. 凝聚胺(海美溴铵; Sigma H 9268)
4. 合适的选择性抗生素。

仪器
1. 细胞培养箱
步骤
慢病毒感染方法应该根据不同的细胞系和以细胞为基础的试验来进行优化。

例如，下列的参数应该在大规模的感染之前进行优化，以确定一个实验的最适条件：
1) 细胞种植密度
2) 慢病毒的数量
3) 嘌呤霉素的浓度
4) 感染时间
2. 在6cm培养皿中种植适当密度的细胞，每孔体积6ml。

1) 贴壁细胞：转染前1天种植细胞
2) 悬浮细胞：转染当天种植细胞，培养基中需要含有凝聚胺。

3. 细胞中加入病毒:
1) (贴壁细胞):弃掉培养基，加入新鲜的含有凝聚胺的培养基。

或者，弃掉部分培养基并且补充含有凝聚胺的培养基。

调整体积和凝聚胺的浓度，使得凝聚胺的终浓度为8ug/ml。

4. 病毒感染:
1) 孵育细胞过夜。

2) 感染后24h更换培养基。

弃掉培养基，换入6ml新鲜的培养基。

如果需要抗生素选择，则使用含有抗生素的新鲜培养基。

注意：嘌呤霉素的浓度应该根据每种细胞系来进行优化；常用的浓度范围为：2-5 μg/mL.
5. 孵育细胞，根据需要每隔几天更换培养基(如果需要，则要含有抗生素) 。

孵育时间的长短主要依赖于感染后的试验。

病毒的分离与鉴定病毒是一类微小的病原体，其特点是不能自主繁殖，必须寄生在宿主细胞内才能完成复制过程。

为了有效地控制和治疗病毒引起的疾病，研究人员需要对病毒进行分离和鉴定。

本文将介绍病毒的分离与鉴定的方法和步骤。

一、病毒的分离方法1. 细胞培养法：病毒通常寄生于宿主细胞内，通过培养宿主细胞，可以将病毒从样本中分离出来。

这种方法适用于许多病毒，如流感病毒、乙肝病毒等。

2. 动物接种法：某些病毒只能在特定宿主动物中复制，通过向实验动物接种疾病样本，可以使病毒复制并分离出来。

例如，用小鼠进行实验可以分离出小鼠肝炎病毒等。

3. 组织切片法：对于某些病毒，它们会引起组织的明显病变，此时可以取得感染组织的切片进行病毒分离。

例如，用患病动物的脑组织切片进行病毒分离，可用于研究狂犬病病毒等。

二、病毒的鉴定方法1. 电镜观察法：电子显微镜（TEM）可以观察到病毒的形态和结构特征，通过观察病毒的颗粒形状、大小、壳结构等特征，可以初步确定病毒的种类。

2. 免疫学方法：根据病毒与宿主细胞之间的免疫反应，可以采用免疫学方法进行病毒鉴定。

包括免疫荧光法、酶联免疫吸附试验（ELISA）等，可以检测病毒的抗原或抗体存在。

3. 分子生物学方法：利用PCR（聚合酶链式反应）技术、序列分析等分子生物学方法，可以对病毒的基因组进行检测和鉴定。

这些方法对于那些无法用传统手段鉴定的病毒，如新型冠状病毒等，具有重要意义。

4. 勒芒氏法：这是一种用于病毒核酸的立体构建鉴定方法。

勒芒氏法根据病毒核酸在Denhardt液中染色的不同程度进行鉴定。

在进行病毒的分离与鉴定时，研究人员需要注意采取适当的实验室安全措施，避免交叉感染和意外暴露。

此外，病毒的分离与鉴定是一个复杂的科研过程，需要综合运用各种实验技术和方法，推动疾病防控工作的进展。

总结起来，病毒的分离与鉴定是关键的实验工作，它们为了研究病毒的性质、传播途径以及寻找有效的防治策略提供了基础性的支持。

病毒的分离培养方法
病毒的分离培养是一项重要的实验技术，它可以帮助科研人员更好地了解病毒的特性和行为，为疾病的防控和治疗提供重要的参考。

在进行病毒的分离培养时，需要严格按照一定的步骤和方法进行操作，以确保实验的准确性和可靠性。

首先，进行样本的采集和处理。

样本的选择和采集是进行病毒分离培养的第一步，科研人员需要根据研究的目的和对象选择合适的样本来源，如血液、组织、分泌物等，并严格按照规范的操作流程进行采集和处理，以避免样本受到外界污染或损坏。

其次，进行病毒的分离。

病毒的分离是指将样本中的病毒与其他细胞或微生物分离开来，以便进行后续的培养和研究。

常用的方法包括离心、过滤、离心梯度离心等，科研人员需要根据具体的研究要求选择合适的分离方法，并严格按照操作规程进行实验操作。

接下来是病毒的培养。

病毒的培养是指将已经分离出的病毒在适宜的生长条件下进行增殖和繁衍，以获取足够的病毒量进行后续的研究。

常用的培养方法包括细胞培养、动物体内培养等，科研人员需要根据病毒的特性和研究需要选择合适的培养方法，并严格控
制培养条件，确保病毒的生长和繁殖。

最后，是对培养得到的病毒进行鉴定和纯化。

病毒的鉴定和纯
化是研究病毒特性和行为的重要步骤，科研人员需要借助于生物学、生物化学和分子生物学等技术手段对培养得到的病毒进行鉴定和纯化，以获取纯净的病毒制备物进行后续的研究和应用。

总之，病毒的分离培养是研究病毒学的重要手段，科研人员在
进行病毒的分离培养时，需要严格按照规范的操作流程进行实验操作，确保实验的准确性和可靠性，为疾病的防控和治疗提供重要的
科学依据。

人工培养病毒的方法
人工培养病毒是一项重要的实验技术，它在病毒学研究、疫苗生产等领域具有广泛的应用。

下面将介绍人工培养病毒的方法。

首先，选择合适的培养基是人工培养病毒的关键。

病毒培养基通常包括营养物质、生长因子、缓冲剂等成分，以提供病毒生长所需的营养和环境。

常用的培养基有DMEM、MEM等，选择合适的培养基有助于提高病毒的生长效率。

其次，培养细胞是人工培养病毒的另一个重要步骤。

病毒通常需要利用宿主细胞来完成其复制和生长过程。

因此，选择合适的细胞株对于病毒的培养至关重要。

常用的细胞株有Vero细胞、HEK293细胞等，选择合适的细胞株可以提高病毒的产量和纯度。

接着，感染细胞是进行病毒培养的关键步骤之一。

将病毒接种到培养细胞中，使其感染并复制，从而获得病毒颗粒。

感染细胞的条件包括病毒滴度、感染时间、感染温度等，这些条件的优化可以提高病毒的产量和纯度。

最后，收集和纯化病毒是人工培养病毒的最后步骤。

通过离心、超滤、柱层析等技术手段，可以将病毒颗粒从培养基和细胞残渣中分离出来，从而获得纯度较高的病毒制备物。

总之，人工培养病毒是一项复杂而重要的实验技术，通过选择合适的培养基和细胞株，优化感染条件，以及合理选择纯化方法，可以获得高产量、高纯度的病毒制备物。

这对于病毒学研究、疫苗生产等领域具有重要意义。

希望本文介绍的方法能够对相关研究工作提供一定的帮助。

4. 温度、反应时间、反应体系对血凝试验的结果影 响都很大。温度过高病毒毒力过强会出现溶血， 不利于判定。反应的时间不能太长，对照孔出现 沉淀就可以判定。
思考问题
加病毒液和红细胞悬液时为什么要反向加？ 血凝试验设置空白对照的意义？ 病毒悬液为什么采取倍比稀释而不是更高倍 数如十倍比稀释？
鸡胚原代细胞培养及流感病毒感染细胞的红细胞吸附
鸡胚的结构与生理
鸡胚由三个胚层发育而来，即外胚层，中胚 层和内胚层，它们构成了胚胎的组织与器官
鸡 胚培养的病毒接种
（一）活胚检查
1.血管 2.胎动 3.绒毛尿囊膜
（二）实验材料
鸡受精卵, 照蛋灯, 打孔器或剪刀, 蛋盘, 无菌注 射器和针头, 消毒酒精, 酒精灯, 石腊 病毒毒种用生理盐水稀释备用
1. 第1孔加入0.4ml尿囊液，第2孔加入0.1ml 尿囊液。
2. 吸取0.9ml生理盐水于血凝板第2孔，从第 3孔至第10孔每孔各加生理盐水0.4ml。
3. 反复吹打3～4次第2孔，从混匀的第2孔中 丢弃0.2ml，吸取0.4ml至第3孔混匀，再 吸0.4ml至第4孔，依次稀释到第9孔，第9 孔经稀释吹打后吸出0.4ml，
6）将烧杯中的细胞平均分配于5个25ml细胞瓶中， 补充1640培养基至3ml，置37 ℃培养
7）培养24小时后观察细胞的生长情况并描述细胞形 态。
原代细胞的培养与维持
1) 充分漂洗; 2) 起始的2天中尽量减少振荡; 3) 分离繁殖或测定病毒之用，细胞浓度可以加大，
尽量贴壁形成厚层； 4) 待细胞基本贴壁伸展并逐渐形成网状，此时的pH
（四）收获病毒
鸡胚为活的有机体，因此要严格无菌操作， 同时动作要仔细，以免造成物理死亡。接种 后24小时内死亡应不计结果。