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分子生物学知识：反义RNA和RNA干扰技术在基因治疗中的应用反义RNA和RNA干扰技术在基因治疗中的应用随着基因组学和生物技术的发展，人们开始逐渐意识到基因治疗在未来医学中的重要性。
基因治疗是一种将人体内的问题基因替换或修复为正常基因的治疗方法，这种方法对于一些由基因突变引起的疾病有着显著的治疗效果。
然而，基因治疗的应用还存在一些局限性，比如如何准确地传递到靶细胞，并且如何有效地靶向突变的基因。
反义RNA和RNA干扰技术就是应用于基因治疗领域的两种重要技术，可以解决部分以上问题。
反义RNA（antisense RNA）是DNA链传递时的镜像序列，是一种可以与mRNA互补结合并抑制蛋白质表达的核酸分子。
它可以与mRNA 的任意区域进行互补作用，并通过RNA酶H等方式降解/delay mRNA表达，从而对基因表达进行控制。
由于反义RNA能够"靶向"到mRNA的具体区域，所以在基因治疗中可以针对突变基因进行特异性的抑制。
这种方法适用于一些单基因疾病或肿瘤，并能够减轻患者病症。
例如，亚洲人群中的β地中海贫血病患者因为一种点突变导致本应被修复的β珠蛋白无法表达，患者必须一生服用红细胞输注以维持生命。
通过合成与β珠蛋白mRNA相互作用的反义RNA，科学家已经成功恢复了β珠蛋白的表达并取得了一定疗效。
RNA干扰（RNAi）是另一个针对特定基因的靶向技术，它依赖于小RNA分子的介入，用于与mRNA得到互补相关。
在RNAi中，小RNA首先与蛋白质构成的RNA诱导复合物（RNA-induced silencing complex, RISC）相结合，然后通过与mRNA互补配对的方式抑制蛋白产生。
与反义RNA技术不同，RNAi减少了基因表达而非彻底抑制。
在人类疾病的基因治疗中，RNAi已被证明是一种快速、有效且安全的选择。
例如，近期以来使用RNAi技术治疗多发性骨髓瘤（MM）的尝试已被证明具有很高的潜在疗效。
名词解释：1.质粒（Plasmid）：质粒是细菌的染色体外能够自我复制的环状DNA分子。
它能够和细胞核中的染色体明显地区别开来，而且并不是细胞生存的必要物质。
一些质粒适宜于引入到宿主细胞中去，并利用宿主细胞的DNA大量繁殖，因此我们常常采用质粒作为外源DNA的载体，外源DNA借助于质粒在宿主细胞中大量繁殖。
2.2.启动子（Promoter）：一段能被宿主ＲＮＡ聚合酶特异性识别和结合并指导目的基因转录的ＤＮＡ序列，是基因表达调控的重要元件。
位于基因的上游，一般长40-60bp3.限制性内切酶（Restriction enzyme， endonuclease）：这种酶能够识别出DNA上特定的碱基序列，并在这个位点将DNA酶切。
细菌中有400中限制性内切酶，能够识别出100中DNA序列4.载体：基因载体是一类能自我复制的DNA分子，其中的一段DNA被切除而不影响其复制，可用以置换或插入外源(目的) DNA而将目的DNA带入宿主细胞。
常用的载体有质粒、噬菌体、病毒5.核糖体结合位点（SD序列，shine-dalgarno ）：原核基因转录起始位点下游的一段DNA序列，与核糖体16SrRNA特异配对而与宿主核糖体结合，对mRNA 的翻译起决定性作用。
将RNA定位于核糖体上，从而启动翻译6.质粒的不亲和性：两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。
7.穿梭质粒载体（shuttle vector)：是指一类由人工构建的载体，含有两种不同复制起点和选择标记，可以携带外源DNA在不同物种的宿主细胞中复制、表达的质粒载体。
8.定向克隆：DNA用两种不同的限制性内切酶消化时，产生带有非互补粘性末端的片断，此种片段只能以一个方向插入用相同的两种酶消化的载体中。
9.非定向克隆：是指目的DNA通过一个限制性内切酶酶切形成的片断，或两个形成平端的内切酶形成的片断，此种片段可能以两个方向插入相同酶切处理的载体DNA中。
肿瘤防治研究２００２年第 卷第３期 反义核酸技术在肿瘤治疗中的应用 柄涛，昊家林，成蓥
关键词：反义核酸技术；肿瘤治疗；特异性；进展 中图分类号：Ｒ７３０．５ 文献标识码：Ａ 文章编号：ｉ０００—８５７８（２００２）０３ ０２５５ ０２
反义桉酸技术作为一种新的分子生物学工具及新 型药物，它的应用受到越来越多的重视。在抗肿瘤应 用方面，反义桉酸药物可以特异性的抑制癌基因的异 常表达或者抑制肿瘤细胞特异蛋白质的表达，诱导肿 瘤细胞发生凋亡，使肿瘤消退或彻底消失 ］。在抗病 原微生物感染方面针对病原微生物的特异基因的反义 桉酸可较好地阻止其对人体的伤害。本文就反义核酸 技术在肿瘤治疗研究中应用方面的新进展作一综述。 １反义核酸技术的基本原理 反义桉酸技术就是根据碱基互补原理，利用人工 或生物台成特异互补的ＤＮＡ或ＲＮＡ片段抑制或封 闭基因表达的技术，包括反义寡核苷酸技术、反义 ＲＮＡ技术和核酶技术。 反义寡核苷酸（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｅ！ｅｏｆｉｄｅｓ，ＡｓＯＮ） 技术，就是用一段人工台成的能与ＲＮＡ或ＤＮＡ互补 结台的寡核苷酸链抑制基因的表达。该技术作用原理 是：①ＡＳＯＮ与ＤＮＡ结台，抑制ＤＮＡ复制和转录，② ＡＳＯＮ与ｍＲＮＡ前体结台，阻断ＲＮＡ加工、成熟，影 响核糖体结沿ｒｒ￣ＮＡ移动，激活ＲＮａｓｅ，剪切杂交链 中未配对的碱基。 反义ＲＮＡ技术指利用基因重组技术，构建人工表 达载体，使其离体或体内表达反义ＲＮＡ，从而抑制靶 基因的表达。其作用原理有以下几个方面：①与前 ｍＲ＿ＮＡ结台，影响ｍＲＮＡ的成熟和在胞浆内的转运， ②与相应的靶ＲＮＡ结台从而激活ＲＮａｓｅ，加速靶 ＲＮＡ的降解，③直接与起始密码子ＡＵＧ互补结台而 阻止转录的启动，④互补作用于ＳＤ编码区的反义 ＫＮＡ可阻止核糖体在ｍＲＮＡ上的移动。 核酶（ｒｉｂｏｚｙｍｅ）是一类具有酶活性的ＲＮＡ分子，可 以自我催化和切割，并且这种作用元需能量，它的作用 可使ＲＮＡ被降解而无法进行转录和翻译。核酶技术是 利用这类具有催化活性的特殊的反义ＲＮＡ，可与靶序列 杂交并加以剪切，从而对基因表达进行调控。核酶的基 因组成分两部分；中间的极为保守的桉苷酸序列（活性 中心）和两端的引导序列，引导序列与靶ＲＮＡ互补结台 收稿日期：２００１—０５一ｌ】；修回日期：２００１—０７一Ｏ４ 作者单位：２１００４９南京军医学院生化教研室 时，中间保守序列即在该特定位点切断 。 ２反义核酸技术在肿瘤治疗研究中的应用 ２．１对肿宿细胞生长、增殖、分化的抑制及凋亡的诱导 在研究反义核酸技术在肿瘤抬疗中的作用时，多 运用肿瘤的体外传代细胞株实验，反义核酸技术可以 抑制肿瘤的生长、增殖、分化，还可以诱导其凋亡。 ｍｙｃ家族原癌基因表达产物是定位于桉内的 ＤＮＡ结台蛋白，或转录调控中的反式调控因子，其激 活与人胃癌、食管癌、白血病、淋巴瘤等肿瘤的发生有 密切关系，其中￣－ｍｙｃ基因的表达产物，在白血病细胞 中浓度增加，将产生高水平ｃ－ｍｙｃ反义ＲＮＡ的载体转 染ＨＬ－６０细胞后，￣－ｍｙｃ蛋白的含量下降７Ｏ ，细胞增 殖变慢０］。陈洁平等用腺病毒介导的反义￣－ｍｙｃ，转导 胃癌细胞，能产生明显的体内及体外生长抑制效应并 诱导凋亡 －。 ８ 以上的肿瘤细胞和永生化细胞具有端粒酶 活性，它与维持端区的长度、细胞的永生化及癌变密 切相关。利用反义桉酸技术，抑制端粒酶以抑制肿瘤 细胞已数见报道，张晓伟等应用反义核酸技术，将端 粒酶ＲＮＡ反向插入到整台型腺病毒载体中，转染 ２９３细胞后获得反义重组病毒，将此反义重组病毒感 染乳腺癌细胞ＭＣＦ一７后，使细胞端区长度由９．２５ｋｂ 缩短至７．２８ｋｂ，细胞的生长速度下降 。 最近几年里，ＰＫＣ，ｃｙｃｌｉｎ及ＣＤＫ基因在肿瘤细胞 中异常表达的研究受到广泛重视，这些基因的变异直 接影响到细胞的生长、增殖与分化。桑建利等利用反 义ＲＮＡ技术抑制乳腺癌细胞ＰＫＣａ基因的表达，结果 显示，细胞增殖速率明显减慢，ｃｙｄｉｎＤ１与ＣＤＫ４的表 达水平下降 Ｊ。 人Ｔ细胞白血病病毒Ｉ型（ＨＴＬｖ＿Ｉ）是逆转录病 毒，与成人Ｔ细胞白血病（ＡＴＬ）有关。ＨＴＬＶ－Ｉ不带 典型的癌基因，它的基因组编码几个调节蛋白质，包括 分子量为４０Ｋｕ的反式激活蛋白Ｔａｘ，Ｔａｘ可活化一些 细胞基因的启动子，它活化ＩＬ Ｚ和ＩＬ＿ＺＩｈ被认为与 ＡＬＴ早期受ＨＴＬＶ－Ｉ感染的细胞的增殖有关。 外源基因表达不恰当造成转基因小鼠出现神经纤 维瘤、肾上腺髓质肿瘤等多种病理学变化。用ｔａｘ反义 ＲＮＡ专一的阻断或部分抑制ｔａｘ基因在神经纤维瘤细
名词解释沉寂子silencer：为基因转录的负性调控。
重复序列：在基因组中多次反复出现的DNA序列。
反向重复序列（IR）：指两个顺序相同的互补拷贝在DNA链上呈反向排列。
微卫星：有更短的重复单位串联而成的DNA，程度一般小于100bp。
限制性片段长度多态性（RFLP）:当DNA碱基组成的变化改变了限制酶识别位点时，用限制酶酶切，会得到不同的限制片段类型。
转换transition：一同型碱基的取代颠换transversion：异性碱基的取代。
缺失deletion：一个或多个核苷酸的丢失。
插入insertion：一个或多个核苷酸的增加。
同义突变same sense mutation：不引起氨基酸组成和排列发生任何改变的基因突变。
中性突变neutral mutation：突变导致氨基酸发生替代，但无蛋白质功能改变。
沉默突变：不引起明显的表型改变的DNA变异。
无义突变：导致蛋白质翻译提前终止的基因突变。
错义突变：导致氨基酸组成和排列发生改变的突变。
开放读码框（ORF）：不含终止子，有编码氨基酸的三联体组成的连续DNA序列，能翻译成蛋白质。
单核苷酸多态性（SNP）：指基因组内特定核苷酸位置上存在两种不同的碱基，最少一种在群体中的频率不少于1%，是人群中体现个体差异的最基本的遗传变异，是人群或个体间疾病易感差异的遗传学基础。
同裂酶isoschizomers：又称异源同工酶，从不同原核生物中分离的就有相同识别位点，切割点可以相同也可以不相同的酶。
同尾酶isocaudaners：识别序列不同，但可产生相同的粘性末端。
可变酶：可以识别DNA序列中的一个或几个碱基是可变的，并且往往超过6个碱基对的酶。
同工酶：某种酶的多种形式，他们氨基酸组成和理化特性不同，但催化相同的反应。
TaqDNA聚合酶：是一种依赖DNA的单亚基耐热DNA聚合酶，无3-5外切酶活性，故无矫正功能。
Klenow片段：DNA聚合酶由蛋白酶水解后生成大小两个片段组成，大片段称之。
反义RNA技术与RNA干扰技术摘要：RNA 是生物体内最重要的物质基础之一,它与DNA 和蛋白质一起构成了生命的框架。
因其能干涉哺乳动物基因表达而颇受瞩目,并且由此而引发的RNA 干涉( RNAi)成为了当前分子生物学和细胞生物学最为热门的话题之一。
RNA干扰技术在2002年被Science杂志评为年度十大科技成就之首，而反义RNA 技术的发现对现代医疗技术的发展也起着重要的作用.常规的反义RNA 技术是设计出与靶RNA 互补的寡核苷酸,通过它与靶RNA 结合来干扰转录或翻译过程,使蛋白质不能被表达出来。
本文通过对热点的RNA干扰技术以及反义RNA技术的生物学特性，分子机制，产生方法，和应用以及展望等方面的介绍，在对比中得出该两种技术的异同点，从而使对以RNA干扰和反义RNA为代表的RNA技术有更深入的了解。
关键词：反义RNA技术， RNA干扰技术，生物学特性，分子机制，产生方法，应用,展望Antisence RNA Technique and RNAi TechniqueAbstract：RNA is one of the most essential fundamental substances, together with DNA and protein; itforms the frame of life. RNA has been much fixed eye on by the reason that it can interfere in the gene expression of mammals, which leads the RNAi to be one of the most heated topics in molecular biology and cytobiolog. With the RNAi technique regarded the first of the top 10 science and technology achievements by Science, the discovery of antisence RNA technique plays an irreplaceable role in the development of medical techniques. The regular antisence RNA technique designs the oligonucleotide which causes a complementation with the target RNA, by its combination with target RNA, it interferes the translation of transcription and translation, thus making it incapable for protein to express. This article introduces the biological characteristics, molecule mechanisms, preparation, application and future of both the antisence RNA technique and RNAi technique. With the contradistinction of these two techniques, we can get a better and comprehensive understanding of them.Key word: antisence RNA technique; RNAi technique; biological characteristics; molecule mechanisms; preparation; application; future1．概念1．1 反义RNA技术：反义RNA（antisence RNA）是一种与特异的mRNA互补的RNA分子，它通过配对碱基间氢键作用于对相应的RNA而形成双键复合物（即反义RNA：mRNA二聚合体），抑制RNA的翻译过程。
分子生物学名词解释基因组，Genome，一般的定义是单倍体细胞中的全套染色体为一个基因组，或是单倍体细胞中的全部基因为一个基因组半保留复制（semiconservative replication）：一种双链脱氧核糖核酸（DNA）的复制模型，其中亲代双链分离后，每条单链均作为新链合成的模板。
因此，复制完成时将有两个子代DNA分子，每个分子的核苷酸序列均与亲代分子相同，半不连续复制(Semi-ondisctinuousreplication)。
是指DNA复制时，前导链上DNA的合成是连续的，后随链上是不连续的，故称为半不连续复制。
dNTP，deoxy-ribonucleoside triphosphate（脱氧核糖核苷三磷酸）的缩写。
是包括dATP, dGTP, dTTP, dCTP,dUTP等在内的统称，N是指含氮碱基，代表变量指代A、T、G、C、U等中的一种。
在生物DNA、RNA合成中，以及各种PCR（RT-PCR（reverse transcription PCR）、Real-time PCR）中起原料作用。
转座子是一类在细菌的染色体，质粒或噬菌体之间自行移动的遗传成分，是基因组中一段特异的具有转位特性的独立的DNA序列.多顺反子（polycistronicmRNA)在原核细胞中，通常是几种不同的mRNA连在一起，相互之间由一段短的不编码蛋白质的间隔序列所隔开，这种mRNA叫做多顺反子mRNA。
这样的一条mRNA链含有指导合成几种蛋白质的信息。
基因表达：(gene expression)是指生物基因组中结构基因所携带的遗传信息经过转录、翻译等一系列过程，合成特定的蛋白质，进而发挥其特定的生物学功能和生物学效应的全过程外显子(expressed region)是真核生物基因的一部分，它在剪接(Splicing)后仍会被保存下来，并可在蛋白质生物合成过程中被表达为蛋白质。
外显子是最后出现在成熟RNA中的基因序列，又称表达序列。
反义RNA的制备与应用反义RNA是DNA转录成RNA后，采用与RNA互补的核酸来合成的一种RNA，具有与目标RNA互补的序列，能够与目标RNA形成双链，并通过RNA干扰技术来抑制目标RNA的表达。
反义RNA是一种有效的基因功能研究工具，广泛应用于基因调控、疾病治疗等领域。
一、反义RNA的制备1.选择适当的反义序列反义RNA的制备首先要选择适当的反义序列。
在选择反义序列时，需要考虑到目标RNA的稳定性、结构和表达水平等因素，并选择最为逆反向的序列，以增强其抑制效果。
2.构建反义RNA表达载体目前常用的反义RNA表达载体是质粒载体和病毒载体。
质粒载体常用的是pSUPER和psiRNA等，病毒载体常用的是腺病毒和慢病毒等。
在构建反义RNA表达载体时，需要考虑到稳定性、转染效率、穿透性等因素。
3.转染或转染反义RNA的制备可以通过转染或转染的方式进行。
转染方式是利用化学试剂（如脂质体）将反义RNA表达载体导入细胞中，使其在细胞内合成反义RNA。
转染方式是利用病毒载体将反义RNA表达载体导入细胞中，使其在细胞内合成反义RNA。
4.筛选合成反义RNA后，需要通过RT-qPCR、Northern blotting等方法检测其抑制效果及特异性，并选择最佳反义RNA序列用于后续实验。
二、反义RNA的应用1.基因表达调控反义RNA可通过RNA干扰技术减少或抑制目标基因的表达，从而实现研究基因在细胞生命周期、分化、凋亡、癌变等过程中的作用和机制。
2.疾病治疗反义RNA也可应用于疾病治疗，如利用反义RNA抑制病毒基因表达、抗血友病的基因治疗等。
3.药物开发反义RNA还可以作为药物的靶点和治疗方法，如开发用于治疗病毒感染、癌症、遗传疾病等的反义RNA药物。
4.基因芯片反义RNA也可作为基因芯片的探针，用于基因表达谱的分析和研究。
总之，反义RNA是一种重要的基因研究工具，具有广泛的应用前景。
在反义RNA的制备和应用中，需要选择合适的反义序列、构建适当的反义RNA表达载体、选择合适的转染方式、筛选合适的反义RNA序列等。
