第四章细菌分型与其检测技术

❖ 现代的数值分类学必须借助于电子计算机，因此又称电子计 算机分类学。
❖ 在工作开始时，必须先准备好一批待研究菌株和有关典型菌 种的菌株，它们被称作OTU（操作分类单位，operational taxonomic units）。要用50个以上甚至几百个特征进行比 较，且所用特征越多，其结果也就越精确。在比较不同菌株 时，都要采用相同的可比特征，包括形态的、生理的、生化 的、遗传的、生态的和免疫的特征等。
如果是节假日，必须要说节假日好。
为用放线菌的形态特征和化学组分相结合的方法划分属提供了科学的依据。
2．全细胞水解液的糖型
现以放线菌为例，其糖型可分四类：
3．磷酸类脂成分的分析
位于细菌、放线菌的细胞膜上的磷酸类脂成分， 在不同属中有所不同，故可用于鉴别放线菌属的 重要指标之一。
4．枝菌酸的分析
❖ 枝菌酸存在于诺卡氏菌属、分枝杆菌属和棒杆菌 属3属称作“诺卡氏菌形放线菌”中，它们在形态、 结构和细胞壁上难以区分，但它们所含的枝菌酸 却差别明显，分别含有80、50、30个碳原子，可 对它们分属。
（二）细胞化学成分用作鉴定指标
化学分类法
微生物分类中，根据微生物细胞的特征性化学组 分对微生物进行分类的方法称化学分类法 (chemotaxonomy) 。
在近二十多年中，采用化学和物理技术来研究细 菌细胞的化学组成，已获得很有价值的分类和鉴 定资料。
细菌的化学组分分析及其在分类水平上的应用
细胞成份
原理
测定序列的相似性： <20% 不同属 20~60% 同一个属 60~85% 同一个种 >85% 同一个株
菌落原位杂交
特异性的探针主要用于 病原微生物的快速鉴定
3．rRNA寡核苷酸序列分析

G+C含量的比较主要用于分类鉴定中的否定 但具有相似G+C含量的生物并不一定表明它们 含量的生物并不一定表明它们 但具有相似 之间具有近的亲缘关系。 之间具有近的亲缘关系。
同一个种内的不同菌株G+C含量差别应在 4～5%以下；同属不同种的差别应低于10～15%； G+C含量已经作为建立新的微生物分类单元 的一项基本特征，它对于种、属甚至科的分类鉴 定有重要意义。 若二个在形态及生理生化特性方面及其相似的 菌株，如果其G+C含量的差别大于 含量的差别大于5%，则肯定不是 菌株，如果其 含量的差别大于 ， 同一个种，大于15%则肯定不是同一个属。 则肯定不是同一个属。 同一个种，大于 则肯定不是同一个属
一、形态学特征
培养特征、 培养特征、 细胞形态及其染色特性、 细胞形态及其染色特性、 运动性、 运动性、 等等
特殊的细胞结构、 特殊的细胞结构、
微生物分类和鉴定的重要依据之一： 微生物分类和鉴定的重要依据之一：
a）易于观察和比较，尤其是真核微生物和具有特殊 ）易于观察和比较， 形态结构的细菌； 形态结构的细菌； b）许多形态学特征依赖于多基因的表达，具有相对 ）许多形态学特征依赖于多基因的表达， 的稳定性； 的稳定性；
Ssm(匹配系数)
Ssm= (a+b)/(a+b+c+d) Sj=a/( a+b+c+d)
a：表示两个OTU性状编码皆为“1”的个数；
b：表示一个OTU为“1”，另一个OTU为“0”的性状个数； c：表示一个OTU为“0”，另一个OTU为“1”的性状个数； d：表示两个OTU皆为"0"的性状个数。
进行簇群分析
3、Biolog全自动或手动细菌鉴定系统 Biolog全自动或手动细菌鉴定系统

主要用于肠杆菌科细菌中属及种的鉴别
2019
-
67
明胶液化试验
明胶
胞外酶 分解
氨基酸
失去凝固力
液态明胶
主要用于肠杆菌科细菌的鉴别 2019 也用于鉴别- 炭疽杆菌（+）和类炭疽杆菌 68
苯丙氨酸
苯丙氨酸脱氨酶 脱氨基
苯丙酮酸 +
氯化铁
绿色
主要用于肠杆菌科细菌的鉴别
2019
-
69
氨基酸脱羧酶试验
2019
-
6
一、检查方法
（一）不染色标本检查法
主要用于观察生活状态下微生物某些形态 特点及运动性
‫٭‬常用的方法有压滴法和悬滴法
如:用压滴法观察霍乱弧菌的“鱼群样运动”
悬滴法观察霍乱弧菌的“穿梭样运动”
如在同一方法制作的另一标本中加入效价≥1:64
霍乱多价血清则穿梭样运动停止并发生凝集,则为制
2动019 试验(+)
2019
-
二氧化碳培养箱
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2、烛缸法:
3、化学法： 按每升容积重碳酸钠
0.4g与1mol/L盐酸 0.35ml比例放入标本 缸,密封后倾斜容器使 两者接触产生CO2
2019
-
烛缸二氧化碳培养法
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★厌氧培养法：厌氧罐培育法和厌氧袋法 1、厌氧罐培育法：用理化方法除去密
闭容器中的氧，造成无氧环境，以利于专 性厌氧菌生长。
2019
-
28
（7）鸡蛋和动物血清:虽然不是构成培养基 的基本成分,但却是某些细菌生长所必需的营养物 质,所以仅用于制备一些特殊的培养基。
（8）生长因子：是细菌生长所必需的，但需 要量很小。在制备培养基时，常加入维生素、氨 基酸、嘌呤、嘧啶等生长因子。

+ 原理：某些细菌能力利用培养基中的枸橼酸盐 作为唯一的碳源，也能利用其中的铵盐 作为唯 一氮源，细菌生长过程中分解枸橼酸盐产生碳 酸盐和分解铵盐生成的氨，使培养基变碱，是 指示剂呈碱性反应。
+ 培养基：枸盐酸盐培养基（淡绿色）
+ 试剂：溴麝香草酚蓝（pH6.0以下呈黄色， pH7.6以上呈蓝色）
3、玻璃器材的清洗
★新购置的玻璃器材：1％～2％盐酸浸泡－→清水 清洗
★用过的无污染器皿：洗涤剂洗刷－→清水清洗 细菌污染的器材：消毒灭菌后再洗刷
★盛培养基试管和平皿：高压灭菌－→趁热倒出－ →洗涤剂洗刷－→清水冲洗
★吸管：3％来苏浸泡－→清水冲洗 ★玻片和盖玻片：3％来苏和清洁液浸泡－→清水
冲洗；染色后的玻片，应肥皂水煮沸10min再洗 涤
★含油脂的器皿：单独灭菌
（四）培养箱
1、电热恒温培养箱 2、二氧化碳培养箱 3、厌氧培养箱
（五）培养基 培养基：是指人工配制的适合细菌生长繁殖 的综合营养基质。 1、培养基的成分及作用
+ 营养物质：肉浸液、牛肉膏、糖醇类、血 液、鸡蛋和动物血清、生长因子、无机盐
+水 + 凝固剂：琼脂、明胶 + 抑制剂 + 指示剂
调配 溶化 矫正pH 过滤澄清 分装 灭菌
培养基灭菌
★ 基础培养基：121℃高压蒸汽灭菌15分钟 ★ 含糖培养基：113 ℃灭菌15分钟 ★ 鸡蛋、血清培养基：间歇灭菌3天3次 ★ 不耐高温的液体成分：滤过除菌
检定
保存
二、细菌接种与培养技术 （一）无菌技术 1、细菌检验的操作需在无菌室或超净工作台
+ 糖发酵试验 + 葡萄糖氧化／发酵试验（O/F试验） + 甲基红试验 + V-P试验 + 七叶苷水解试验 + Β－半乳糖苷渗透酶试验