大鼠脑微血管内皮细胞的体外培养及鉴定

新生大鼠大脑皮层少突胶质前体细胞的培养分离及鉴定【摘要】［目的］探讨新生（spraguedaley,SD）大鼠大脑皮层少突胶质前体细胞在体外条件下的生长情况及培养分离，以获得纯化的少突胶质前体细胞，为今后细胞移植治疗研究提供良好的种子细胞。

［方法］出生48hSD大鼠取大脑皮层进行混合胶质细胞的体外培养，原代培养第9～10d时采用水平振荡、差速贴壁的方法分离、纯化少突胶质前体细胞，继续用定向培养基传代培养。

相差显微镜观察少突胶质前体细胞在体外条件下的生长情况，免疫细胞化学技术进行细胞鉴定。

［结果］混合胶质细胞原代培养第9～10d时出现明显的细胞分层，少突胶质前体细胞散布于单层的星形胶质细胞表面，胞体呈椭圆形或圆形，具有典型的双极突起，少数呈三极突起。

经振荡分离后少突胶质前体细胞纯度达95％，少突胶质细胞特异性标记lig2反应阳性，胶质纤维酸性蛋白抗体反应阴性。

［结论］新生SD大鼠大脑皮层原代培养中少突胶质前体细胞能够维持在未成熟阶段，细胞分层后通过振荡法及差速贴壁法可以获得较高纯度的少突胶质前体细胞。

【关键词】少突胶质前体细胞;细胞培养；脱髓鞘化；脊髓损伤Keyrds：ligdendrytepreursrell;ellulture;deyelinatin;spinalrdinjury脊髓损伤是一种常见的中枢神经系统损伤，可以造成患者严重的神经功能损害。

目前，临床上尚无有效办法治疗脊髓损伤。

随着研究深入，人们对于脊髓损伤的病理过程有了更进一步的认识。

脊髓损伤不仅导致神经元丢失，同时还造成大量少突胶质细胞的死亡，从而引起残留神经轴突的脱髓鞘改变，进一步影响了脊髓神经功能的恢复。

近来不少研究显示通过髓鞘形成细胞移植治疗脊髓损伤，有利于脱髓鞘轴突的再髓鞘化，促进损伤脊髓的神经功能恢复［1,2］。

研究表明，少突胶质细胞不仅形成髓鞘包绕轴突，同时它还起着为其他神经细胞提供营养因子、促进轴突生长等作用［3］。

此外，少突胶质前体细胞是处于分化早期阶段的未成熟细胞，既能够定向分化为成熟少突胶质细胞，同时又具有一定的增殖与迁移能力［4］，更加适合于细胞移植治疗。

成年大鼠心肌微血管内皮细胞的分离与培养陈小燕;樊梦雅;李慧;蒋易楠;靖静;张海龙【摘要】目的本文建立一种简便、高效的成年大鼠心肌微血管内皮细胞分离及培养的方法.方法选取7~8周龄Wistar大鼠,麻醉后开胸取出心脏,采用离体心脏灌流和酶消化法进行心肌微血管内皮细胞的分离;取第3代细胞观察其增殖特征并绘制增殖曲线;用免疫细胞化学和免疫荧光对细胞的第Ⅷ因子相关抗原和CD31进行鉴定,利用基质胶检验其血管形成能力.结果体外培养心肌微血管内皮细胞呈多边形或梭形,具有典型的铺路石样生长特点;同时,第Ⅷ因子相关抗原和CD31呈阳性;具备血管形成能力.结论本方法培养的成年大鼠心肌微血管内皮细胞具有较高的纯度,方法简便易行,可用于心血管疾病基础及临床研究.%Objective To establish a simple and efficient method for isolation and culture of adult rat cardiac micro-vascular endothelial cells. Methods Wistar rats were anesthetized and thoracotomy was performed. Cardiac micro-vascular endothelial cells were isolated by heart perfusion and enzyme digestion. The morphology and growth curve of the third generation cells were examined by inverted microsc opy. Its molecular markers factor Ⅷ-related antigen and CD31 were detected by immunocytochemistry and immunofluoresence. The angiogenic ability was examined by matrigel. Results The primary cultured cardiac microvascular endothelial cells in vitro were polygonal or fusiform with typical paving stone-like growth characteristics. At the same time,the cells were positive stained by factorⅧ-related antigen and CD31 and showed angiogenic ability. Conclusions Cardiac microvascular endothelial cells cul-tured by this method possess high purity. The method is easy tooperate and can be used for laboratory and clinical research of cardiovascular diseases.【期刊名称】《基础医学与临床》【年(卷),期】2018(038)004【总页数】5页(P530-534)【关键词】细胞培养;内皮细胞;成年大鼠;心肌微血管【作者】陈小燕;樊梦雅;李慧;蒋易楠;靖静;张海龙【作者单位】河南大学医学院抗体药物开发技术国家地方联合工程实验室河南省抗体药物国际联合实验室细胞与分子免疫重点实验室,河南开封475004;河南大学医学院抗体药物开发技术国家地方联合工程实验室河南省抗体药物国际联合实验室细胞与分子免疫重点实验室,河南开封475004;河南大学医学院抗体药物开发技术国家地方联合工程实验室河南省抗体药物国际联合实验室细胞与分子免疫重点实验室,河南开封475004;郑州大学基础医学院,河南郑州450001;河南大学医学院抗体药物开发技术国家地方联合工程实验室河南省抗体药物国际联合实验室细胞与分子免疫重点实验室,河南开封475004;河南大学医学院抗体药物开发技术国家地方联合工程实验室河南省抗体药物国际联合实验室细胞与分子免疫重点实验室,河南开封475004【正文语种】中文【中图分类】R331心肌微血管是深入心脏内的终末细小分支，在心脏内分布广泛，结构上与其他血管不同，由单层内皮细胞和细胞外基质组成；微血管内皮细胞在表型与功能上均表现出不同于大血管内皮细胞的异质性，且其性质与功能在不同组织器官之间也具有显著差异[1]。

基金项目:国家自然科学基金资助项目(No .30370561);河北省自然科学基金资助项目(No .C2004000639)作者单位:075029　河北张家口,河北北方学院病理生理教研室第一作者简介:陈瑞华(1966-),男,汉族,张家口人,副教授。

主要从事危重病的病理生理学研究。

△通信作者:ncylxf@s ohu .com文章编号:100728568(2007)0120016204・实验研究・大鼠肺微血管内皮细胞的培养陈瑞华,赵自刚,牛春雨△,张　静,张玉平【摘要】　目的　建立简单有效地获取大鼠肺微血管内皮细胞(P MVEC )的培养方法。

方法　从实验动物、培养基、植块方法、胎牛血清浓度等方面对植块培养法进行改进,应用W istar 雄性大鼠的肺组织,进行P MVEC 的原代培养并传代培养;通过倒置显微镜、扫描、透射电镜观察其形态,并进行免疫组织化学鉴定。

结果　体外培养的大鼠P MVEC 呈梭形或多角形,形成单层后呈典型的鹅卵石样或铺路石样排列,获得的血管内皮细胞纯度较高,抗Ⅷ因子阳性反应,成功建立了P MVEC 的原代培养方法。

结论　改进的植块培养法简便、可靠,获得的P MVEC 纯度高,生长状态良好,保持了内皮细胞的结构和功能,可用于其功能特性的进一步研究。

【关键词】　肺微血管;内皮细胞;细胞培养中图分类号:Q25 文献标识码:BCulture of Pul m onary M i crova scul ar Endotheli a l Cells i n Ra ts CHEN R u i 2hua,ZHAO Z i 2gang,N I U Chun 2yu,ZHAN J ing,ZHAN G Yu 2ping .D epa rt m en t ofPa thophysiololgy,Hebei N orth U n iversity,Z hang jiakou 075029,China【Abstract 】　O bjecti ve T o devel op a si m p le and rep r oductable method for the is olati on and p ri m aryculture of pul m onary m icr ovascular endothelial cells (P MVECs )of rats .M ethods The tissue bl ock pasted culture method was i m p r oved in experi m ent ani m al,culture -mediu m,tissue bl ock method,fetal bovine ser 2u m (F BS )and s p reading slide method .Rats P MVECs were p ri m ary cultured with lung tissue bl ock pasted methods using lung tissue of male W istar rats,and the cell mor phol ogy was observed using inverted m icr oscope and electr on m icr oscope,and identified using i m munohist oche m ical methods .Results The cultured P MVECs of rats in vitr o showed fusif or m shape or polygon,and the monolayer cultures dis p layed a typ ical cobblest one or pavingst one mor phol ogy and were inhibited when contacted each other,the P MVECs exp ressed fact or Ⅷass o 2ciated antigen.And the p ri m ary culture of P MVEC was established successfully .Conclusi on The pure pul 2monaryMVECs of rats can be attained rap idly and easily by the described method .The method is si m p le,eco 2nom ic and reliable,availability of these cells will facilitate further functi onal character studies .【Key words 】　Pul m onary m icr ovessel;Endothelial cell;Cell cultivati on 微血管内皮细胞衬附于血管内壁,定位于进行血液-组织交换的微血管,它不仅是构成血管组织间屏障的重要成分,而且在调节机体内环境的稳定、维持正常生理和免疫功能,以及介导疾病的发生、发展和转归等方面都发挥主要的作用。

-596•安徽医科大学学报Ada Unwersitatis Medicinalis Anhut2621Apr；56(4)网络出版时间：2621-3-116：50网络出版地址：https：//k/ki.3W/kcms/dwPH34.1025.R.26216317.1521.html大鼠股动脉血管原代内皮细胞的分离与培养刘倩，韩陈陈,罗婷婷，张雨，李浩，马场，魏伟摘要目的体外分离、培养并鉴定大鼠股动脉血管原代内皮细胞,为相对较小血管来源的原代内皮细胞功能研究提供细胞模型。

方法无菌取大鼠股动脉血管，胶原酶消化大鼠股动脉血管内皮细胞使其分离,流式细胞术检测内皮细胞纯度;流式分选出CD30阳性细胞，并用激光共聚焦鉴定内皮细胞;以CCK-C法、高内涵细胞成像法检测内皮细胞增殖能力，以法、Mv/gW胶法检测其迁移和成管功能。

结果胶原酶消化分离所得股动脉血管原代内皮细胞在2627-29-17接收基金项目：国家自然科学基金（编号：51562123、51330051、51273444）作者单位:安徽医科大学临床药理研究所，合肥230234作者简介:刘倩，女,硕士研究生；魏伟，男，博士，教授，博士生导师，责任作者,E-mVi：wwei@ahmu.efu.ch；马场，女，博士，副教授，责任作者，E-mail:mayane_ahmu@ 14~16d细胞覆盖培养瓶面积的2/3以上，细胞呈现典型铺路石状。

流式检测其纯度为3&34%,分选后利用CD30进行荧光染色鉴定，细胞均为CD30阳性；PGE3可显著上调CD30阳性内皮细胞增殖、迁移、成管功能。

结论该研究采 用简便的方法成功分离得到股动脉血管原代内皮细胞,为研究相对较小血管来源的原代内皮细胞功能提供体外细胞模型。

关键词大鼠;股动脉;原代血管内皮细胞;分离培养;鉴定中图分类号R394.26；R322.120文献标志码A文章编号1000-1492（2620）04-0566-05 doi：r6.19465/p cnki.isspl000-0492.2621.04.hl7根据血管的结构、功能和运输方向差异,分为动脉、静脉和毛细血管。

体外培养大鼠心肌微血管内皮细胞缺氧模型的建立马培泽;宋宪波;刘宁;姜月华;戴国华【摘要】目的建立大鼠心肌微血管内皮细胞(CMECs)缺氧模型.方法植块法培养CMECs,免疫细胞化学鉴定微血管内皮细胞特异性标志.将原代培养的CMECs在1%O2-94%N2-5%CO2低氧气体环境中培养24 h制备低氧损伤模型(L组),以无血清常氧培养作为对照组(N组).倒置相差显微镜观察缺氧前后细胞形态变化,MTT 法测定细胞活力,Annexin V-FITC和PI双标记法测定细胞凋亡率.结果植块法培养的大鼠CMECs具备典型微血管内皮细胞特征;Ⅷ因子、CD31相关抗原免疫染色鉴定均阳性.缺氧前后细胞形态无明显变化;与N组比较,L组细胞活力明显增加(P＜0.05);细胞凋亡率明显降低(P＜0.05),其中早期凋亡降低最明显(P＜0.01).结论本方法可以成功建立简便、易行的CMECs细胞缺氧模型.【期刊名称】《中西医结合心脑血管病杂志》【年(卷),期】2014(012)001【总页数】3页(P83-84,107)【关键词】心肌微血管内皮细胞;缺氧模型;细胞活力;细胞凋亡【作者】马培泽;宋宪波;刘宁;姜月华;戴国华【作者单位】山东中医药大学第一临床学院,250014;山东中医药大学第一临床学院,250014;山东中医药大学第一临床学院,250014;山东中医药大学附属医院,250011;山东中医药大学附属医院,250011【正文语种】中文【中图分类】R329.2;R285.5缺血性心脏病已成为威胁人类生命健康的主要杀手，而心肌微血管内皮细胞（CMECs）功能障碍一直是缺血性心脏病病因、发病机制及其防治研究领域中的热点［1］。

在体CMECs的功能受多种因素的影响，而体外培养的CMECs能否耐受缺氧，以及缺氧对CMECs活力及凋亡的影响还未明确。

本研究通过大鼠CMECs培养，建立体外缺氧CMECs模型，观察了缺氧对大鼠CMECs活力及凋亡的影响。

[1] 。

大鼠血管平滑肌细胞的原代培养及鉴定血管平滑肌细胞（VSMC 的异常增殖是许多心血管疾病的共同病理基础， 在高血压、 动脉粥样硬化和血管成形术后再狭窄等 许多血管性疾病中，都涉及到血管平滑肌细胞的异常增殖 血管由 3 个部分组成，自内向外依次是内膜层、 中膜层和外膜层，内膜层主要由血管内皮细胞和少量的平滑肌细胞组成， 外膜层由要收缩调节机体的血流和血压， 其功能障碍在心血管疾病中起着 非常重要的作用， 因此， 对血管平滑肌细胞的生物学特性进行深 入研究，才能探明上述血管疾病的发病机制。

在VSMC 勺研究中， 组织块贴壁法培养 VSM （和胶原酶消化法是目前采用的非常广泛的技术。

本实验采用组织块贴壁法进行大鼠胸主动脉平滑肌细胞 的培养，并采用平滑肌细胞的3种标记分子（SMASM22Calponin ） 进行免疫细胞化学鉴定。

1 材料与方法成纤维细胞组成， 中膜层由血管平滑肌细胞组成， 平滑肌细胞主1.1 材料。

动物来源：健康 Wistar 大鼠，由第三军大学实验动物中心提供，雌雄不限，体重180 〜200g 。

DM EMS 糖培养 基 （美国 Gibco 公司） ， Hepes 索莱宝） ， 优质胎牛血清 （原 代培养浓度 20%，传代培养浓度 10%，美国 Hyclone ），胰蛋白酶，鼠单抗肌动蛋白 SMA 、SM22、Calponin 北京博奥森生物），DAB 显色试剂盒，通用型免疫组化检测试剂盒北京中杉金桥生物技术XX公司）其余试剂均为国产分析纯。

1.2 方法1.2.1 取材：断颈法处死Wistar 大鼠，消毒胸腹部，大组织剪、组织镊剪开胸腹部皮肤，更换器械，切开胸腹部，并切除部分胸壁以利于暴露胸主动脉，用眼科弯镊和眼科剪分离胸腹主动脉并放入盛有无菌PBS的细胞培养皿中。

转入超净工作台上，眼科直镊和弯镊清除结缔组织和血块，剥除动脉外膜。

放入另一盛有PBS的细胞培养皿中，减去血管外的细小分支，并放入含10%台牛血清的DMEI中，眼科直剪纵向剖开血管腔，用眼科弯镊轻轻刮除内膜面，以去除内皮细胞，放入另一含10%台牛血清的DMEM中，用眼科弯剪反复剪切成1mm*1m大小的组织块。

大鼠不同部位内皮细胞的体外培养李杰;董虹;张涛;段慧琴;刘小瑜;许光勇;郭洋;穆祥【摘要】Objective:To explore a model with effective separating,culturing and getting higher purity of rat myocardium micro-vascular endothelial cells(RMMECs),rat intestinal microvascular endothelial cells(RIMECs),rat aortic endothelial cells (RAECs),rat postcaval vein endothelial cells (RPVECs).Methods: The left ventricular wall,jejunum,aorta,vena cava were collected from 7d SD rats.After using type II collagenase digestion and differential adhesion more purer RMMECs,RIMECs,RAECs,RPVECs were obtained.Results: The morphological characteristics and microvascular endothelial cells and vascular endothelial cell-associated specific antigen test confirmed the collected RMMECs,RIMECs,RAECs,RPVECs with high purity.Conclusion: The RMMECs,RIMECs,RAECs,RPVECs with high purity were isolated and cultured from the rat,which provided a useful research method for the further development of the biological properties of endothelial cells.%为了建立一种能有效分离、培养和获取较高纯度的大鼠心肌膜微血管内皮细胞(RMMECs)、肠黏膜微血管内皮细胞(RIMECs)、主动脉内皮细胞(RAECs)、后腔静脉内皮细胞(RPVECs)的模型,自7 dSD大鼠分别取左心室壁、空肠、主动脉、后腔静脉,采用Ⅱ型胶原酶消化、差速贴壁、差速消化法获得较纯的RMMECs、RIMECs、RAECs、RPVECs.结果表明:通过形态学特征及微血管内皮细胞和血管内皮细胞相关特异性抗原检测证实,得到高纯度RMMECs、RIMECs、RAECs、RPVECs.结论:利用胶原酶Ⅱ型消化法成功分离并培养大鼠的RMMECs、RIMECs、RAECs、RPVECs,为进一步开展内皮细胞的生物学特性的相关研究提供有效的方法.【期刊名称】《北京农学院学报》【年(卷),期】2012(027)003【总页数】3页(P29-31)【关键词】SD大鼠;细胞培养模型;微血管内皮细胞;内皮细胞【作者】李杰;董虹;张涛;段慧琴;刘小瑜;许光勇;郭洋;穆祥【作者单位】北京农学院动物科学与技术学院兽医学(中医药)北京市重点实验室,北京102206;北京农学院动物科学与技术学院兽医学(中医药)北京市重点实验室,北京102206;北京农学院动物科学与技术学院兽医学(中医药)北京市重点实验室,北京102206;北京农学院动物科学与技术学院兽医学(中医药)北京市重点实验室,北京102206;北京农学院动物科学与技术学院兽医学(中医药)北京市重点实验室,北京102206;北京农学院动物科学与技术学院兽医学(中医药)北京市重点实验室,北京102206;北京农学院动物科学与技术学院兽医学(中医药)北京市重点实验室,北京102206;北京农学院动物科学与技术学院兽医学(中医药)北京市重点实验室,北京102206【正文语种】中文【中图分类】R365.543血管内皮细胞（VEC）位于血流和组织之间，为衬贴于血管内腔面的单层扁平细胞，其表面积可达1 000 m2以上［1］。

㊃论 著㊃D O I :10.3760/c m a .j.i s s n .1673-436X.2018.05.008作者单位:050000石家庄,河北医科大学第三医院呼吸二科(张鑫红㊁田凤军㊁陈海利㊁徐迎春),重症医学科(王智勇);050000石家庄,河北医科大学病理生理教研室(黄新莉)通信作者:田凤军,E m a i l :185********@163.c o m改良大鼠肺微血管内皮细胞原代培养技术及鉴定张鑫红 田凤军 陈海利 徐迎春 王智勇 黄新莉ʌ摘要ɔ 目的 改良大鼠肺微血管内皮细胞(P MV E C s)原代培养方法,并对所培养的P MV E C s 进行鉴定㊂方法 组织贴块法培养P MV E C s ,从动物的选取㊁肺灌注㊁细胞漂洗次数及试剂温度等方面进行了改良㊂免疫组织化学鉴定P MV E C s ㊂结果 原代培养的P MV E C s 呈典型的铺路石样生长㊂免疫组织化学显示Ⅷ因子及血管性血友病因子表达阳性㊂结论 经改良后培养P MV E C s ,细胞培养的重复性高且生长状态好㊂ʌ关键词ɔ 肺微血管内皮细胞;原代培养;细胞培养I m p r o v e m e n t o fm e t h o d p r i m a r y c u l t u r e a n d i d e n t i f i c a t i o n o f r a t p u l m o n a r y mi c r o v a s c u l a r e n d o t h e l i a l c e l l s Z h a n g X i n h o n g *,T i a nF e n g j u n ,C h e n H a i l i ,X uY i n g c h u n ,W a n g Z h i y o n g ,H u a n g Xi n l i .*T h e S e c o n d D e p a r t m e n t o f R e s p i r a t o r y M e d i c i n e ,t h eT h i r d H o s p i t a l o f H e b e iM e d i c a lU n i v e r s i t y ,S h i j i a z h u a n g 050000,C h i n aC o r r e s p o n d i n g a u t h o r :T i a nF e n g ju n ,E m a i l :185********@163.c o m ʌA b s t r a c t ɔ O b je c t i v e T o i m p r o v e t h e m e t h o d of p r i m a r y c u l t i v a t i o n o f r a t p u l m o n a r y m i c r o v a s c u l a re n d o t h e l i a lc e l l s (P MV E C s ),a n di d e n t i f y t h e p r i m a r y cu l t i v a t e d P MV E C s .M e t h o d s T i s s u eb l o c ka d h e r i n g w a l l m e t h o d w a su s e dt oc u l t i v a t e P MV E C s .P r i m a r y cu l t i v a t i o n m e t h o d w a s i m p r o v e d f r o mt h e p r o c e d u r e so fa n i m a l s e l e c t i o n ,p u l m o n a r yp e r f u s i o n ,t h en u m b e ro fc e l l sr i n s e sa n d t e m p e r a t u r e o f r e a g e n t sa n ds oo n .I mm u n o h i s t o c h e m i c a l o b s e r b a t i o nP MV E C s .R e s u l t s T h eP MV E C s w e r ee x h i b i t e d a s p o l y g o n .I mm u n o h i s t o c h e m i c a ls t a i n i n g r e v e a l e d t h a t e x pr e s s i o n o f Ⅷa n d v o n w i l l e b r a n d f a c t o rw a s p o s i t i v e .C o n c l u s i o n s A f t e r t h e i m p r o v e d m e t h o do fP MV E C s ,t h e r e p r o d u c i b i l i t yo f c e l l c u l t u r e i sh i gha n d t h e g r o w t hs t a t u s i s g o o d .ʌK e y wo r d s ɔ P u l m o n a r y m i c r o v a s c u l a r e n d o t h e l i a l c e l l s ;P r i m a r y c u l t u r e ;C e l l s c u l t u r e 肺微血管内皮细胞(p u l m o n a r y mi c r o v a s c u l a r e n d o t h e l i a l c e l l s ,P MV E C s )在A R D S 等多种肺部疾病中是最早激活的效应细胞[1]㊂因此,体外培养P MV E C s 构建实验模型,对深入研究肺部不同疾病的发病机制具有重要意义㊂虽然国内外已有许多研究报道P MV E C s 原代培养和鉴定方法[2-3],但P MV E C s 的原代培养成功率仍然低,重复性差㊂本研究尝试对P MV E C s 培养过程中技术细节部分的改良,探索简单易行的实验方法,改善P MV E C s 原代培养的重复性及细胞的稳定性㊂1 材料和方法1.1 材料1.1.1 实验动物 S D 幼年大鼠,雌雄均可,体质量40~50g ,购自河北医科大学动物实验中心㊂实验过程中对动物的处理符合‘关于善待实验动物的指导意见“等相关要求㊂1.1.2 主要试剂 D M E M /F -12培养液㊁双抗液㊁牛血清白蛋白㊁P B S 缓冲液及2.5g /L 胰蛋白酶-E D T A 均购自美国G i b c o 公司,胎牛血清购自P A N 公司,4%多聚甲醛及聚乙二醇辛基苯基醚(T r i t o n X -100)购自索莱宝公司,兔抗大鼠Ⅷ因子相关多克隆抗体及兔抗大鼠血管性血友病因子(v o nw i l l e b r a n d f a c t o r,VW F )相关多克隆抗体购自武汉博士德公司,免疫组织化学二抗试剂盒购自北京中杉金桥公司,底面积25c m 2细胞培养瓶㊁35mm 细胞培养皿购自美国C o r n i n g 公司㊂1.1.3 主要设备 倒置荧光显微镜㊁含体积分数5%C O2细胞培养箱㊁超净台㊁低温离心机均购自美国T h e r m o公司㊂1.2细胞培养1.2.1原代培养大鼠2只,肝素钠㊁水合氯醛腹腔注射给药㊂麻醉成功后大鼠消毒3次,固定于超净台内㊂暴露心㊁肺,灌洗肺叶至发白㊂剪取肺组织,置于4ħP B S中漂洗㊂4ħ培养基中剪取边缘肺组织,约为(1mmˑ1mmˑ1mm)大小㊂将组织块均匀接种到细胞培养瓶中,吸去瓶中的全部培养基,并置于细胞培养箱中㊂组织块贴壁后,加37ħ完全培养基继续培养㊂约48h后组织块开始迁出P MV E C s,60h左右将组织块取出㊂之后隔天换液1次㊂1.2.2传代培养培养7~10d后,待细胞约为瓶底80%~90%,即可进行传代㊂弃去原培养液,漂洗后消化,待细胞收缩变圆㊁脱落,终止消化并离心㊂将离心后的细胞悬液,按1ʒ1比例传代㊂根据生长情况每1~2d换液1次㊂1.3细胞鉴定1.3.1细胞形态学观察显微镜下观察原代及传代细胞形态㊂1.3.2 Ⅷ因子鉴定取传代细胞,至六孔板内的盖玻片上㊂待细胞爬满玻片后,漂洗后加入4%多聚甲醛固定,0.3%T r i t o n X-100室温破膜,牛血清白蛋白温箱封闭㊂Ⅷ因子4ħ过夜后,加荧光二抗温箱避光孵育,漂洗后观察并记录㊂P B S替代一抗作为阴性对照㊂1.3.3 VW F鉴定按上述方法固定细胞后,依据免疫组织化学二抗试剂盒步骤鉴定VW F㊂P B S 替代一抗作为阴性对照㊂2结果2.1形态学结果显微镜下观察,原代细胞以铺路石样排列生长㊂而传代细胞呈长梭状㊂见图1㊁2㊂2.2 Ⅷ因子鉴定结果免疫荧光显示,细胞胞浆呈现绿色荧光,Ⅷ相关抗原表达阳性㊂见图3㊂2.3VW F鉴定结果免疫组织化学显示, P MV E C s内呈棕褐色,VW F相关抗原表达阳性㊂见图4㊂3讨论研究表明[4-5],肺脏组织大血管与微血管的内皮细胞之间存在着结构与功能的差异㊂在血管生成㊁血管通透性及其他相关研究中,P MV E C s更适合建立研究模型㊂这是因为P MV E C s较大血管有更强的适应环境的特性㊂注:P MV E C s为肺微血管内皮细胞图1组织块植入48h后P MV E C s开始从组织块中迁出ˑ2注:P MV E C s为肺微血管内皮细胞图2原代培养P MV E C s至72h,细胞约为瓶底80%~ 90% ˑ20目前用于原代培养P MV E C s方法主要有组织贴块法㊁免疫磁珠分离法㊁酶消化法等[6-9]㊂后两种方法步骤复杂,对技术及实验环境要求高,存在消化酶浓度把握不准的困难㊂而组织贴块法方法简单,易于操作,原代细胞培养成功率高㊂为提高组织贴块法原代培养P MV E C s的成功率,本实验尝试从以下几个方面进行了改良:①合适的动物选取是原代培养成功的第1步㊂在前期动物选取时,部分学者选择体质量150~250g的成年大鼠[2,10-11]㊂而在本研究的预实验中发现,成年大鼠的肺组织P MV E C s爬出困难,后期细胞生长缓慢㊂经过多次重复选择,最终选用体质量40~50g的幼年大鼠,其新陈代谢快,后期细胞状态好,传代能力强㊂②在灌洗肺循环环节,有的研究为了减少操作时间,摒弃此环节[6]㊂但在刘勇军等[2]的研究中得出,未灌洗的肺组织中存留大量红细胞及红细胞裂解物,影响迁出的P MV E C s的生长活力㊂因此,灌洗肺组织仍是必要的㊂与此同时,我们还发现,选择合适的灌注速度,尽量避免损伤肺微血管,对提高细胞培养的成功率有着至关重要的作用㊂本研究采用1m l注射器针头配10m l 针管从右心室进针缓慢灌洗肺组织至发白,不但可以控制灌注速度,又可清除大量红细胞,降低了裂解物对P MV E C s的毒性作用㊂③如何保证肺组织的活性是实验成功与否的关键㊂在本实验开始阶段,取材时选用未预冷的P B S及完全培养基, P MV E C s迁出率低㊂而将P B S及完全培养基改良为4ħ预冷,后期P MV E C s迁出率增高,生长状态好㊂④组织块是否贴壁是P MV E C s迁出的关键㊂根据以往的研究[12],组织块置于培养瓶后,仍有少量的培养基㊂然而我们经过多次尝试发现,即使少量的培养基,仍可引起组织块漂浮以至于无法贴壁㊂故采用无菌吸管吸去培养瓶中的全部培养基,湿润的瓶底可助于组织块牢固的贴壁,大大提高了P MV E C s迁出率㊂⑤以往的研究发现,即使增大灌注量也无法将肺组织中的红细胞完全清除[2]㊂因此,肺组织块植入后,应隔天换液至组织块取出㊂在本研究中,前期更换细胞培养基时,采用未经预热的P B S及完全培养基,结果发现大片细胞损伤甚至凋亡㊂对于更换培养基引起的凋亡,可能与温度骤然下降有关㊂故我们改良此步骤为,P B S及完全培养基经37ħ预热后再更换细胞培养基㊂而后发现P MV E C s的损伤减轻,改善了细胞生长状态㊂⑥理论上,每次换液时应将血细胞及其裂解产物漂洗干净㊂但在本实验的预实验阶段发现,过度漂洗并不能将裂解产物全部漂洗干净,还可能使组织块漂浮㊂在二者中经过多次权衡,最终采用每次换液前P B S漂洗2次,既可清除大部分裂解产物又可避免组织块漂浮㊂⑦在细胞传代阶段,以往研究多采用0.25%胰蛋白酶[12]㊂然而,0.25%胰酶消化后细胞不易脱落,需反复吹打下来,机械损伤严重㊂而我们将0.25%胰酶提前37ħ预热,胰酶的活性增高,传代后只需轻轻敲打瓶底数下即可,细胞损伤较机械损伤轻㊂⑧在本研究中,细胞固定前P B S漂洗需经37ħ预热,否则后期鉴定细胞时,易出现细胞脱落的现象,影响后期鉴定结果㊂经上述原代培养技术细节的改进,培养成功率大幅提高,且操作可重复性好㊂注:P MV E C s为肺微血管内皮细胞图3 P MV E C s中Ⅷ因子的表达结果免疫荧光 ˑ2注:P MV E C s为肺微血管内皮细胞;VW F为血管性血友病因子图4 P MV E C s中VW F的表达结果免疫组织化学ˑ10本研究显示,原代P MV E C s大多数以团簇状生长,呈典型的铺路石样㊂传代P MV E C s细胞形态与原代细胞形态略不同,呈长梭状,这与贾建桃等[6]的研究是一致的㊂总之,本研究采用了组织贴块法的方法培养P MV E C s,重点是对动物的选取㊁肺灌注的速度㊁漂洗次数及试剂温度等方面的优化㊂改良后的细胞培养重复性高且生长状态好,可在以后的相关研究工作中推广应用㊂参考文献[1]S a k a oS,T a r a s e v i c i e n e-S t e w a r t L,W o o dK,e t a l.A p o p t o s i s o fp u l m o n a r y m i c r o v a s c u l a r e n d o t h e l i a 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n.2095-140X.2013.01.003.(收稿日期:2017-11-07﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏)㊃简讯㊃‘肺脏介入医学“已出版由科学出版社最新出版的中文版‘肺脏介入医学“,是由北京协和医院组织相关专家翻译㊂该书系统的介绍了介入技术在治疗肺部良性与恶性疾病方面的最新内容和方法㊂三位主编:J o h nF.B e a m i s,J rP r a v e e nN.M a t h u rA t u l C.M e h t a均是肺脏介入医学领域的专家;美国支气管病学会的创始人㊂作为当今介入领域知名专家的智慧结晶,这一综合性专著为呼吸科医生及其他专科医师提供了全面的有关介入技术在诊断和治疗领域的应用技术包括硬质支气管术㊁激光治疗㊁冷冻治疗㊁电手术治疗㊁荧光支气管镜术㊁内科胸腔镜以及经支气管壁和经胸壁针吸术等㊂对于异物取出㊁肺胸膜病变以及早期肺癌等处理过程中的困境及具体情况,本书详细阐述了其操作流程㊂该书是呼吸科医生的必备参考书之一㊂定价149.00元㊂邮购电话:010-********传真:010-********地址:100717北京市东黄城根北街16号科学出版社温晓萍(请在汇款附言注明您购书的书名㊁册数㊁联系电话㊁是否要发票等)。