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示差分光光度法示差分光光度法1示差法的原理吸光光度法一般仅适用于微量组分的测定，当待测定组分浓度过高或过低，亦即吸光度测量值过大或过小时，从上节的测量误差的讨论得知，在这种情况下即使没有偏离朗伯—比耳定律的现象，也会有很大的测量误差，导致精准度大为降低。
采纳示差法可克服这一缺点。
目前重要有高浓度示差法，稀溶液示差法和使用两个参比溶液的精密示差法。
其中以高浓度示差法应用*多，本节将侧重讨论。
示差光度法和一般的光度法不同之处重要在于，示差法不是以空白溶液（不含待测组分的溶液）作为参比溶液，而是采纳比待测溶液浓度稍低的标准溶液作参比溶液，然后测量待测溶液的吸光度，再从测得的吸光度求出它的浓度。
这样便大大提高测定结果的精准度。
设用作参比的标准溶液浓度为cs，待测溶液浓度为cx，且cxcs，依据朗伯—比耳定律得到Ax=εcxbAs=εcsb两式相减：A相对=Ax—As=εb（cx—cs）=εbΔc（2—12）实际操作是：用已知浓度的标准溶液作参比，调整其吸光度为零（透光率100%），然后测量待测溶液的吸光度。
这时测得的吸光度实际是这两种溶液吸光度的差值（相对吸光度）。
从（2—12）式可知，所测得的吸光度差值与这两种溶液的浓度差成正比。
这样便可以把空白溶液为参比的稀溶液标准曲线作为ΔA对应于Δc的工作曲线，依据测得的ΔA找出相应的Δc值，从cx=cs+Δc，便可求出待测溶液之浓度，这就是示差法定量测定的基本原理。
2示差法的误差用示差法测定浓度过高或过低试液，其精准度比一般分光光度法高。
这可从图2—3看出。
设图2—3示差法标尺原理按一般分光光度法用试剂空白作参比溶液，测得溶液的透光率Tx=6%，明显，这时的测量读数误差是很大的。
采纳示差法时，假如按一般分光光度法测得的Ts=10%的标准溶液作参比溶液，使其透光率从标尺上Ts1=10%处调至Ts2=100%处，相当于把检流计上的标尺扩展到原来的十倍（TS2/TS1=100/10=10），这样待测试液透光率原来为6%，读数落在光度计标尺刻度很密，测量误差很大的区域，改用示差法测定时，透光率则是60%，读数落在测量误差很小的区域，从而提高了测定的精准度。
示差分光光度法
示差分光光度法是一种在分子取向反应或光谱特性中应用广泛的
分析方法。
首先，示差分光光度法通过比较两种不同取向下的吸收光谱，来
探测反应中的分子结构变化。
通过这种方法，我们可以更好地理解反
应的机理和特性。
其次，示差分光光度法在不同波长或时间段内测量光谱信号，可
以得到很高的灵敏度和分辨率。
这使得该方法在许多不同领域都有应用，如化学、生物学、医学等等。
此外，示差分光光度法还可以用于探测微量物质的存在和浓度变化。
这种方法可以用于监测环境污染、药物代谢等方面。
需要注意的是，示差分光光度法需要设备精细和技术娴熟的操作。
对于初学者来说，需要认真学习理论知识和实验技能，才能获得准确
的测量结果。
总之，示差分光光度法是一种应用广泛、灵敏度高、分辨率高的
分析方法。
在化学、生物学、医学等领域都有广泛的应用前景。
如今，随着技术的不断发展和创新，示差分光光度法将会得到更广泛的应用
和挖掘。
实验九 差示分光光度法测定维生素B 1片的含量一、实验目的1．掌握差示分光光度法的基本原理。
2．熟悉标准曲线定量的操作方法.二、实验原理(一）差示分光光度法(简称△A 法)，它保留了通常的分光光度法简便、快捷、直接读数的优点，又无需事先分离，并能消除干扰.方法：取两份相等的供试液，分别制成两种不同的化学环境（如在其一中加酸或碱,改变pH 或在其一中加能与供试品发生某种化学反应的试剂），然后将它们稀释至同样浓度后，分置于样品池和参比池中,于适当波长处，测定吸光度的差值（△A ）。
应用条件：①供试品在不同的化学环境中以不同的分子形式存在,它们的吸收光谱有显著的差异；②干扰物的吸收不受测定时化学环境的影响，光谱行为不变。
定量依据:设x 、y 分别代表在两种不同的化学环境中供试品的存在形式，它们在测定波长处的吸光度以A x 、A y 表示，背景和干扰的吸收度以A Z 表示，A Z 不受测定时化学环境改变的影响。
根据吸光度加和性原则:即在供试液的一定浓度范围内△A 值与其浓度C 呈线性关系,并消除了A Z 的干扰，可用标准曲线法或对照法定量.（二)维生素B 1片的测定维生素B 1分子中具有共轭双键结构，在紫外区有吸收，其紫外吸收随溶液pH 的变化而变化。
在pH7的磷酸盐缓冲液中具有两个吸收峰，在232~233nm 处，%11cm E =345;在266nm处，%11cm E =255。
在pH2时，最大吸收在246nm 处，%11cm E =425。
可用于维生素B 1片的差示分光光度法的测定.三、实验方法（一）测定波长的选择精密称取维生素B 1100mg ，用水溶解并稀释成100ml ，精密量取2ml 二份，分别用缓冲液（pH 7.0）和盐酸液(pH 2。
0)稀释成100ml ，以相应溶剂为空白，测定紫外吸收光谱。
再将前者放于参比池，后者放于样品池,绘制差示吸收光谱(见图11)。
差示光谱图表明在247nm处有最大差示吸收值(△A)，确定247nm为测定波长。
培训试题（第十三章-第十六章）一、填空(55分)1、紫外可见分光光度法所用的光谱区域为 200～780 nm ，红外光谱法为 2.5～1000 um 。
2、利用比较溶液颜色深浅的方法来确定溶液中有色物质含量的方法就称为比色法。
3、分光光度法特别适用于低含量、微量组分的测定，不适用于高含量组分的测定。
4、由价电子跃进而产生的光谱称为电子光谱。
5、光吸收程度最大处得波长称为最大吸收波长。
6、测量物质分子对不同波长的光的吸收强度的仪器称为紫外可见分光光度计，分光光度计的主要部件包括光源、单色器、吸收池、检测器、测量系统。
7、分光光度计的检测器是一种光电转换设备，它将光强度转变为电讯号显示出来，常用的有光电池、光电管、或光电倍增管。
8、显色反应一般可以分为两类：络合反应、氧化还原反应。
9、分光光度计测定样品时一般控制投射比为 15%～65% ，吸光度为 0.2～0.8 时，测量的相对误差较小，这就是适宜的吸光度范围。
可以采用调节溶液浓度和吸收池厚度来实现。
10、利用紫外分光光度进行定量分析一般不需要选用显色剂，测定条件的选择主要是选择测定最佳波长和溶剂。
11、由分子的振动和转动能级跃迁产生的连续吸收光谱称为分子光谱。
12、红外吸收光谱仪最常用的光源为能斯特灯和硅碳棒。
13、原子吸收光谱与共振荧光光谱互为逆过程。
14、原子吸收光谱仪由光源、原子化系统、分光系统、检测系统 4部分组成。
15、空心阴极灯的工作电流可以采用额定电流的 40%～60% 。
16、火焰原子化器由喷雾器、雾化室和燃烧器 3部分组成。
17、火焰原子化器燃烧器的作用是原子化。
18、采用石墨炉原子化分析过程中灰化是为了除去气体，以减少共存元素的干扰。
19、化学干扰是原子吸收光谱分析中的主要干扰。
20、实现色谱分离的先决条件是必须具备固定相和流动相。
固定相可以是固体吸附剂和涂渍于惰性载体表面上的液态薄膜，流动相可以是具有惰性的气体、液体或超临界流体。
定量分析5. 示差分光光度法用普通分光光度法测定很烯或很浓溶液的吸光度时，测量误差都很大。
若用一已知合适浓度的标准溶液作为参比溶液，调节仪器的100％透射比点（即0吸光度点），测量试样溶液对该已知标准溶液的投射比，则可以改善测量吸光度的精确度。
这种方法称为示差分光光度法。
其原因如图13.25所示。
当测定低透射比（高吸光度）的高浓度试液时，用比试液浓度C1稍低的标准溶液C2作参比溶液，这种示差法叫高吸收法；当测定主透射比（低吸光度）的低浓度溶液时，用比试液浓度稍高的标准溶液作参比溶液，这种示差法叫低吸收法；若同时用浓度不同的两种标准溶液（试液的浓度需介于两标准溶液之间）分别调仪器的100%透射比点及零透射比点，这种示差方法叫最精密法。
较常用的时高吸收法，其原理如下：根据吸收定律有则即用C2作参比测得的A为示差法实质上是相当于把仪器的测量标尺放大，以提高测定的精确度。
如果C2以常规法测得的透射比为10％，在示差法用调至透射比为100％，意味着标尺扩大了10倍。
若待测试液以常规法的最终分析法得的透射比为5％，用C2作参比的示差法测得透射比为50％。
示差法的最终分析结果准确度比常规法高，这是因为尽管示差法测出的很小的ΔC，而测得的误差dC也很大，则仍很大，但最终分析结果的相对误差为，Cs是标准参比溶液，Cs相对很大，所相对误差仍然很小。
6. 光度滴定法分光光度滴定法是利用被测组分或滴定剂或反应产物在滴定过程中的吸光度的变化来确定滴定终点，并由此计算试液中被测组分含量的方法。
分光光度滴定曲线是在某一给定波长处在滴定过程中所测得的吸光度与已知浓度的滴定剂体积之间的关系曲线，其曲线的形状取决于反应体系中样品组分、滴定剂或产物的吸光程度，如图13.26所示。
图13.26（a）是用有色滴定剂（其摩尔吸光系数εt>0）滴定含非吸收组分（εs>0）的试液，生成的产物也无吸收（εp＝0），即εt>0，εs=εp=0；（b）是εp>0，εs=εt=0；（c）是εs>0，εp=εt=0；（d）是εs>0，εt=εp=0；（e）是εp >0，εs=εt=0；（f）是εs>0，εp=εt=0。
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