鲎试剂使用说明书

正文规范鲎试剂灵敏度复核的操作过程和要求，确保鲎试剂灵敏度复核结果的可靠性。

适用于质监处药理室对鲎试剂灵敏度的复核。

质监处药理室分析人员负责本规程的实施和完成相关记录。

USP版附录85；CP版附录Ⅺ E 。

细菌内毒素检查法：本法系利用从鲎的变形细胞中提取的试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的含量是否符合规定的一种方法。

细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。

鲎试剂：是鲎变形细胞的溶出物经提取而成。

鲎试剂灵敏度：在本检查法规定的条件下能检测出内毒素标准溶液或供试品溶液中的最低内毒素浓度，用EU/ml表示。

细菌内毒素检查用水(BET水)：系指与灵敏度为0.03EU/ml 或更高灵敏度的鲎试剂在37 1 C 条件下24小时不产生凝集反应的灭菌注射用水。

细菌内毒素标准品：USP细菌内毒素参考标准品(RSE)或已标定的细菌内毒素工作标准品(CSE)。

反应终点浓度：是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈现阳性结果的浓度。

一、试剂、材料与仪器设备试剂：鲎试剂批号、灵敏度、规格、生产商。

细菌内毒素检查用水(BET水) 批号、规格、生产商。

细菌内毒素标准品批号、效价、生产商。

材料及仪器设备：电热恒温水箱型号、设备编号。

电热鼓风干燥箱型号、设备编号。

漩涡混合器型号。

无热原试管规格：1075mm。

正文无热原玻璃瓶规格：25ml。

无热原玻璃吸管规格：1ml、2ml、5ml、10ml。

试管架、无热原封口膜、洗耳球、酒精棉球、砂轮片。

二、试验准备试验所用的容器、用具都必须经过处理，250C以上干烤至少1小时，以去除外源性内毒素。

试验操作过程应避免微生物的污染。

三、内毒素溶液配制细菌内毒素标准品系列溶液配制取RSE或CSE 1瓶，按照使用说明书加入规定量的细菌内毒素检查用水使溶，并用漩涡混合器间歇混匀30分钟，然后用细菌内毒素检查用水进一步稀释至2.0、、 0.5、 0.25四个浓度的内毒素标准溶液，每一步稀释应混匀至少30秒钟。

鲎试剂简介
鲎试剂是由海洋生物鲎的血液变形细胞溶解物制成的无菌冷冻干燥品，含有能被微量细菌内毒素和真菌葡聚糖激活的凝固酶原，凝固蛋白原，能够准确、快速地定性或定量检测样品中是否含有细菌内毒素和（1,3）-β-葡聚糖激。

目前，鲎试剂广泛用于制药、临床以及科研等领域，用于细菌内毒素和真菌葡聚糖检测。

目前使用的鲎试剂分为美洲鲎试剂和东方鲎鲎试剂两大类。

鲎的血液中含有铜离子，它的血液是蓝色的。

这种蓝色血液的提取物——“鲎试剂”，可以准确、快速地检测人体内部组织是否因细菌感染而致病；在制药和食品工业中，可用它对毒素污染进行监测。

此外，鲎的肉、卵均可食用。

鲎试剂是从栖生于海洋的节肢动物“鲎”的蓝色血液中提取变形细胞溶解物，经低温冷冻干燥而成的生物试剂，专用于细菌内毒素检测和真菌（1,3)-β-D-葡聚糖检测。

鲎试验法是国际上至今为止检测内毒素最好的方法，它简单﹑快速﹑灵敏﹑准确，因而被欧美药典及我国药典定为法定内毒素检查法，并已被世界各国所采用。

目前能生产鲎试剂的主要有美国、日本、中国等国家。

鲎试剂实验方法鲎试剂按实验方法可分为：凝胶法、动态浊度法鲎试剂、终点浊度法鲎试剂、动态显色法鲎试剂、终点显色法鲎试剂。

凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来定性检测或半定量内毒素的方法。

凝胶法是通过观察有无凝胶形成作为反应的终点。

此法操作比较简单，经济，不需要专用测定设备，可以进行定性或半定量测定。

凝胶法鲎试剂常见规格为0.1ml/支或0.2ml/支的单个测试或0.5ml/支至5.2ml/瓶的真空封口西林瓶装的多个测试。

使用时一般应加细菌内毒素检查用水复溶后使用。

厦门市鲎试剂实验厂有限公司的真空封口试管凝胶法鲎试剂是把鲎试剂直接灌装在试管中，在真空中压盖封口的新产品。

使用时直接用样品溶解鲎试剂，不会割伤手，更加简单方便安全。

特异性鲎试剂，即弃G因子鲎试剂，是厦门市鲎试剂实验厂有限公司国内首创的产品，它专一对内毒素起反应，避免了G因子旁路的干扰，使检测结果更加可靠，在药检和临床检验方面是不可或缺的理想检测试剂。

目前厦门市鲎试剂实验厂有限公司提供的各种内毒素检测鲎试剂均为特异性鲎试剂，都能对抗葡聚糖的干扰，只对内毒素起反应。

因此不列为独立品种。

动态浊度法鲎试剂、终点浊度法鲎试剂、动态显色法鲎试剂、终点显色法鲎试剂，这四种方法都是定量检测内毒素的。

这几种定量法鲎试剂统称光度法鲎试剂。

根据检测原理，终点浊度法和动态浊度法都属于浊度法。

浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法。

终点浊度法未见商品化产品。

动态浊度法（又称动态比浊法）是检测反应混合物的浊度上升某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。

动态浊度法的特点为：1. 能准确定量。

2.检测范围宽，可达4个数量级。

3.灵敏度高达0.005EU/ml。

4. 操作简便，系统自动检测分析，一步即成。

5. 经济实用，试剂样品需要量少，可降至50μL。

6. 和微生物检测系统Elx808（配套IU）及专用软件TALgent使用，一次可同时检测多达96个样品。

凝胶法鲎试剂使用说明书一、检测步骤1、标准品稀释：开启后加入检查用水（W）1.2ml，置漩涡混合器上混合5min，得到浓度为10EU/ml的内毒素溶液，标记为（E10），其余各梯度稀释方法如下：0.3ml 1.5ml 1.5ml 1.5ml 1.5ml 1.5mlE10 －－－→E1－－－→E0.5－－－→E0.25－－－→E0.125－－－→E0.06－－－→E0.032.7mlW 1.5mlW 1.5mlW 1.5mlW 1.5mlW 1.5mlW此步骤为新开启标准品者操作，各梯度做好标记，其余操作人员可直接使用。

2、取鲎试剂8支，折断安瓿瓶颈，其中2支作供试品检查管，2支作阴性对照管，2支作阳性对照管，2支作供试品阳性对照管，做好标记。

3、阴性对照管加入0.2ml检查用水，其余各管加入0.1ml检查用水，每支供试品检查管另加入0.1ml供试品；阳性对照管加入0.1ml浓度为2λ（即0.1ml 的E0.125）内毒素溶液，供试品阳性对照管加入0.1ml含2λ（即0.1ul 的E1）内毒素的供试品。

4、封闭管口，轻轻摇匀，垂直放入37℃的恒温金属浴中60min，然后取出观察结果。

在孵育期间避免任何震动！二、结果判断1、将试管从恒温器中轻轻取出，缓慢倒转180°，若管内形成凝胶，不变形，不滑落者为阳性，记录为（+）；反之为阴性，记录为（—）。

取出试管应尽量避免受到震动造成假阴性结果！2、阴性对照管必须为阴性，阳性对照管、供试品阳性对照管必须为阳性，否则实验结果无效。

3、若阴性对照管为阳性，表明鲎试剂或检查用水货实验器具受到污染；若阳性对照管为阴性，表明鲎试剂或标准内毒素已失效，或鲎试剂的灵敏度及标准内毒素的效价标示不准，或实验条件不满足；若供试品阳性对照管为阴性，表明反应体系内有抑制反应的干扰因素存在。

2005年版中国药典《细菌内毒素检查法》凝胶法鲎试剂使用说明书【名称】通用名：鲎试剂英文名：Tachypleus Amebocyte Lysate （简称TAL）汉语拼音：hou shi ji本品主要成份为B因子、C因子、凝固酶原、凝固蛋白原。

【用途】专用于细菌内毒素检查。

【性状】本品为白色或类白色冻干块或粉末，在水和生理盐水中易溶。

【原理】本品为鲎科动物东方鲎的血液变形细胞溶解物的无菌冷冻干燥品，在适宜的条件下（温度，pH值及无干扰物质），细菌内毒素激活鲎试剂中的凝固酶原，使鲎试剂产生凝集反应形成凝胶。

【用法】1．材料和设备1.1选择所需的规格及灵敏度的鲎试剂、细菌内毒素工作品及细菌内毒素检查用水。

1.2准备若干支10ⅹ75mm玻璃反应试管（若使用0.1ml规格的鲎试剂无需准备此试管）、各种规格吸管或移液器或注射器、稀释内毒素用玻璃管、反应试管架、计时器、旋涡混合仪、恒温水浴箱（37±1℃）。

2．实验操作2.1 稀释细菌内毒素工作品：取内毒素工作品（冻干品）1支，按细菌内毒素工作品使用说明书进行操作。

2.2 TAL试剂的溶解：按标示量加细菌内毒素检查用水于TAL试剂中，轻轻振摇至少30S至试剂完全溶解。

注意不要引起气泡，溶解后的试剂应在短时间内使用（即配即用）。

2.3 检查操作2.3.1 取分装有0.1ml 鲎试剂溶液的10×75mm试管或复溶后的0.1ml /支规格的鲎试剂原安瓿8支，其中2支作供试品管，2支作阴性对照管，2支作阳性对照管，2支作供试品阳性对照管。

2.3.2 每支供试品管加入0.1ml供试品；阴性对照管加入0.1ml检查用水；阳性对照管加入0.1ml浓度为2λ的内毒素溶液，供试品阳性对照管加入0.1ml含2λ内毒素的供试品。

2.3.3 封闭管口，轻轻摇匀，垂直放入37±1℃的恒温器中孵育60±2分钟，然后取出观察结果。

试管在孵育期间应避免任何的振动。

[精华]鲎试剂试验方法鲎试剂实验方法鲎试剂按实验方法可分为:凝胶法、动态浊度法鲎试剂、终点浊度法鲎试剂、动态显色法鲎试剂、终点显色法鲎试剂。

凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来定性检测或半定量内毒素的方法。

凝胶法是通过观察有无凝胶形成作为反应的终点。

此法操作比较简单，经济，不需要专用测定设备，可以进行定性或半定量测定。

凝胶法鲎试剂常见规格为0.1ml/支或0.2ml/支的单个测试或0.5ml/支至5.2ml/瓶的真空封口西林瓶装的多个测试。

使用时一般应加细菌内毒素检查用水复溶后使用。

厦门市鲎试剂实验厂有限公司的真空封口试管凝胶法鲎试剂是把鲎试剂直接灌装在试管中，在真空中压盖封口的新产品。

使用时直接用样品溶解鲎试剂，不会割伤手，更加简单方便安全。

特异性鲎试剂，即弃G因子鲎试剂，是厦门市鲎试剂实验厂有限公司国内首创的产品，它专一对内毒素起反应，避免了G因子旁路的干扰，使检测结果更加可靠，在药检和临床检验方面是不可或缺的理想检测试剂。

目前厦门市鲎试剂实验厂有限公司提供的各种内毒素检测鲎试剂均为特异性鲎试剂，都能对抗葡聚糖的干扰，只对内毒素起反应。

因此不列为独立品种。

动态浊度法鲎试剂、终点浊度法鲎试剂、动态显色法鲎试剂、终点显色法鲎试剂，这四种方法都是定量检测内毒素的。

这几种定量法鲎试剂统称光度法鲎试剂。

根据检测原理，终点浊度法和动态浊度法都属于浊度法。

浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法。

终点浊度法未见商品化产品。

动态浊度法(又称动态比浊法)是检测反应混合物的浊度上升某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。

动态浊度法的特点为:1. 能准确定量。

2.检测范围宽，可达4个数量级。

3.灵敏度高达0.005EU/ml。

4. 操作简便，系统自动检测分析，一步即成。

5. 经济实用，试剂样品需要量少，可降至50μL。

6. 和微生物检测系统Elx808(配套IU)及专用软件TALgent使用，一次可同时检测多达96个样品。

标准品、鲎试剂操作规程目的：建立标准品、鲎试剂操作规程，指导检验员正确执行标准品、鲎试剂操作。

1.适用范围：适用于标准品、鲎试剂操作。

2.定义2.1标准品系以细菌内毒素国家标准品为基础标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。

3.责任：QC人员。

4.规程4.1申购4.1.1标准品采购：按《对照品操作规程》中对照品申购程序，进行采购。

到药品检验所或中国生物制品检定所统一订购。

4.1.2鲎试剂采购：由管理员根据检验需要，填写申购单，注明：品名、规格、灵敏度、数量、购回日期。

交化验室主任核准后，交物料部采购。

4.2接收4.2.1物料部将鲎试剂与标准品购回后，管理员接通知，开具领料单。

4.2.2经化验室主任签字后，凭领料单到仓库领用。

4.2.3接收前，管理员仔细核对所领细菌内毒素工作标准品或鲎试剂的规格、数量、有效期和灵敏度，检查外包装、标签有无损坏或泄漏。

无误后，方可接收。

4.3贮存4.3.1接收的标准品与鲎试剂根据其特性存放在适宜的条件下，且根据批号、灵敏度分类摆放。

4.3.2管理员及时登记《标准品、鲎试剂接收、使用记录》。

4.4发放、使用4.4.1检验员根据检品需要，向管理员申请试验用量的标准品、鲎试剂。

4.4.2管理员在核实申请情况后，方可发放。

4.4.3领用后，检验员登记《标准品、鲎试剂接收、使用记录》，管理员签名确认。

4.4.4每批入库的鲎试剂必须按药典规定，进行灵敏度复核试验，符合规定后方可发放、使用。

4.4.5鲎试剂灵敏度复核4.4.5.1根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在漩涡混合器上混匀15分钟，然后制成2λ、λ、0.5λ、0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每步混匀30秒。

4.4.5.2取复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个浓度平行做4管；另两管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。

显色基质鲎试剂盒使用说明书(终点显色法，含偶氮化试剂)【用途】显色基质鲎试剂( Chromogenic End-point Tachypleus Amebocyte Lysate , CE TAL )用于体外细菌内毒素的定量检测，禁止以任何途径进入机体。

【原理】鲎试剂为鲎科动物东方鲎的血液变形细胞溶解物的冷冻干燥品,鲎试剂中含有Ｃ因子、Ｂ因子、凝固酶原、凝固蛋白原等。

在适宜的条件下（温度，pH值及无干扰物质），细菌内毒素激活C 因子，引起一系列酶促反应，激活凝固酶原形成凝固酶，凝固酶分解人工合成的显色基质，使其分解为多肽和黄色的对硝基苯胺（pNA，λmax = 405nm）。

在一定时间内，pNA的生成量与细菌内毒素浓度成正相关，据此，可以定量供试品的内毒素浓度。

同时，对硝基苯胺（pNA）也可用偶氮化试剂染成玫瑰红色（λmax = 545nm），避免了供试品本身的颜色对405nm处吸收峰的干扰。

【检测限】按反应时间不同可检测0.1EU/ml-1 EU/ml和0.01EU/ml -0.1EU/ml两个区间( 反应时间T 1 和T 2 见出厂检验报告) 。

【试剂盒组成】细菌内毒素工作品，2支鲎试剂， 1.7ml/支，2支显色基质，1.7ml/支，2支偶氮化试剂1，10ml/支，2支偶氮化试剂2，10ml/支，2支偶氮化试剂3，10ml/支，2支HCl (反应终止剂)，50ml/瓶，1瓶细菌内毒素检查用水，50ml/瓶，2瓶【贮存】阴凉处, 最佳2-8℃,避光贮存。

【用法】1 .材料和设备1.1 试剂鲎试剂、细菌内毒素工作品、显色基质、偶氮化试剂1 、偶氮化试剂2 、偶氮化试剂3、HC l ( 反应终止剂) 、细菌内毒素检查用水。

1.2器材旋涡混合仪、移液器、多道移液器、封口膜、试管架。

恒温水浴箱（37±1℃）、分光光度计。

注意：接触试剂及供试品的所有器皿必须是无热原的(我公司提供无热原耗材)。