重组人表皮生长因子生物学活性测定法

重组人表皮生长因子生物学活性测定法
（细胞增殖法/MTT比色法）
本法系依据重组人表皮生长因子对小鼠胚胎成纤维细胞（Balb/c3T3细胞）的生长具有刺激作用，Balb/c3T3细胞的生长状况因重组人表皮生长因子生物学活性的不同而异，以此检测重组人表皮生长因子的生物学活性。
试剂：
（1）RPMI 1640培养液：
Hale Waihona Puke Baidu测定方法：
Balb/c3T3细胞株用完全培养液于37℃、5%二氧化碳培养，控制细胞浓度为每1ml含1.0 X105--5.0 X 106个细胞，传代后24—36小时用于生物学活性测定。弃去培养瓶中的培养液，消化和收集细胞用完全培养液配成每1ml含5.0 X104--8.0 X 104个细胞的细胞悬液 ，接种于96孔板中，每孔100ul，于37℃、5%二氧化碳条件下培养。24小时后换成维持培养液。置37℃、5%二氧化碳培养24小时。制备的细胞培养板弃去维持液，加入标准品溶液和供试品溶液，每孔100ul。置37℃、5%二氧化碳培养64—72小时。每孔加入MTT溶液20ul，于37℃、5%二氧化碳培养5小时。以上操作在无菌条件下进行。弃去培养板中的液体后，向每孔中加入DMSO 100ul，混匀后在本科标仪上，以630nm为参比波长，570nm为试验波长测定吸光度，记录测定结果。
试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理。并按下式计算结果;
供试品生物学活性（IU/ml）=Pr*Ds*Es/Dr*Er,式中Pr为标准品生物学活性，IU/ml。
Ds为供试品预稀释倍数；
Dr为标准品预稀释倍数；
Es为供试品相当于标准品半效量的稀释位数；
Er为标准准备半效稀释倍数。
标准品沉沦的制备：
取理组人表皮生长因子标准品按说明书复溶后，用维持培养液稀释至每1ml含50 IU。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个浓度做2个孔。以上操作在无菌条件下进行。
供试品溶液的制备：
将供试品按标示量复溶后，用维持培养液稀释成每1ml约含50 IU。在96孔板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个浓度做2个孔。以上操作在无菌条件下进行。
量取新生牛血清100ml，加RPMI 1640培养液到1000ml。
（4）PBS：
量取氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并稀释到1000ml的溶液，经121℃，15分钟灭菌。
(5)噻唑蓝（MTT）溶液：
取MTT粉末0.10g，加PBS20ml使溶解，经0.22um滤膜过滤除菌。4℃避光保存。
RPMI 1640培养基粉末1袋（规格为1L），加水溶解并稀释到1000ml，加青霉素105U/ml（1ml），链霉素105mg/ml(1ml),再加碳酸氢钠2.1g，溶解后，混匀，除菌过滤，4℃保存。
（2）维持培养液:
量取新生牛血清4ml，加RPMI 1640培养液到1000ml。
（3）完全培养液：