原代细胞的培养

原代细胞分离与培养，你都掌握了吗？导语对于⼤部分科研⼈员来说，研究中⼀般⽤到均是现成的细胞系/株，我们只需要：进⾏细胞传代和保种。

然⽽，这些细胞系常常由于体外长期培养，⽽丢失原有⽣物学特性，对药物处理的反应差距越来越⼤。

因此，原代细胞的地位⽇渐凸显，Paper中若有了原代细胞的数据都会添⾊不少。

然⽽，就⼩编亲⽣经历，原代细胞分离着实是个技术活，今天我们就结合⾃⾝经验，为⼤家介绍：肿瘤组织和正常组织的原代细胞的分离与培养⽅法。

第⼀部分：原代细胞的基本知识1. 什么是原代细胞培养?原代细胞（Primary cells）：是指直接从机体取出的组织或细胞获得单个细胞并在体外进⾏培养的细胞。

这⾥的组织主要指：组织器官、外周⾎及胚胎等。

原代细胞培养：由于原代细胞⽣长缓慢，繁殖⼀定的代数停⽌⽣长（⼀般10代以内）。

所以⼀般认为：培养的原代的第1和传代到第10代以内的细胞统称为原代细胞培养。

2. 原代细胞与细胞系（cell lines）的区别原代细胞和细胞系的⽐较：Primary cells Cell lines增殖能⼒较弱强繁殖代数⼀般只能传10代以内⽆限增殖，50代左右遗传物质完整性遗传物质未改变遗传物质发⽣改变⽣物特性最接近临床样本偏离临床样本培养容易程度⽐较复杂简单，易操作原代细胞和细胞系的⽐较3. 原代细胞的应⽤由于原代细胞⽣物学特性未发⽣很⼤改变，最接近和反映体内⽣长特性，因此是：(1) 研究⽣物体细胞的⽣长、代谢、繁殖提供有⼒的⼯具；(2)更好实现精准医疗的肿瘤诊治模式，实现个体化精准⽤药的⽬的。

第⼆部分：原代细胞分离和培养技术原代培养的原理将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶(常⽤胰蛋⽩酶/胶原酶)、螯合剂(常⽤EDTA)或机械⽅法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以⽣存、⽣长和繁殖，这⼀过程称原代培养。

主要包括取材——分离——培养等3部分；在原代细胞应⽤较多的包括：组织器官（如实体瘤、⽪肤等）、悬浮细胞的取材等。

原代细胞传代培养步骤引言原代细胞传代培养是细胞生物学研究中常用的技术手段之一。

它是指从活体组织或器官中分离得到的原代细胞，通过定期的传代培养，使其继续生长并保持其生物学特性。

本文将详细介绍原代细胞传代培养的步骤和注意事项。

准备工作在进行原代细胞传代培养之前，我们需要准备好以下工具和试剂：•细胞培养基：选择适合特定细胞系的培养基，常用的有DMEM、RPMI-1640等。

•离心管：用于离心细胞，分离上清液和沉淀。

•培养皿：提供细胞黏附和生长的平台，常用的有培养瓶、96孔板等。

•传代液：通常为含有生长因子和抗生素的培养基。

•培养箱：提供细胞培养所需的恒温和二氧化碳环境。

步骤步骤一：细胞收集1.准备组织或器官：选择合适的组织或器官，并保持其在解剖过程中的无菌状态。

2.组织分离：将组织或器官剪碎，并加入适当的消化酶，如胰蛋白酶、胶原酶等进行消化。

3.离心分离细胞：将消化后的组织离心，以分离出上清液和含有细胞的沉淀。

步骤二：细胞培养1.细胞计数：使用细胞计数板或血细胞计数仪进行细胞计数。

2.接种细胞：将细胞按照一定比例加入含有细胞培养基的培养皿中。

3.培养条件：将培养皿放入预先调试好的培养箱中，保持适当的温度（通常为37摄氏度）和二氧化碳浓度（通常为5%）。

4.观察细胞生长：每天观察细胞的生长情况，记录细胞的形态和数量等信息。

步骤三：传代培养1.细胞达到80%～90%的密度时，可以进行传代培养。

2.清除培养液：将培养皿中的培养液倒掉，用无菌PBS对细胞进行冲洗，以去除残留的培养基和细胞碎片。

3.添加胰蛋白酶等消化酶：根据细胞系的特性和耐受性，加入适量的胰蛋白酶，进行细胞的消化。

4.停止消化：加入含有细胞培养液的离心管，停止细胞的消化过程。

5.离心分离：将细胞悬液离心，以分离出上清液和细胞沉淀。

6.细胞计数：使用细胞计数板或血细胞计数仪对细胞进行计数。

7.接种细胞：将计数后的细胞按照一定比例加入含有传代液的培养皿中。

原代细胞培养操作注意事项
1.原代细胞培养前需进行消毒处理，保证培养环境的无菌状态；
2. 原代细胞培养需要使用无菌器具，包括培养皿、离心管、移液器等；
3. 培养液的配制需精确，避免出现过高或过低的浓度，影响细胞的生长；
4. 原代细胞培养需要注意细胞的密度，不宜过于密集或过于稀疏，否则会影响细胞的形态和生长状态；
5. 培养液的更换需要掌握好时机，避免细胞受到过度刺激而死亡；
6. 培养液的温度需要控制在适当范围内，一般为37℃左右，避免过高过低的温度对细胞的影响；
7. 在培养细胞时需要注意细胞的形态和状态，及时进行观察和记录，避免出现异常现象；
8. 在培养细胞的过程中，需要及时处理细胞的废液和残留物，保持培养环境的清洁和整洁；
9. 培养细胞的过程中需要注意细胞的营养供给和氧气的供应，保证细胞的正常生长和分裂。

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动物细胞原代培养名词解释1.引言1.1 概述动物细胞原代培养是一种重要的实验手段，被广泛应用于生物学研究领域。

通过原代培养，科研人员可以将动物体内的细胞从组织或器官中分离出来，并在适当的培养条件下培养和繁殖这些细胞。

这种培养方法能够维持细胞的生长和功能，使其能够在体外环境下长期存活。

原代培养的过程可以分为两个主要阶段：细胞分离和细胞培养。

首先，需要将动物组织或器官进行机械或酶解分离，以获得单个的细胞悬浮液。

然后，将这些分离的细胞种植在含有适当培养基和营养物质的培养皿中，提供合适的温度、湿度和氧气条件，使细胞得以生长和分裂。

通过原代培养，科研人员可以获得大量的动物细胞来进行各种实验和研究。

这些细胞可以用于研究细胞的生理功能、细胞周期、细胞信号传导以及疾病模型的建立等。

此外，通过原代培养还可以进行细胞遗传学研究、药物筛选和细胞工程等领域的实验。

总而言之，动物细胞原代培养是一种重要的实验手段，可以为科研人员提供源源不断的动物细胞来进行各种研究。

它为细胞生物学、医学研究以及药物开发等领域的进展提供了坚实的基础，并在解决许多科学问题中扮演着重要的角色。

文章结构指的是文章的组织框架和布局。

它的作用在于使读者能够清晰地理解整篇文章的内容和结构，从而更好地把握文章的主旨和论证思路。

本文按照以下结构进行组织和呈现：1. 引言1.1 概述在这一部分，将对动物细胞原代培养的基本概念和背景进行简要介绍，引起读者的兴趣，并提出研究的意义。

1.2 文章结构（即本节内容）在这一部分，将对整篇文章的结构进行概述，介绍各个章节的内容以及它们在整篇文章中的作用。

1.3 目的在这一部分，明确研究动物细胞原代培养的目的，说明研究的意义和价值，为读者提供清晰的导向。

2. 正文2.1 原代培养详细介绍什么是原代培养，原代培养的步骤和方法，以及原代培养在细胞研究中的重要性和应用领域。

2.2 动物细胞介绍动物细胞的结构和特点，包括细胞膜、细胞质、细胞核等重要组成部分，以及动物细胞在生物学研究和医学领域中的应用。

原代细胞培养步骤(1)、取新生SD大鼠3只，入75%酒精消毒2分钟，断颈取脑。

(2)、将新生鼠脑放入盛有冷的D’Hanks平衡盐溶液的玻璃培养皿内，置冰盘上，于解剖显微镜下仔细剥除脑膜(3)、将分离的海马组织放入另一个盛有冷的D’Hanks溶液的玻璃培养皿内，用眼科剪剪成小碎片，并移入15(4)、向离心管中加入37℃ 0.25%胰酶溶液，每6个海马组织加1ml胰酶消化液，放入37℃培养箱中孵育10-1即可。

900rpm离心2min。

(5)、吸除胰酶消化液，加入等量的37℃种植液以终止消化，置室温10min。

、加入2ml种植液，以抛光的滴管吹打约15次，分散细胞，静置10min（如仍有组织块，应用200目筛网(7)、调整细胞密度，以90-320/mm2的密度种于六孔板内。

置37℃ 5%CO2培养箱中培养。

、24h后全部吸除种植液，更换成Neurobasal + 2% B27培养液培养。

此后每周以此液半量换液2次。

培养8-10天进行下一步实验。

投票1收藏1实验已经开始了，遇到了其他一些新的问题，但在此我想说说我取新生大鼠海马的体会：象有战友说的那样，我刚开始也是成年大鼠上练习的，一切都还比较顺利，但是要取新生1天的大鼠海马是否要困难的多，主要是由于脑组织太嫩了，稍不注意就化成泥了。

1.冻僵老鼠后，用酒精浸泡消毒，然后用PBS液清洗一下，剪下鼠脑。

2.游离脑部皮肤，用眼科剪经枕骨大孔沿矢状缝剪开颅骨，轻轻游离颅骨和脑组织后，在顶骨和顶间骨之间向左右剪开，然后剪掉颅骨，尽可能往两侧剪，使脑组织充分暴露，以便下一步剥离脑皮质和游离海马。

3.用眼科剪分别两侧在大脑皮质中间横向剪开，深约1mm，然后将整个脑置于装有PBS液的培养皿中，要使液体没过脑组织。

用刮针（用缝衣服的针插在一次性筷子里自制的，用针鼻儿那头）沿着刚才的切口轻轻的向后刮除皮质，切忌过深，完全显露出海马后，从两侧游离，使其漂浮于液体中，然后用牙刮匙从连接处将整个海马从脑中分离出来。

ScienCell原代细胞培养方法2018.06.01原代细胞在复苏和传代前一定要包被培养瓶，以促进细胞贴壁。

以人脐静脉内皮细胞（sciencell，货号#8000）为例：1.培养瓶包被包被液纤维粘连蛋白（sciencell，货号#8248）以1-2ug/cm2的浓度包被培养瓶。

可将1mg/ml的纤维粘连蛋白不含钙镁离子的磷酸盐缓冲液（sciencell，货号#0303）稀释100倍，T-75培养瓶中加入10ml左右，37度孵箱1小时或4度冰箱过夜，并用灭菌双蒸水洗涤培养瓶2遍（此步骤非常重要，必须清洗2遍），包被好的培养瓶不要放置超过24小时。

2.配制培养基以ECM培养基为例把胎牛血清（sciencell，货号#0025）、生长因子（sciencell，货号#1052）和双抗（sciencell，货号#0503）加入培养液中，混匀后的完全培养基于4度保存，应尽快使用。

可分装以延长效期。

3.细胞复苏在培养瓶中加入配制好的ECM培养基10ml（推荐复苏至T75培养瓶，如T25瓶子加5ml）从液氮中取出冻存原代细胞，37度水浴冻融，冻融过程中可以轻轻转动细胞，加快冻融速度（注意原代细胞复苏时一定不要离心），将融化的细胞放入已加入培养基的培养瓶中，再用1ml培养基洗涤细胞冻存管，保证原代细胞都被加入培养瓶中，然后静置于孵箱，12-16小时后更换培养基以除去DMSO。

4.原代细胞传代细胞生长至70-80%左右可以传代，传代比例1:2或1:3为佳。

首先弃去培养基，PBS或D-Hank’s液洗涤培养瓶2遍，加入适量0.25%Trypsin-EDTA，37度孵育，轻拍培养瓶侧面，显微镜下观察原代细胞消化情况。

细胞消化好后，加入适量的胰酶中和液以中和胰酶，然后将原代细胞和培养基转移至离心管中，1000rpm离心5分钟。

然后弃去上清液，以1-2ml培养基重新悬浮原代细胞，加入包被好的已加入培养基的培养瓶中。

根据原代细胞生长情况，大概每2天更换培养基。

细胞原代培养、传代培养、冻存和复苏细胞培养是指将生物体内分离出的细胞种植在培养基中，供其生长和繁殖的实验过程。

细胞培养已成为生命科学和医学研究中不可或缺的基础工具。

在细胞培养中，常见的术语有原代培养、传代培养、冻存和复苏。

原代培养原代培养是将从组织中分离出的细胞直接进行培养，即首次培养。

通常将组织切割成小段或分散成单细胞悬液，加入培养基中，使其中的细胞粘附在培养基表面上生长。

原代培养中所得细胞经常受到组织来源、细胞类型和培养条件等因素的影响，因此可能表现出较高的细胞异质性。

传代培养传代培养是将进行了原代培养的细胞进行维持和扩增的过程。

在细胞生长到足够数量时，将细胞分散到更大容量的培养器中，以继续扩增细胞数量。

传代培养次数过多时可能导致细胞老化并失去功能。

在细胞传代培养过程中，注意以下几点：•选择合适的培养基和培养条件；•周期性检测细胞的形态、生长状态和细胞数目；•保持细胞复合度和细胞同型性。

冻存为了保存细胞株，通常会将细胞用特殊培养基和添加剂冻存。

冻存过程中，细胞首先保护在保护剂中，然后在液氮的温度下迅速冷冻，以避免细胞深受冰晶形成的伤害。

冻存后的细胞可保存数年，并可进行后续的实验研究。

## 复苏冻存后，需要将细胞复苏。

推荐以下步骤：•用生长培养基预热，将细胞移植到生长培养基中，尽量使样品在细胞数目、时间和温度上保持一致；•在细胞培养箱中培养，控制CO2浓度（通常为5％）和口袋气体混合在空气中的湿度；•更换完整的生长培养基，加入所需的辅助剂，如血清或其它所需的生长因子。

如上所述，细胞培养是生物学和医学研究中不可或缺的基础工具。

正确地进行细胞培养和细胞处理很重要，因为不同的操作条件将影响最终培养出的细胞的数量和质量。

在实验中进行细胞培养和处理时，应该遵守正式的安全和操作规程。

一、实验目的1. 熟悉并掌握哺乳动物细胞原代培养的基本操作流程。

2. 学习细胞消化、细胞计数、营养液的配制及酸碱度的调节。

3. 了解无菌操作的重要性，学会分辨死活细胞，掌握细胞计数。

二、实验原理细胞培养是生物学和医学研究的重要手段之一，可分为原代培养和传代培养。

原代培养是指从生物体中取出某种组织或细胞，在人工培养条件下使其生存、生长、繁殖或传代的过程。

细胞培养技术的最大优点是使我们得以直接观察活细胞，并在有控制的环境条件下进行实验，避免了体内实验时的许多复杂因素。

细胞培养可分为原代培养和传代（继代）培养。

直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养，传代培养的累积次数就是细胞的代数。

细胞培养是一种程序复杂、要求条件多而严格的实验性工作。

所有离体细胞的生长都受温度、渗透压、pH值、无机盐等因素的影响。

三、实验材料与试剂1. 实验材料：新生乳鼠肺组织2. 器材：眼科剪、眼科镊、泡器械（直径15cm）、培养皿、动物解剖用的泡沫支架、青霉素瓶、吸管、培养瓶、离心管、废液瓶、倒置显微镜、二氧化碳培养箱、电磁搅拌器3. 试剂：Hank’s液、RPMI-1640液、血清细胞培养液、安尔碘、酒精四、实验步骤1. 取新生乳鼠肺组织，用无菌手术刀将组织切成小块。

2. 将组织块放入装有Hank’s液的培养皿中，用眼科剪和眼科镊轻轻剪碎组织。

3. 将剪碎的组织块移入离心管中，加入适量胰蛋白酶，在37℃水浴中消化10分钟。

4. 将消化后的细胞悬液移入离心管中，1000 rpm离心5分钟，弃上清。

5. 用RPMI-1640液重悬细胞，调整细胞浓度至1×10^6细胞/mL。

6. 将细胞悬液接种于培养皿中，放入二氧化碳培养箱中培养。

7. 每2-3天更换一次培养液，观察细胞生长情况。

细胞原代培养【实验目的】1.理解细胞原代培养原理2.熟悉细胞原代培养方法与过程3.了解细胞原代培养的应用4.独立进行细胞原代培养操作【实验原理】1、原代培养实验原理细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。

原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养，即组织直接从机体获取后,通过组织块长出单层细胞,或者用酶消化或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养,在首次传代前的培养可认为是原代培养。

由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。

这一方法可为研究生物体细胞的生长，代谢，繁殖提供有力的手段。

同时也为以后传代培养创造条件。

原代培养的过程指动物的组织或器官从机体取出后，经机械法或各种酶类（常用胰蛋白酶）和鳌合剂（常用EDTA)处理，使之分散成单个细胞,加入适量培养基，置于合适的培养容器中，在无菌、适当温度和一定条件下，使之生存、生长和繁殖的过程。

原代培养的方法有：a.组织块法:在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm3大小。

用Hanks液洗涤2—3次，自然沉淀。

用吸管吸去上清液。

将组织块贴于培养瓶进行培养。

b.酶消化法:将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml的0.125%的胰蛋白酶。

370C磁棒搅拌消化20－30分钟。

然后终止消化。

用几层无菌纱布过滤。

取过滤液，离心800rpm 5—10分钟收集细胞。

弃上清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶培养。

【实验仪器、材料、试剂及用品】1.仪器：荧光显微镜，CO2培养箱2.材料：孕鼠3.试剂：(1) 培养液：为DMEM，添加10％新生牛血清(NBS)、青霉素100 u／ ml 、链霉素100ug／ml。

(2)消化液：为0.125％胰蛋白酶—0.02％EDTA 混合消化液。

4.用品：镊子，剪刀，培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸，75％酒精棉球，酒精灯、小指管。

【实验步骤】(一)小鼠胚胎的准备:1.取怀孕16～18d的母鼠，断颈处死，置于75%的酒精中。

动物细胞原代培养和传代培养中的培养方法1. 引言嘿，大家好！今天咱们聊聊动物细胞的培养，听起来可能有点高大上，但其实就像种花一样，只是“花”是细胞，养护的方法也有讲究。

说白了，细胞也有自己的“家”，咱们得给它们创造个舒适的环境，让它们在里面嗨起来！接下来，我就带你走进这个充满神奇和乐趣的细胞世界。

2. 原代培养2.1 什么是原代培养？原代培养，简单来说，就是从活体动物身上直接提取细胞，然后把它们放在培养皿里，就像把新鲜的花插进水里一样。

你知道吗，这些细胞就像刚从大自然里来的小家伙，特别活泼，适应能力强。

不过，这可不是随便就能搞定的，得有点技术活。

2.2 原代培养的方法首先，咱得准备好一切工具，这可是基础中的基础，不能马虎。

咱们要用到无菌技术，确保培养环境干净得像新洗的碗，不然细胞们就会遭殃。

提取细胞时，通常会用胰酶把它们从组织中“松开”，就像剥开一个大榴莲，里边的果肉才好吃嘛。

然后，把这些细胞放到培养基里。

培养基就像细胞的“快餐”，里面有细胞需要的各种营养物质和生长因子。

要记得，细胞也要“吃好”，才能长得壮壮的，不然就不成气候了。

培养的环境也不能小看，温度、pH值、二氧化碳浓度都得保持稳定。

咱们得把细胞放在适合的温度下，就像给它们开个温暖的“家庭聚会”。

如果环境不合适，细胞就会抗议，甚至罢工！3. 传代培养3.1 什么是传代培养？说到传代培养，那就是把原代培养中的细胞继续繁殖，让它们“生儿育女”。

这就像一个大家庭，越来越壮大，热闹得不得了。

传代培养可以让我们获得更多细胞，方便后续的实验和研究。

3.2 传代培养的方法传代培养的关键在于及时分离细胞，咱不能让细胞们挤在一起，这样容易“打架”。

通常，当细胞长满培养皿后，就需要把它们分离开。

这个过程又得用到胰酶，跟原代培养一样，轻轻松松把它们从皿里“请”出来。

接下来，咱们需要把细胞分到新的培养皿里，再给它们加上新鲜的培养基，确保它们能继续健康成长。

注意，细胞们需要一点时间适应新环境，就像搬家后要习惯新居的味道一样。