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GeneXpert MTB/RIF检测结核性脑膜炎患者脑脊液标本的临床应用价值作者：许超陈宇李巧思朱雅娟来源：《中国现代医生》2021年第28期[摘要] 目的探讨GeneXpert MTB/RIF（以下简称“GeneXpert”）检测结核性脑膜炎患者的脑脊液应用价值。
方法选取2014年12月至2019年12月在沈阳市第十人民医院住院治疗的初诊为结核性脑膜炎患者120例作为研究对象，收集患者的脑脊液标本，进行脑脊液抗酸杆菌涂片检测、脑脊液结核分枝杆菌960培养及脑脊液GeneXpert检测，分析GeneXpert的检测效能。
结果脑脊液抗酸杆菌检测阳性9例，阴性111例;脑脊液结核分枝杆菌960培养阳性40例，阴性80例;脑脊液GeneXpert检测阳性39例，阴性81例。
以脑脊液涂片为标准，GeneXpert检测的灵敏度及特异度分别为100.00%和72.97%;以脑脊液960培养为标准，GeneXpert检测的灵敏度及特异度分别为97.50%和100.00%;以临床诊断为标准，GeneXpert检测的灵敏度及特异度分别为95.12%和100.00%。
结论脑脊液GeneXpert检测灵敏度和特异度较高、检测时间短，有利于临床早期诊断结核性脑膜炎。
[关键词] 核酸扩增技术;结核性脑膜炎;脑脊液;分子生物学[中图分类号] R378.91 [文献标识码] B [文章編号] 1673-9701（2021）28-0134-04Clinical application value of GeneXpert MTB/RIF in detecting cerebrospinal fluid samples from patients with tuberculous meningitisXU Chao CHEN Yu LI Qiaosi ZHU YajuanDepartment of Tuberculosis， Shenyang Tenth People's Hospital， Shenyang 110044， China[Abstract] Objective To investigate the value of GeneXpert MTB/RIF（hereinafter referred to as"GeneXpert"） in detecting cerebrospinal fluid （CSF） in patients with tuberculous meningitis. Methods A total of 120 newly diagnosed tuberculous meningitis patients hospitalized in Shenyang Tenth People's Hospital from December 2014 to December 2019 were selected as the study subjects. Cerebrospinal fluid samples were collected for cerebrospinal fluid acid-fast bacilli smear detection，cerebrospinal fluid Mycobacterium tuberculosis 960 culture and cerebrospinal fluid GeneXpert detection. The detection efficacy of GeneXpert was analyzed. Results 9 cases were positive， and 111 cases were negative for acid-fast bacilli. Forty cases were positive， and 80 cases were negative for Mycobacterium tuberculosis 960 culture. Thirty-nine cases were positive， and 81 cases were negative for the GeneXpert test. Using cerebrospinal fluid smear as the standard， the sensitivity and specificity of GeneXpert detection were 100.00% and 72.97%， respectively. Using cerebrospinalfluid 960 culture as the standard， the sensitivity and specificity of GeneXpert detection were 97.50% and 100.00%， respectively. And using clinical diagnosis as the standard， the sensitivity and specificity of GeneXpert detection were 95.12% and 100.00%， respectively. Conclusion The GeneXpert detection in cerebrospinal fluid has high sensitivity and specificity， and a short detection time， which is helpful for early clinical diagnosis of tuberculous meningitis.[Key words] Nucleic acid amplification technology; Tuberculous meningitis; Cerebrospinal fluid; Molecular biology结核性脑膜炎（以下简称“结脑”）是结核分枝杆菌引起的脑膜非化脓性炎症，是由结核菌经直接蔓延或血液循环侵入神经系统的蛛网膜下间隙所致。
64生垦塞厦匿型垫!Q生!Q旦筮!!鲞筮!Q塑型壁塑!!!壁坚望型坚墅鲤!型幽堕堕Q!!：垫!Q：Y!!：!!：塑!：垫骨水泥，选择匹配假体置入。
将切断的外旋肌群复位缝合固定，确保髋关节稳定，引流管放入关节腔内。
1．4术后护理：下肢保持外展中立位或伤肢踝套牵引制动，膝下垫棉托。
观察引流管及引流血量，应用低分子肝素钙针7—10d。
抗生素应用。
心电监护，注意心、脑、肺部情况变化，合并有内科疾病患者应协同治疗。
术后第2天拔除引流管，第3天被动活动髋关节，可半靠坐至坐起，2周后可下床站立，适当活动。
3周可行走活动练习。
2结果本组人工假体置换38例，随访9个月～5年，平均2年。
其中2例术后1周突发脑梗死转神经内科治疗，1例患肺炎转呼吸内科治疗，l例术后1年出现假体周围骨折，经牵引夹板固定痊愈。
随访病例未发现脱位、假体松动。
按H ar r i s评分标准：优26例，良8例，可4例，优良率达89．9％。
3讨论老年性股骨粗隆间C型骨折，常规采用手术切开复位钢板内固定治疗。
因其骨折粉碎、移位明显，手术中复位困难，固定不牢，创伤大、出血多，手术时间长，功能恢复欠佳，加之老年人合并症多，伴有不同程度的骨质疏松，处理起来非常棘手，且后遗症大，严重影响患者的生活质培。
笔者在治疗过程中，试用人工股骨假体置换的方法，收到良好的效果。
3．1确定股骨距的长度：对于股骨小转子粉碎性骨折，应仔细将粉碎性骨片对合复位，确定需要保留的长度，进行修整。
若无法对位者，应将周边组织充分暴露清楚，棉纱垫包裹，粉碎块摆在原位上，骨水泥充填可固定粘合骨碎片，以恢复股骨近端压力侧的解剖关系，坚强的支撑以传导载荷应力，防止下沉，满足人体的生物力学需要¨】。
股骨大转子的粉碎者以同样的方法复位、对合，便于观察假体安放时的高度，防止短缩、旋转等后遗症，增加人工股骨假体柄的稳定性。
3．2确定股骨假体前倾角：假体安装前一定要辨清安放位置，避免放置错误。
结核病血清学诊断进展结核病的细菌学检查目前是结核病实验室诊断的金标准。
由于痰涂片阳性率较低，镜检需要经验，难以区分环境分枝杆菌造成的假阳性；痰培养需时太长，因此细菌学检查对结核病的诊断价值有限。
随着分子生物学技术的迅速发展，用高度敏感的方法检测结核菌及其特异性DNA 片段，如PCR、生物探针和基因芯片等，需要相应的检测设备和检测费用高未能广泛推广。
血清学诊断技术有其固有的优势，如操作简便、快速、便于推广、无需特殊精密仪器，已有多种纯化的特异性抗原可采用，可以发展成自动化检测，尤其是对痰培养阴性和肺外结核病有较为重要的辅助诊断价值，受到广泛的重视。
本文从靶抗原的选择和检测技术的改进等方面综述了结核病血清学诊断的现状和进展。
抗原的选择特异性的抗原是提高血清学检测敏感性、特异性的重要环节。
应用于血清学诊断的理想抗原应具有种的特异性及强的免疫原性。
尤其是结核分枝杆菌全基因组序列测定以后，单克隆抗体、分子生物学、蛋白质组学和比较基因组学等技术的应用，已获得多种纯化和特异性的诊断抗原。
现将当前最受关注的抗原及其临床评估结果归纳如下：1.脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)抗原 脂阿拉伯甘露聚糖是分枝杆菌细胞壁的重要组成部分，是属特异性抗原，具有较强的免疫原性和免疫调节功能，可刺激机体产生相应的抗体，因而是结核病的血清学诊断应用较广的抗原。
有关LAM抗原的应用报道很多, Antunes等用美国生产的结明(MycoDot TM)试剂盒检测活动性肺结核病人的敏感性为63.0%，特异性为92.4%，认为检测LAM抗体是结核病一项有效的辅助诊断方法。
2.A60(antigen 60) A60是从牛分枝杆菌胞浆中提取的一种大分子物质，是脂质蛋白和多糖的复合抗原。
Wu等用ELISA法检测了178例活动性肺结核患者和151例其他疾病患者血清中的IgG A60，根据受试者工作特性曲线(ROC)取261.2单位为截切值(cutoff point)，其敏感性和特异性分别为49.4%和79.5%，认为胸部X片异常的患者结合IgG A60阳性将有助于肺结核病的准确临床诊断。
脑膜炎鉴别诊断：四种类型关键解析在神经内科疾病中，脑膜炎是一种较为常见的疾病。
然而，脑膜炎的诊断并非易事，需要与其他疾病进行鉴别。
本文将结合四种典型脑膜炎病例，分析其鉴别诊断的关键点。
病例一：病毒性脑膜炎与细菌性脑膜炎的鉴别患者，男性，12岁。
发热、头痛、恶心、呕吐3天，意识模糊1天。
查体：体温39℃，神志不清，颈抵抗阳性，克氏征阳性。
脑脊液：压力250mmH2O，白细胞计数500×106/L，蛋白含量轻度升高。
初步诊断：病毒性脑膜炎？细菌性脑膜炎？鉴别诊断关键：1. 病程进展速度；2. 脑脊液中白细胞计数及分类；3. 病原体检测。
分析：病毒性脑膜炎通常病程较短，病程进展迅速。
脑脊液中白细胞计数轻度升高，以淋巴细胞为主。
细菌性脑膜炎病程较长，病程进展较慢。
脑脊液中白细胞计数显著升高，以中性粒细胞为主。
病原体检测也是鉴别病毒性脑膜炎与细菌性脑膜炎的重要手段。
最终诊断：病毒性脑膜炎。
病例二：结核性脑膜炎与病毒性脑膜炎的鉴别患者，女性，25岁。
发热、头痛、盗汗、体重下降1个月，意识模糊3天。
查体：体温38.5℃，神志不清，颈抵抗阳性，克氏征阳性。
脑脊液：压力200mmH2O，白细胞计数300×106/L，蛋白含量轻度升高。
初步诊断：结核性脑膜炎？病毒性脑膜炎？鉴别诊断关键：1. 病程长短；2. 脑脊液中淋巴细胞比例；3. 抗酸染色及真菌培养。
分析：结核性脑膜炎病程较长，病程进展缓慢。
脑脊液中淋巴细胞比例较高。
病毒性脑膜炎病程较短，病程进展迅速。
脑脊液中淋巴细胞比例较低。
抗酸染色及真菌培养有助于鉴别结核性脑膜炎与病毒性脑膜炎。
最终诊断：结核性脑膜炎。
病例三：化脓性脑膜炎与病毒性脑膜炎的鉴别患者，男性，5岁。
发热、头痛、呕吐、意识模糊1天。
查体：体温39℃，神志不清，颈抵抗阳性，克氏征阳性。
脑脊液：压力300mmH2O，白细胞计数1000×106/L，蛋白含量显著升高。
初步诊断：化脓性脑膜炎？病毒性脑膜炎？鉴别诊断关键：1. 脑脊液中白细胞计数及分类；2. 病原体检测；3. 细菌培养及抗生素敏感试验。
结核性脑膜炎脑脊液腺苷脱氨酶检测的临床意义及应用分析【摘要】目的：探讨结核性脑膜炎脑脊液腺苷脱氨酶检测的临床意义及应用分析，为早期患者治疗提供参考意见。
方法：对50例结核性脑膜炎患者采用酶显色法检测，48例化脓性脑膜炎患者以及52例病毒性脑膜炎腺苷脱氨酶水平。
结果：结核性脑膜炎组、化脓性脑膜炎组、病毒性脑膜炎腺苷脱氨酶水平分别是（16.51±6.53）、（5.62±2.57）、（3.25±1.3）u/l；结核性脑膜炎脑脊液腺苷脱氨酶水平明显低于患者入院初期的水平，差异具有统计学意义（p<0.05）；在不断的治疗过程中，腺苷脱氨酶水平也随之不断下降（p<0.05）。
结论：脑脊液中的腺苷脱氨酶检测有利于结核性脑膜炎的提早发现和鉴别诊治，进行动态监测可以对治疗的效果进行正确的评估，为临床治疗提出了指导意见。
【关键词】结核性脑膜炎；脑脊液；腺苷脱氨酶结核性脑膜炎是由结核分枝杆菌引起的中枢神经系统的炎症，在结核病中占6%，近些年的发病率和死亡率明显增加，人们将研究的重点放到了结核性脑膜炎的早期诊断、鉴别诊断以及指导临床治疗上。
腺苷脱氨酶和机体细胞的免疫功能联系密切，而结核分枝杆菌的感染会致使腺苷脱氨酶升高[1]。
本文对50例结核性脑膜炎患者、48例化脓性脑膜炎患者以及52例病毒性脑膜炎患者脑脊液中腺苷脱氨酶进行检测并分析，仔细观察治疗中的变化情况并做详细记录，现将记录情况报道如下。
1 资料与方法1.1一般资料选择50例结核性脑膜炎患者，其中男25例，女25例，年龄在24岁与68岁之间，平均年龄（46.7±12.1）岁。
脑脊液检测到结核分枝杆菌，其他的真菌、细菌、肿瘤细胞学检查的结果都为阴性。
选择48例化脓性脑膜炎患者，其中男28例，女20例，年龄在21岁与71岁之间，平均年龄（49.4±13.4）岁。
脑脊液细菌培养为阳性，涂片找到的细菌或见白细胞增多，以多形核白细胞为主，经过细胞学的检测没有发现结核分枝杆菌、肿瘤细胞以及真菌。
脑脊液检测在结核性脑膜炎早期诊断中的研究进展王赛赛马艳刘洋结核性脑膜炎(tuberculous meningitis,TBM)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)引起的以脑膜为主的非化脓性炎性疾病。
虽然TBM仅占结核病的1%左右⑴，但却是结核感染最严重的表现形式，具有较高的发病率和死亡率⑷。
由于TBM早期症状不典型，误诊率多在30%左右⑷，常被误诊为化脓性脑膜炎、新型隐球菌性脑膜炎(cryptococcul neoformans meningitis, CNM)和病毒性脑膜炎(viral meningitis,VM)等，导致早期诊断困难，延误治疗，显著降低患者预后质量。
有研究表明，50%的TBM患者最终导致死亡或遗留严重的神经系统后遗症"，多发生在起病的6个月内巴认为与诊断和治疗的延迟有关⑶。
故早期诊断及鉴别诊断TBM并及时行抗结核药物治疗，对减少并发症、提高治愈率、降低死亡率有重要意义。
目前的诊断方法主要基于脑脊液(cerebrospinal fluid,CSF)MTB细胞学的检测及MTB侵入机体后CSF发生的一系列生物化学和微生物学变化，是诊断TBM的基础。
因此，笔者通过整理近年来检测CSF方法的文献，进行分类综述与总结，为早期诊断与鉴别诊断TBM提供理论依据。
1TBM的早期诊断1.1CSF细菌学检测1.1.1抗酸杆菌涂片镜检：抗酸杆菌涂片镜检是实验室诊断的基础，具有操作简单、价格低廉、报告结果快等优点。
最早由埃利希(Ehrlich堆1882年发明，但诊断MTB的准确性并不理想；改进后的齐尔-尼尔森染色法(Ziehl-Neelsen染色法，Z-N染色)虽阳性检出率仅提高至10%~20%同，但仍在临床中广泛应用。
有研究表明，该染色法检测TBM患者的CSF时，需每毫升CSF中至少有5000〜50000个MTB(71,且标本量约为10-15ml,但由于MTB致病机制的特殊性，CSF含菌量平均每毫升仅10个左右冈，远远不能满足检测的需要，导致其诊断的准确性较差。
为提高涂片镜检的敏感度，研究人员不断优化标本采集程序、标本加工和显微镜技术等但因标本采集及加工的局限，显微镜的改进成为研究重点。
荧光显微镜是Z-N染色的标准诊断方法，与传统的Z-N染色相比，不但可提高敏感度(痰液检测时约提高10%),还可减少检测时间；发光二极管荧光显微镜(light-emitting diode fluor escence microscopy,LED-FM)因在结核病各标本中的检测敏感度高于常规荧光显微镜，且较氟化铮染料(金胺-O或金胺-罗丹明)的荧光显微镜更为便宜而应用广泛叶⑴，但在肺外结核样本中的准确度还需进一步验证［l21o1.1.2MTB培养：CSF标本中MTB的培养已成为确诊TBM、判断新开发检测方法的可行性和诊断价值的金标准。
CSF培养较抗酸杆菌涂片镜检更为敏感，是目前诊断TBM特异度(100%)最高的方法口；但与CSF涂片镜检一样受CSF中MTB含菌量少，以及培养耗时长、需要3级生物安全实验室、敏感度低等影响，对TBM的早期诊断价值受限。
其主要培养方式有固体培养和液体培养，传统的固体培养方法因4〜8周的培养时间而失去早期诊断意义;而近年来的液体培养方法，如BACTEC MGIT960系统、BACTEC TB460系统、MB/BacT系统和ESP 系统n等，虽较传统培养法可以明显缩短培养时间基金项目："十三五"国家科技重大专项(2017ZX10201301-004)；北京市医院管理局"登峰"人才培养计划(DFL20181601)作者单位：101149首都医科大学附属北京胸科医院北京市结核病胸部肿瘤研究所流行病学研究室(王赛赛、刘洋)；北京市结核病胸部肿瘤研究所中国疾病预防控制中心结核病防治临床中心(马艳)通信作者：刘洋，Email:lygyll973@(至少lOd),且敏感度达到16%-51%，但仍不足以满足早期诊断⑷。
2011年WHO推荐的显微镜观察药物敏感性技术(microscopic observation drug susceptibility,MODS)1141是2000年Caviedes等建立的一种MTB实验室快速诊断和耐药性测定技术,仅需1周即可获得MTB培养及耐药性检测结果，快于商业固体或液体培养基问，敏感度可达65%网,在缩短检测时间、降低检测成本上具有优势[15-161,但因受无菌实验室条件的影响,目前仅应用于TBM 患者的药物敏感性分析切。
1.2分子生物学检测技术1.2.1聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR):核酸扩增技术(nucleic acid amplification tests,NAAT)因可以检测到少于10个微生物的标本而被用于临床标本或培养中识别MTB[18],并于1990年首次采用CSF标本诊断TBM1'91,由此产生的多种PCR检测方法因快速、敏感度和特异度高而在TBM诊断应用方面具有较广阔的前景。
常规PCR 对MTB检测的敏感度为31%-100%,特异度为66%〜100%⑷；但因该法只能定性检测及扩增产物易受污染的原因而改进为实时荧光定量PCR(realtime fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)、多重PCR(multiplex polymerase chain reaction,mPCR)、巢式PCR(nested PCR)等方法。
FQ-PCR是美国食品药品监督管理局(Food and Durg Administration,FDA)承认并推崇的诊断技术，具有缩短操作及检测时间、定量检测、降低交叉感染风险的自动化检测优点列。
相较于CSF涂片镜检、固体培养和液体培养，具有较高的敏感度与特异度凹。
de Almeida等⑷的研究还显示了当循环阈值截断值(cut-off•值)<39.5时可提高FQ-PCR检测CSF样本中MTB的诊断性能，提示将传统的微生物检测和临床算法相结合可提高其诊断价值。
最新研究评估了4种DNA提取方法(苯酚-氯仿-硫氤酸酯肌、硅胶-硫氧酸肌、树脂、乙醇树脂)及FQ-PCR扩增的3种靶点(IS6110、MPB64、hsp65KDa)对诊断TBM的价值，结果表明苯酚-氯仿-硫氤酸酯弧的提取方法联合IS6110靶点检测的效果最佳(敏感度为100%、特异度为98%)[24],提示可通过最佳提取DNA和特异性靶点相结合检测以提高FQ-PCR对TBM的诊断准确度；但对于缺乏某一靶点的MTB菌株则难以检测出来，因此mPCR 技术显得尤为重要。
mPCR通过在同一反应体系里加入2对及2对以上的引物实现对多个核酸片段的扩增，在提高通量、保持高特异度和高敏感度的同时能大大降低成本、节省样本，更加简单、快速和高效。
其诊断TBM价值高于CSF涂片镜检和培养㈤，敏感度高于单相PCR0多项研究已证明，多引物联合的mPCR诊断TBM较单相PCR更有价值场27]。
当采用IS6110和16S rDNA序列对TBM与细菌性脑膜炎(bacterial meningitis,BM)进行诊断及鉴别诊断时，其阳性率为100%、特异度为96.5%[28]o然而，因mPCR的敏感度受到待测标本数量的影响1291,及对实验操作人员专业水平的高要求而难以在临床中广泛开展。
巢式PCR是使用2对PCR引物进行2个周期PCR反应的技术，第1对PCR扩增片段与普通PCR 相似，第2对为结合在第1次PCR产物内部的巢式引物，可减少非特异性扩增造成的污染。
其DNA扩增的敏感度和特异度明显高于传统的单步PCR。
】；诊断TBM的敏感度高于CSF涂片镜检、罗氏固体(L-J)和BacT/ALERT培养汕。
但由于巢式PCR 有较高的假阴性和假阳性率，不能作为启动或终止TBM治疗的标准，需结合临床表现、影像学及细胞学和微生物学检查结果综合判断X。
近年来，该技术与FQ-PCR和mPCR等相结合，均取得较好的临床诊断结果[X321O1.2.2环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP):LAMP技术是2000年日本学者Notomi等[33]发明的一种新的核酸体外扩增技术，可以在恒定温度下单支试管中扩增DNA,避免T PCR的热循环，使其更适合于资源有限的环境[3410与PCR相比，检测MTB的下限提高了10倍驹，更适用于含菌量较低的标本检测；与FQ-PCR相比，尽管检测MTB的敏感度相当，但检测时间仅lh,且无需昂贵的检测仪器跑。
在LAMP首次应用于TBM诊断的研究中发现，以插入序列IS6110设计的6条引物诊断TBM的敏感度(88.23%)和特异度(80%)优于巢式PCR(分别为52.9%和90%)、CSF涂片镜检和培养*37】。
最新的Meta分析也证实TLAMP诊断肺外结核的准确性，且该技术操作简单，对于缺乏经验的实验技术人员培训后即可开展实验t381o1.2.3线性探针技术(line-probe assays,LPAs): LPAs是基于mPCR原理，并将PCR扩增、反向杂交、膜显色技术合为一体的快速诊断结核病及药物耐药性的实验方法。
具体包括分子线性探针法(INNO-LPA)、Geno-type MTBDR分子线性探针法、自身免疫性诊断MTB耐药分子线性探针法(the autoimmun diagnostika TB resistance line probe assay,AIDLPA)和反向杂交MTB耐药分子线性探针法(the REBA MTB-rifa@assay,REBA-LPA)1391,四类方法检测MTB及其耐药的效果相当问。
2008年WHO正式推荐使用LPAs检测肺外结核标本的，但不同研究对于TBM诊断的结果相差较大厲阿，这可能是CSF 标本含菌量较低、目的基因扩增量少和DNA提取过程易受外界影响等原因造成。
同时LPAs还存在操作复杂、价格昂贵、探针有限、需要专用PCR空间降低污染的风险，以及污染问题的处理比较棘手、需要适当的基础设施及技术熟练的实验员等问题，其早期诊断的价值有待进一步研究。
1.2.4GeneXpert MTB/RIF检测技术(简称"GeneXpert"):GeneXpert是一项全自动半巢式FQ-PCR体外诊断技术，只需2h即可同时实现MTB 定性和利福平(RFP)耐药性检测妙，与传统培养方法有相似或更高的收益，报告结果更快，更适用于早期诊断跑。
2013年WHO用于成年人和儿童肺外结核及疑似TBM患者的CSF检测诊断(471o但因研究数据质量较低⑷闌、阳性预测值和阴性预测值较低"呦，以及需CSF标本量大等原因使得GeneXpert对TBM的诊断价值有所不同，需要重新评估。
