α-淀粉酶的发酵、提取和参考PPT

α-淀粉酶在结构上的相似性使人们相信它们具有相似的 催化机制。McCarter、Davies均提出α-淀粉酶的催化过 程包括三步，共发生2次置换反应。第一步，底物某个 糖残基要先结合在酶活性部位的-1亚结合位点，该糖基 氧原子被充当质子供体的酸性氨基酸(如Glu)所质子化;第 二步，-1亚结合位点的另一亲核氨基酸(如Asp)对糖残基 的Cl碳原子进行亲核攻击，与底物形成共价中间物，同 C 时裂解Cl-OR键，置换出底物的糖基配基部分;第三步， 糖基配基离去之后，水分子被激活(可能正是被刚去质 子化的Glu所激活)，这个水分子再将Asp的亲核氧与糖残 基的C1之间的共价键Cl-Asp水解掉，置换出酶分子的Asp 残基，水解反应完成。在第二次置换反应中，如果进攻 基团不是水分子，而是一个带有游离羟基的糖(寡 糖)ROH，那么酶分子的Asp残基被置换出后，就发生了 糖基转移反应而非水解反应。
在米曲霉的Taka-淀粉酶A(TAA)中，在活性部 位发现有三个酸性氨基酸残基，Asp206， Glu230，Asp 297，定点突变研究发现它们 是催化所必需的氨基酸。研究发现TAA中这 三个催化所必需的氨基酸在其它的α-淀粉酶 以至于α-淀粉酶家族中也是共有的。
Tonozaka(1993)通过对不同来源的37个α-淀粉酶基因分支酶基因，异 淀粉酶基因等进行同源序列的比较，微生物与动物和植物产生的α-淀 粉酶的氨基酸序列之间的同源性不超过10%，但发现这些淀粉酶有 ABCD四个区域有高度的保守性，推测这些保守区域与其底物的结合 或催化中心有关。 尽管不同来源的α-淀粉酶在氨基酸序列上是不同的，但它们却共同拥 有相同的基本次级结构，如(β/α)8结构(亦称之为TIM－桶)——由8个螺 旋包围8个β-折叠组成的筒状结构。该结构被认为具有催化能力的结 构。 YJanec k，S.通过对α-淀粉酶家族研究发现大部分α-淀粉酶除了含有 八个(β/α)桶状结构的催化中心(domain A)外，还包括domains B、C和 D。其中domain B具有三个β折叠和三个α螺旋，长度和结构随来源的 不同而变化。Domain C区是催化区域后面的区域，主要由β折叠组成， 该区被认为有保护催化中心疏水氨基酸的稳定性的作用。 另外，有一些α-淀粉酶包含一个没有催化功能的淀粉结合位点(starchbinding domain)。 此外，几乎所有α-淀粉酶都是金属酶，每个酶分子至少含有一个钙离 子，钙离子使酶分子保持适当的构象，从而维持其最大的活性和稳定 性。

α- 淀 粉 酶 的 分 离 方 法 的 比 较 α-淀粉酶在食品工业上有着广泛的用途。目前工 淀粉酶在食品工业上有着广泛的用途。 淀粉酶在食品工业上有着广泛的用途 业上从发酵液中提取α淀粉酶的方法多 淀粉酶的方法多。 业上从发酵液中提取 淀粉酶的方法多。 主要有直接用硫酸铵沉淀和采用絮凝-超滤 超滤-乙醇 主要有直接用硫酸铵沉淀和采用絮凝 超滤 乙醇 沉淀方法 。 种方法食品工业上不能使用。 第一 种方法食品工业上不能使用。 第二种方法要求发酵液澄清度好， 第二种方法要求发酵液澄清度好，否则超滤膜堵 此外超滤法浓缩酶液是有限度的， 塞， 此外超滤法浓缩酶液是有限度的，沉淀仍消 耗大量的乙醇同时酶的回收率也较低一般在55%左 耗大量的乙醇同时酶的回收率也较低一般在 左 右。 为了提高产品的活性,酶活性的回收和减少乙醇的 为了提高产品的活性 酶活性的回收和减少乙醇的 用量已有相关报道用大孔吸附树脂吸附的方法分 离纯化α- 淀粉酶 。在此进一步改进了洗脱方式， 离纯化 在此进一步改进了洗脱方式， 使其更便于工业化生产， 使其更便于工业化生产，使用离子交换的方法进 一步纯化α- 淀粉酶。 淀粉酶。 一步纯化
吸附树脂法发酵液cacl加水溶解加入絮凝剂搅拌压滤收集滤液滤液中加入吸附树脂过滤弃去滤液收集吸附树脂收集滤液40的乙醇过滤5乙醇成品收集沉淀沉淀无水乙醇洗脱ph为650005mollph为6502mollph为6505moll反复洗涤de32处理好的de32转入烧杯过夜制3cm4cm的层析柱2mlmin的流速平衡2h2mlmin洗脱酶液得洗脱峰1收集洗脱液测酶活性2mlmin洗脱酶液得洗脱峰2收集洗脱液测酶活性称取树脂吸附淀粉酶1g10ml注意
出峰图
注意！！！
–N,N’-亚甲双丙烯酰胺为神经毒性物质，可经 皮肤直接吸收，使用时应避免其直接接触皮 肤，必要时应戴手套。但其凝固后就变成无 毒物质。沉淀α-淀粉酶过夜 α

产α-淀粉酶菌株产酶培养 基组成优化正交试验ppt 课件
• 引言 • 材料与方法 • 结果与分析 • 讨论与结论 • 参考文献
01
引言
背景介绍
01
介绍产α-淀粉酶菌株在食品、饲料、 生物能源等领域的应用价值。
02
阐述当前产α-淀粉酶菌株产酶水平 较低的问题，强调优化培养基组成 对提高产酶量的重要性。
够更好地促进菌株生长和酶产量。
优化方案确定确定最佳营Fra bibliotek成分组合完善培养基配方
根据正交试验结果，确定最佳的营养 成分组合，以提高菌株的生长和α-淀 粉酶的产量。
根据优化方案的结果，进一步完善培 养基配方，以提高α-淀粉酶的生产效 率和经济效益。
验证优化方案
通过实验验证优化方案的可行性，确 保其在实际生产中具有可重复性和可 扩展性。
试验器材
摇床、分光光度计、pH计、离心机 等。
试验方法
菌种活化
将保存的菌种进行活化，恢复其活性。
种子培养
将活化后的菌种接种至种子培养基中，在 适宜的温度和pH条件下进行培养，获得对 数生长期的种子。
产酶培养
数据处理
将种子按一定比例接种至不同配方的产酶 培养基中，在相同的条件下进行培养，测 定不同培养基的酶活性和菌体生长情况。
参考文献2
正交试验设计在微生物培养基优化中的应用
参考文献3
产酶菌株培养基优化对酶活性的影响研究
THANKS
感谢观看
酶活性测定
在优化过程中，需要建立可靠的酶活性测 定方法，以便准确测定菌株产酶的能力和 水平。
结论
最佳培养基组成
通过正交试验，可以确定 最佳的培养基组成，从而 提高菌株的产酶能力。
最佳培养条件

a-淀粉酶的发酵生产工艺扌商要：a•淀粉酶广泛分布于动物、植物和微生物中，能水解淀粉产生糊精、麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等，是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一。

目前，a•淀粉酶已广泛应用于变性淀粉及淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、酒精工业、发酵以及纺织等许多行业。

1•菌种的选育1. 1细菌的分离与初步鉴定：将土壤系列稀释，把10乞10-\10腐分别涂布到淀粉培养基上，27C倒置培养2天，将长出的菌落接入斜面。

将细菌从斜面接种到淀粉培养基培养2天，用碘液染色，记录透明圈大小和菌落直径，计算D/d值。

保菌供下次实验用。

1. 2紫外线诱变育种：取活化后的菌种配成菌悬液、稀释；倒淀粉培养基平板，将菌悬液涂布其表面；用紫外线处理平板0、2min.4min.6min、8min.10min,每个处理2次重复；放到黑暗中倒置培养，37C培养48h,分别计•数诱变组和对照组平板上的菌落数，并计算致死率；加入碘液，分别测量诱变组和对照组菌落的透明圈直径和菌落直径，计算D/d值；将D/d值最大的菌种保存到斜面培养基上。

1.3诱变方法以及变异菌株的筛选①诱变出发菌株在完全培养基中培养至对数生长期后期。

②以NTG为诱变剂，按一定处理剂量（包/ml）,在一定pH值的缓冲液中30T恒温振荡处理1~4h°③经高速离心分离，移植于液体完全培养基进行后培养。

④经稀释涂布在含有1%淀粉BY固体培养基上，经24h培养形成小菌落。

⑤把单菌落分别移植于含2%淀粉B丫液体培养基中，30E培养36ho⑥用2#定性滤纸制成5mmdisc（小圆纸片），并用2%琼脂BY培养基灭菌后加入较大剂量青霉素（抑菌）。

倒入200mmx300mm长方形不锈钢玻璃培养皿中，冷却凝固。

然后把5mmdisc纸顺序放在培养基表面。

⑦用微量注射器分别吸取培养液，移植到相应的disc上。

把disc培养皿经37C,24h分别培养。

⑧把KI-I2液用喷雾器均匀分布在disc培养皿培养基的表面上，并挑出淀粉水解圈大的disc,用相对应的1ml培养液接种摇瓶，进行发酵测定酶活力。