?综述?
作者单位:300192 天津,中国医学科学院放射医学研究所
DNA 同源重组修复的分子机制
王勇 樊飞跃
电离辐射直接造成生物靶分子细胞DNA 的损伤,DNA 的损伤类型很多,其中以DNA 双链断裂(double strand break ,
DS B )最为严重。DNA DS B 的修复较其他类型的DNA 损伤更
加困难,不修复则可能导致染色体断裂和细胞死亡,而修复不当则可能导致染色体缺失、重排、转位和倒置等,从而易于形成肿瘤等疾病[1]。DNA 损伤的不完全修复可导致基因组不稳定,机体细胞为了对抗损伤,发展出多个修复系统来保证基因组的完整性,同源重组修复(hom olog ous recombination
repair ,HRR )是DNA DS B 损伤修复的主要方式,对于保持哺乳
动物细胞的基因组完整性十分重要[2]。重组即遗传物质的重排,同源重组是指发生在同源DNA 序列间的重组,主要是利用DNA 序列间的同源性来识别,而负责配对和重组的蛋白质因子并无碱基序列特异性。
本文综述了国外近来对HRR 分子机制的研究进展,包括引发HRR 的DNA 损伤机制;HRR 的基本修复过程和多条修复通路;HRR 关键分子重要功能的实现机制;HRR 与细胞周期调控等其他事件的相互关系;辐射和HRR 及其与肿瘤之间的关系。
11DNA 损伤的感受识别:HRR 参与的蛋白质有RAD51,RAD51b ,c ,d ,RAD52,RAD54,BRC A1,BRC A2,XRCC2,XRCC3
和MRN 复合物等,另外还需大量起始和损伤应激感受分子,包括AT M ,ATR 和DNA 2PK cs [3]。
细胞在受到电离辐射照射后,一系列重组或修复蛋白及复合物重新定位形成核焦点,以应答DNA 损伤。这些蛋白有γ2H2AX ,AT M ,RAD51,BRC A1,BRC A2,NBS1,RPA 和
MRN ,它们相互作用,完成DNA 损伤信号的接受功能并转导
信号给其他蛋白质,介导并协调包括周期检控点、凋亡、修复的损伤应答。在电离辐射引起的DS B 损伤应答中AT M 是最有可能的感受分子,它属于三磷酸肌醇激酶样激酶(PIKK )家族成员(如AT M 、ATR 、DNA 2PK ),都具有磷酸化谷氨酰氨酸残基后的丝或苏氨酸残基的激酶活性。AT M 以二或多聚体非活化形式储存于未受损伤的细胞,DNA 损伤后AT M 通过自我磷酸化,解离二聚体释放出AT M 对其他分子磷酸化的结构域。活化的AT M 可磷酸化组蛋白H2AX 的139位丝氨酸残基,M DC1ΠNF BD1的俩末端BRCT 结构域,BRC A1的1189,
1542和1524位丝氨酸残基
[4]
。在磷酸化M DC1ΠNF BD1促进
下,DNA 损伤后1～3min ,最先定位于DS B 2Mbp 左右区域内的蛋白之一H2AX 就被磷酸化为γ2H2AX ,磷酸化组蛋白可使染色体的部分结构改变,释放出损伤位点的DNA ,并以其为
装配中心继续募集MRN 、BRC A1等其他因子形成大型复合物来监控基因组的损伤[5]。
21HRR 的起始:在AT M 介导的H2AX 磷酸化波之后,活
化的AT M 与DS B DNA 结合,进而磷酸化结合至γ2H2AX 核焦点的53BP1、NBS1,随后RAD502MRE11复合物由MRE11结合到NBS1,完成定位于DS Bs MRN 复合物的装配,同时BRC A1也结合至损伤位点的53BP1。很可能由具有内切酶和外切酶活性的MRN 复合物发挥5′23′外切酶活性切割DNA 断裂末端,同时MRN 也参与从DS B 到下游DNA 应答蛋白的信号转导。由于NBS1只是3′25′而不是5′23′外切酶活性,故需其他核酸酶的协助切割DNA 来提供DNA 配对和链交换所必需的
3′ssDNA 突出。MRE11定位于细胞核内,Mn 2+
为辅因子,亚基
参与构成RAD50复合物,有单链内切酶活性和双链特异性
3′25′外切酶活性。RAD50有ATPase 活性的头部球状结构域,
使得DNA 结合具有ATP 依赖性,而其高度柔性的分子卷曲尾部,就像是从核心蛋白向外伸出的长臂,可以较大倍率的易化两DS B 末端互寻,进而桥接两个断裂末端[6]。之后由人复制蛋白A (RPA )与突出末端结合以保护并去除其二级结构。RPA 是由14、32和70kDa 3亚基组成稳定的异质三聚体,与ssDNA 结合,是DNA 复制、重组和修复的必需蛋白。
31链侵入和修复性合成:E .coli 的RecA 的真核细胞同
源物RAD51代替RPA 在ssDNA 区域形成核蛋白纤维,催化同源序列的寻找、链配对和链交换。这是一个需要同源序列的RAD51依赖性链侵入机制。RAD51催化重组中的分子间稳定的联会配对包括:RAD51核蛋白纤维同源双螺旋DNA
DS B 被加工的单链末端链侵入成为同源dsDNA ,核蛋白纤维
的ssDNA 和侵入DNA 双螺旋同源链之间的Wats on 2Crick 氢键作用导致随后的双螺旋非互补链的置换,最后形成含有异源双螺旋DNA 的D 环结构重组中间体。随着链交换的深入,重组中间体分岔结构向两边迁移的同时,以侵入中的DS B 加工后的3′末端作为引物,侵入双螺旋的互补链作为模板,进行修复性DNA 合成[7]。
RPA 参与链侵入,通过稳定ssDNA 和被置换来促进RAD51结合ssDNA 。RAD51属于RecA RAD51亚家族,可能定
位于核内,广泛参与普遍的DNA 损伤应答通路,结合单或双链DNA ,可显示DNA 依赖的ATPase 活性,Mg 2+和K +是辅因子[8]。RAD51同系物中RAD51D 的地位特殊,一旦缺失,人和大鼠细胞将不能增殖,小鼠在出生前就会死亡[9]。
参与DS B 的HRR 的RAD52以环状七聚体钳住DNA 链,募集RAD51结合到RPA 覆盖的ssDNA ,结合两者并协助
RAD51形成DNA 交换中间体,可将ssDNA 暴露于蛋白质表
面从而促进互补链间的退火配对[10]。BRC A2C末端结构域结合DSS1,中部BRC重复模体直接结合RAD51形成RAD512 BRC A22DSS1复合体,协同BRC A1相互作用,协助RAD51代替RPA定位环绕DNA双螺旋形成螺旋型核蛋白纤维。BRC A2的S3291残基被C DK磷酸化可能是调节RAD51活性的一种机制,在S期重组活性高时S3291低磷酸化促进BRC A2和RAD51的相互作用,高磷酸化时就会阻碍HRR[11]。免疫共沉淀显示体内BRC A1、BRC A2、RAD51和PC NA结合于DS B修复焦点,AT M直接磷酸化BRC A1,继而磷酸化RAD51。总之BRC A1、BRC A2在HRR早期相当重要,或许将修复和其他细胞过程联合起来。
XRCC2(Xray repair cross2complementing protein X射线修复交叉互补性蛋白)属于RecA RAD51亚家族,可结合HRR通路的dsDNA,亚基和RAD51D或间接与由RAD51C和D构成的BC DX2复合物作用,可结合ssDNA、双螺旋DNA的单链缺口,尤其是切口,缺失DNA时XRCC22RAD51D形成一个多聚环结构,存在ssDNA时形成纤维状结构[12]。XRCC3属于RecA RAD51亚家族,结合dsDNA参与HRR重组,亚基与RAD51和RAD51C作用,可促进Rad51介导的HRR,激活S期检控点以及影响凋亡[13]。
41H olliday联结的形成与解离:随着在加工过的DS B5′末端新DNA的合成,未知的连接酶将异源性DNA的交叉链中间体分子连接成H olliday联结,DNA聚合酶使链侵入位点形成的H olliday联结向两边分岔迁移,如果是沿复制方向将会形成一个超越原DS B位点的DNA末端,这个ssDNA末端将会与另一末端存在同源序列,可能由单链退火机制(SS A)修复:修复性合成延伸的链中新序列可从他们的互补双螺旋DNA解离,再与他们的原初互补链再退火,然后DNA合成填补再退火的DNA双螺旋的单链间隙完成修复[14]。除了释放侵入末端,第2个DNA末端可能侵入同一同源DNA分子而形成一双H olliday联结,再由未确定的酶切割H olliday结构导致姐妹染色体序列间的交互交换[15]。
在时空上都不是固定的基因组必须在为变异所要求的可变性和为遗传所要求的稳定性之间维持一个恰到好处的平衡,细胞每天必须完成的任务中最重要的或许就是保护它的基因组。很多的因素影响基因组的稳定性,如电离辐射导致细胞DNA复制错误、DS B、修复失败等[16]。HRR是电离辐射造成DNA双链断裂损伤的主要修复方式。然而,其他一些DNA损伤因子(例如烷化剂、重金属、络合剂、交联剂、紫外辐射等)即使不造成DNA双链断裂损伤,同样也可以诱导HR。这就提示人们,将来的研究方向之一就是HR如何识别与修复DS B外的DNA损伤。HR对于控制人类疾病有重要作用,HRR各个通路上的诸多因子的突变或功能改变都可能直接或间接的诱发肿瘤,例如具有多种重要功能的AT M、BRC A1、BRC A2、RAD51、BLM、WRN、P53等等和多种肿瘤密切相关。缺失某种HR蛋白质的病人易于患癌症或早老征,异常的HR常导致遗传重排,而双末端DS B的正常HRR产物可能导致的基因删除、基因转换或随机重复也能引发肿瘤[17]。深入研究修复因子如何参与人类最常见疾病中的衰老和肿瘤,给肿瘤的治疗提供了许多新靶点和新方法[18]。
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Nature.2005,434(7035):9132917.
(收稿日期:2005210218)
同源重组（Homologus Recombination) 是指发生在染色体之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合，同源重组需要一系列的酶催化。 !!!是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。 Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为： 片段重组体(patch recombinant) 拼接重组体(splice recombinant) 片段重组体： 切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。拼接重组体： 切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。 基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) ：应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子。 基因工程(genetic engineering) ：实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程。 工具酶功能 限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNA DNA连接酶催化DNA中相邻的5′磷酸基和3′羟基末端之间形成磷酸二酯键， 使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接 DNA聚合酶Ⅰ①合成双链cDNA分子或片段连接 ②缺口平移制作高比活探针 ③DNA序列分析 ④填补3′末端 Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的5'→3'聚合、 3'→5'外切活性，而无5'→3'外切活性。常用于cDNA第二链合成， 双链DNA 3'末端标记等 反转录酶①合成cDNA ②替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析 多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羟基末端磷酸化，或标记探针 末端转移酶在3′羟基末端进行同质多聚物加尾 碱性磷酸酶切除末端磷酸基 基因载体：
同源重组的分子机制 一、断裂重接模型（breakage joining model） C．D．Darlington 1936年提出。 在同源染色体联会时，由于染色体的缠绕而产生张力，两个相对染色单体在同一位置断裂，然后彼此和另一染色单体重新连接起来从而形成重组并消除这种张力。 二、基因转换现象 Olive等广泛研究粪生粪壳菌g座位，g-决定子囊孢子灰色，g+决定子囊孢子的黑色，在g+×g-的杂交中，他们分析了20万子囊，发现0.06%是5∶3分离，0.05%是6∶2分离，0.008％是3∶1∶1∶3（或异常4∶4）分离。图示． (1)一个孢子中的两个孢子有着不同的基因型。(2)分离比例不是4∶4。(3)邻近的基因A/a都呈现正常分离。 断裂重接模型则无法解释异常现象。
1930年，德国遗传学家H．温克勒把这种不规则分离现象解释为减数分裂过程中同源染色体联会时一个基因使相对位置上基因发生相应的变化所致，因而称就基因转变。好象是由于一个基因转换为另一等位基因，所以称为基因转换（gene conversion）。 以后由于发现一个基因发生基因转变时，它两旁的基因常同时发生重组：在5∶3和6∶2分离的子囊中，大约有30%也在g座位的这边或那边发生重组；有基因转换的子囊中，基因转换和遗传重组都发生在同样两个单体的子囊比例竟高达90%。 所以认为基因转变是某种形式的染色体交换的结果。因此，基因转变的研究，实质上也是染色体交换机制的研究。 三、同源重组的Holliday模型
1964年，R. Holliday提出了重组的杂合DNA模型(hybrid DNA mode)，并作修正。图示．过程：
同源重组的分子机制 、断裂重接模型(breakage joi ning model ) C. D. Darlington 1936 年提岀。 在同源染色体联会时，由于染色体的缠绕而产生张力，两个相对染色单体在同一位置断裂, 然后彼此和另一染色单体重新连接起来从而形成重组并消除这种张力。 、基因转换现象 Olive等广泛研究粪生粪壳菌g座位，g-决定子囊抱子灰色，g+决定子囊抱子的黑色，在+ - g X g的杂交中，他们分析了20万子囊，发现0.06%是5 : 3分离，0.05%是6 : 2分离，0.008 % 是3 ： 1 ：1 ：3 (或异常4 : 4)分离。图示.(1) 一个抱子中的两个抱子有着不同的基因型。(2)分离比例不是4 : 4。(3)邻近的基因A/a都呈现正常分离。
断裂重接模型则无法解释异常现象。
1930年，德国遗传学家H.温克勒把这种不规则分离现象解释为减数分裂过程中同源染色 体联会时一个基因使相对位置上基因发生相应的变化所致，因而称就基因转变。好象是由于一个 基因转换为另一等位基因，所以称为基因转换(gene con version ) 30%也在g座位的这边或那边发生重组；有基因转换的子囊中，基因转换 和遗传重组都发生在同样两个单体的子囊比例竟高达90%。 所以认为基因转变是某种形式的染色体交换的结果。因此，基因转变的研究，实质上也是染色体交换机制的研究。 粗糙脉俺菌中+ pdxpX pcfc ■!■杂交 抱子对 子囊型 1234 第一对+ pdxp pdj：++ +pdx ■+ 第二对+ +pds +++ 第三对+ pixp+ +”酝 ++ 4 第四对pdx ++ pcfep pd^ +pdx +、同源重组的Holliday模型 M pdx—pdxp-Dtt 哆醇pH?感 + + pdx
原核生物的同源重组 在生物细胞中，DNA或RNA分子间或分子内的同源序列能在自然条件下以一定的频率发生重新组合，这个过程称为同源重组（Homologous Recombination）。同源重组的频率与DNA 或RNA序列的同源程度（即序列的相似程度）、同源区域大小以及生物个体的遗传特性密切相关，一般而言，同源程度越高、同源区域越大，重组的频率就越高。同源重组是生物进化的一种重要方式，对于原核细菌、噬菌体和病毒而言，同源重组现象的发生尤为普遍。 3.1.1 原核细菌的基因转移程序 原核细菌的基因转移程序是基于物理学和生物学的原理建立起来的，将质粒或噬菌体DNA导入细菌受体细胞的方法主要有以下几种： 1．Ca2+诱导转化法 1970年，有人发现用CaCl2处理过的大肠杆菌能够吸收噬菌体DNA，此后不久，对这种程序进一步的优化实现了质粒DNA转化大肠杆菌的感受态细胞，其整个操作程序如图3-1所示。将处于对数生长期的细菌置入0℃的CaCl2低渗溶液中，使细胞膨胀，同时Ca2+协助细胞膜磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域，这就构成了大肠杆菌人工诱导的感受态。此时加入DNA，Ca2+又与DNA结合形成抗脱氧核糖核酸酶（DNase）的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上。经短暂的42℃热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA 分子便趁机进入细胞内。此外在上述转化过程中，Mg2+的存在对DNA的稳定性起很大的作用，MgCl2和CaCl2又对大肠杆菌某些菌株感受态细胞的建立具有独特的协同效应。1983年，有人除了用CaCl2和MgCl2处理细胞外，还设计了一套用二甲基亚砜（DMSO）和二巯基苏糖醇（DTT）进一步诱导细胞产生高频感受态的程序，从而大大提高了大肠杆菌的转化效率。目前，Ca2+诱导法已成功地用于大肠杆菌、葡萄球菌以及其它一些革兰氏阴性菌的转化。 2．原生质体转化法 在高渗培养基中生长至对数生长期的细菌，用含有适量溶菌酶的等渗缓冲液处理，剥除其细胞壁，形成原生质体，它丧失了一部分定位在膜上的DNase，有利于双链环状DNA分子
毕赤酵母同源重组的原理及目的基因整合方式毕赤酵母同源重组的原理及目的基因整合方式通过转化DNA与毕赤酵母基因组中同源序列的同源重组，毕赤酵母与酿酒酵母一样可产生 稳定的阳性转化子。这些重组的菌株在无选择压力条件下，即使其携带的基因是多拷贝的， 也表现出极度稳定性。常用的表达载体都含有HIS4基因，编码组氨酸脱氢酶基因，这些载 体经限制性内切线性化以后，可在AOX1或his4位点进行同源重组，从而产生HIS+重组子。单交换插入比双交换（替换）要更容易发生，多拷贝事件自发发生的几率只有单交换几率的 1-10%。 1. 基因插入AOX1或aox1::AGR4位点 GS115 的AOX1或KM71 的aox1::AGR4 位点可以与载体上AOX1位点（AOX1 启动 子，AOX1 转录终止子TT或下游3’AOX1三个位点发生同源重组，这样就在AOX1 或 aox1::AGR4 基因的上游或下游插入一个或多个基因拷贝。因为插入的表达盒没有破坏 原有基因组中的AOX1，所以转化子在GS115 中为HIS+ Mut+表型，在KM71 中为HIS+ Muts表型。 2. 基因替换AOX1位点
在his4 菌株如GS115 中，载体及基因组中AOX1启动子及3’AOX1 区的双交 换事件(取 代)，结果AOX1 编码区全部被取代，产生HIS＋Muts 表型。以AOX1 位点由基 因替 代而产生的Muts表型作为指示，可很容易地筛选出HIS＋转化子的Mut 表 型。基因取 代的结果是缺失了AOX1 位点（Muts），增加了含有pAOX1、目的基因、HIS4 的表达 盒。基因取代（双交换事件）不如基因插入（单交换事件）发生得多。 3. 基 因插入His4位点 GS115（Mut+）或KM71（Muts）中，载体上HIS4 基因与染色体上his4 位点之 间发生 单交换事件，结果在his4位点插入一个或多个基因拷贝。由于基因组上AOX1 或 aox1::AGR4 位点未发生重组，这些His＋转化子的表型均与亲本菌株相同。 4. 多拷贝插入 尽管多拷贝事件自发发生的概率很低，但是通过在培养基中加入选择性标记， 还是很容 易在转化子中筛选到插入多拷贝的表达核的转化子。
中国生物工程杂志 China B i otechnol ogy,2007,27(8):53～58 技术与方法 一种高效构建同源重组D NA 片段的方法 ———融合PCR 李 敏 杨 谦 3 (哈尔滨工业大学生命科学与工程系 哈尔滨 150001) 摘要 融合PCR 技术(fusi on PCR )采用具有互补末端的引物,形成具有重叠链的PCR 产物,通过PCR 产物重叠链的延伸,从而将不同来源的任意DNA 片段连接起来,此技术在不需要内切酶消 化和连接酶处理的条件下实现DNA 片段的体外连接,为同源重组片段的构建提供了快速简捷的途径。对原有的融合PCR 技术进行改进,以3个同源重组线性DNA 片段的构建为例,详细论述了改进的融合PCR 技术的反应过程及技术体系。结果表明,改进的融合PCR 技术可以同时进行3个片段及4个片段的融合反应,产物长度均在4.5kb 以上,各同源重组片段在扩增过程中均无 突变发生,获得的片段可以用于后续实验分析。关键词 融合PCR 重组片段 同源臂 抗性基因 中图分类号 Q784 收稿日期:2007204217 3通讯作者,电子信箱:yangq@hit .edu .cn 随着大规模的基因组测序计划的完成及大量表达序列标签数据库(dbEST )的建立,基因组研究已由结构基因组逐渐转向了功能基因组研究 [1] 。以同源重组技 术为基础,通过构建突变或缺失的同源媒介基因载体并取代基因组中野生型的等位基因,进而研究目的基因与表型性状间的关系,是研究动物、植物、微生物基因功能的一种非常有用的遗传操作方法 [2～4] 。 同源重组的发生依赖于载体与目的片段间存在一定的DNA 序列同源片段,同源片段越长越有利于同源重组事件的发生。传统的同源重组载体的构建以限制性内切酶和DNA 连接酶为基础,通过一系列的酶切连接反应将各片段逐步连接起来。这种方法费时费力,不但在连接过程中引入了不必要的酶切位点碱基序列,而且对于长片段的连接有时难以找到合适的酶切位点。为了克服传统的同源重组载体构建方法的缺陷,出现了以聚合酶链式反应为基础的片段拼接技术———融合PCR 技术(fusion PCR )。融合PCR 技术在 不需要内切酶消化和连接酶处理的条件下,采用具有互补末端的引物将不同来源的扩增片段连接起来,为同源重组片段的构建提供了快速简捷的途径。现有的融合PCR 技术一般包括两步PCR 反应:(1)应用特异性引物,对各片段进行独立扩增,特异性引物的5′末端带有一段相邻片段的互补序列;(2)在同一反应体系中加入各片段的混合物,以一对外侧引物进行融合片段的全长扩增。由于融合PCR 技术正处于初步发展阶段,在应用过程中还存在很多方面的问题,如融合产物长度一般在4.0kb 以下、待融合片段的个数一般不超过3个、产物特异性差等。Robert 等 [5] 应用融合PCR 方法进行了3个片段的融合反应,获得了3个融合产物,融合产物长度最大为 4.2kb 。Majid 等 [6] 在进行4 个片段的连接时,首先将425bp 的alcA 启动子片段和 1.9kb 的pyr4基因片段连接到pUC19载体上,得到一 个2.1kb 的pyr4ΟalcA 表达盒,再通过两步PCR 将 2.1kb 的pyr4ΟalcA 表达盒与两个长度分别为410bp 和513bp 的片段进行了融合,最终才获得了一个由4个片 段组成的长3.0kb 的融合产物。
1.1.1Gibson assembly 简介（INTRODUCTION） 原理：Gibson assembly是一种one step, one pot的快速基因组装方法。它只需要将基因片段和需要的三种酶混合在同一个管内在50°C下培养15-60 min就可以得到组装好的DNA。 装配原理基于DNA片段间的重叠区域，过程依赖于三种酶：DNA 外切酶（T5 exonuclease）, 高 保真DNA聚合酶。（Phusion polymerase）和耐热DNA连接酶（Taq DNA ligase）的共同作用。首先，T5 核酸外切酶消化DNA片段的链方向是从5’到3’. 每个DNA片段分别形成一个单链的突出部分，由于着这两个相邻的突出片段有一部分具有同源性能够互补，所以DNA片段退火，互补的序列重新配对连接。然后，在空缺的部分DNA聚合酶以另一条DNA单链为模板，沿3' 方向将对应的脱氧核苷酸连接到单链上，填补缺口。最后，连接酶将两条DNA 单链黏合起来，密封裂缝。这样具有重叠区域的DNA片段就组装成一整条DNA分子了。下面是组装的示意图。 材料（MATERIALS） ?试剂（REAGENTS） NAD，H2O ，1 M MgCl2，1 M DTT，10 mM dNTP mix，1 M Tris-HCl pH ，50% PEG-8000，mg/ mL Tag ligase，μg/ mL T5_ExO，Phusion(1×)、LB培养基、抗生素（据载体而定）、LB 平板（相应抗性） ?实验前准备（SETUP） 于冰水浴中配制如下反应体系。如果不慎将液体粘在管壁，可通过短暂离心使其沉入管底。 4x isothermal assembly buffer NAD 20 mg
?综述? 作者单位:300192 天津,中国医学科学院放射医学研究所 DNA 同源重组修复的分子机制 王勇 樊飞跃 电离辐射直接造成生物靶分子细胞DNA 的损伤,DNA 的损伤类型很多,其中以DNA 双链断裂(double strand break , DS B )最为严重。DNA DS B 的修复较其他类型的DNA 损伤更 加困难,不修复则可能导致染色体断裂和细胞死亡,而修复不当则可能导致染色体缺失、重排、转位和倒置等,从而易于形成肿瘤等疾病[1]。DNA 损伤的不完全修复可导致基因组不稳定,机体细胞为了对抗损伤,发展出多个修复系统来保证基因组的完整性,同源重组修复(hom olog ous recombination repair ,HRR )是DNA DS B 损伤修复的主要方式,对于保持哺乳 动物细胞的基因组完整性十分重要[2]。重组即遗传物质的重排,同源重组是指发生在同源DNA 序列间的重组,主要是利用DNA 序列间的同源性来识别,而负责配对和重组的蛋白质因子并无碱基序列特异性。 本文综述了国外近来对HRR 分子机制的研究进展,包括引发HRR 的DNA 损伤机制;HRR 的基本修复过程和多条修复通路;HRR 关键分子重要功能的实现机制;HRR 与细胞周期调控等其他事件的相互关系;辐射和HRR 及其与肿瘤之间的关系。 11DNA 损伤的感受识别:HRR 参与的蛋白质有RAD51,RAD51b ,c ,d ,RAD52,RAD54,BRC A1,BRC A2,XRCC2,XRCC3 和MRN 复合物等,另外还需大量起始和损伤应激感受分子,包括AT M ,ATR 和DNA 2PK cs [3]。 细胞在受到电离辐射照射后,一系列重组或修复蛋白及复合物重新定位形成核焦点,以应答DNA 损伤。这些蛋白有γ2H2AX ,AT M ,RAD51,BRC A1,BRC A2,NBS1,RPA 和 MRN ,它们相互作用,完成DNA 损伤信号的接受功能并转导 信号给其他蛋白质,介导并协调包括周期检控点、凋亡、修复的损伤应答。在电离辐射引起的DS B 损伤应答中AT M 是最有可能的感受分子,它属于三磷酸肌醇激酶样激酶(PIKK )家族成员(如AT M 、ATR 、DNA 2PK ),都具有磷酸化谷氨酰氨酸残基后的丝或苏氨酸残基的激酶活性。AT M 以二或多聚体非活化形式储存于未受损伤的细胞,DNA 损伤后AT M 通过自我磷酸化,解离二聚体释放出AT M 对其他分子磷酸化的结构域。活化的AT M 可磷酸化组蛋白H2AX 的139位丝氨酸残基,M DC1ΠNF BD1的俩末端BRCT 结构域,BRC A1的1189, 1542和1524位丝氨酸残基 [4] 。在磷酸化M DC1ΠNF BD1促进 下,DNA 损伤后1～3min ,最先定位于DS B 2Mbp 左右区域内的蛋白之一H2AX 就被磷酸化为γ2H2AX ,磷酸化组蛋白可使染色体的部分结构改变,释放出损伤位点的DNA ,并以其为 装配中心继续募集MRN 、BRC A1等其他因子形成大型复合物来监控基因组的损伤[5]。 21HRR 的起始:在AT M 介导的H2AX 磷酸化波之后,活 化的AT M 与DS B DNA 结合,进而磷酸化结合至γ2H2AX 核焦点的53BP1、NBS1,随后RAD502MRE11复合物由MRE11结合到NBS1,完成定位于DS Bs MRN 复合物的装配,同时BRC A1也结合至损伤位点的53BP1。很可能由具有内切酶和外切酶活性的MRN 复合物发挥5′23′外切酶活性切割DNA 断裂末端,同时MRN 也参与从DS B 到下游DNA 应答蛋白的信号转导。由于NBS1只是3′25′而不是5′23′外切酶活性,故需其他核酸酶的协助切割DNA 来提供DNA 配对和链交换所必需的 3′ssDNA 突出。MRE11定位于细胞核内,Mn 2+ 为辅因子,亚基 参与构成RAD50复合物,有单链内切酶活性和双链特异性 3′25′外切酶活性。RAD50有ATPase 活性的头部球状结构域, 使得DNA 结合具有ATP 依赖性,而其高度柔性的分子卷曲尾部,就像是从核心蛋白向外伸出的长臂,可以较大倍率的易化两DS B 末端互寻,进而桥接两个断裂末端[6]。之后由人复制蛋白A (RPA )与突出末端结合以保护并去除其二级结构。RPA 是由14、32和70kDa 3亚基组成稳定的异质三聚体,与ssDNA 结合,是DNA 复制、重组和修复的必需蛋白。 31链侵入和修复性合成:E .coli 的RecA 的真核细胞同 源物RAD51代替RPA 在ssDNA 区域形成核蛋白纤维,催化同源序列的寻找、链配对和链交换。这是一个需要同源序列的RAD51依赖性链侵入机制。RAD51催化重组中的分子间稳定的联会配对包括:RAD51核蛋白纤维同源双螺旋DNA DS B 被加工的单链末端链侵入成为同源dsDNA ,核蛋白纤维 的ssDNA 和侵入DNA 双螺旋同源链之间的Wats on 2Crick 氢键作用导致随后的双螺旋非互补链的置换,最后形成含有异源双螺旋DNA 的D 环结构重组中间体。随着链交换的深入,重组中间体分岔结构向两边迁移的同时,以侵入中的DS B 加工后的3′末端作为引物,侵入双螺旋的互补链作为模板,进行修复性DNA 合成[7]。 RPA 参与链侵入,通过稳定ssDNA 和被置换来促进RAD51结合ssDNA 。RAD51属于RecA RAD51亚家族,可能定 位于核内,广泛参与普遍的DNA 损伤应答通路,结合单或双链DNA ,可显示DNA 依赖的ATPase 活性,Mg 2+和K +是辅因子[8]。RAD51同系物中RAD51D 的地位特殊,一旦缺失,人和大鼠细胞将不能增殖,小鼠在出生前就会死亡[9]。 参与DS B 的HRR 的RAD52以环状七聚体钳住DNA 链,募集RAD51结合到RPA 覆盖的ssDNA ,结合两者并协助 RAD51形成DNA 交换中间体,可将ssDNA 暴露于蛋白质表
一步法构建同源重组载体 王海艳 （中国农业大学） 同源重组载体构建需要分别克隆目的片段两端的同源臂（长度~1kb），并与Marker基因进行连接。传统的构建方法是两段同源臂分别克隆构建到目的载体， 费时费力。在本例中，本人已经成功应用汉恒生物科技（上海）有限公司的 HB-Infusion TM无缝克隆试剂盒，将同源臂及Marker基因一步成功构建到载体上， 现将实验过程及结果分享如下： 1. 目的片段引物的设计 用NEB builder（https://https://www.doczj.com/doc/9110531834.html,/watch?v=8_-t5xtJ3y8），或snapgene，genome compiler等软件，将三个目的片段的基因序列、线性化载体的基因序列按照软件使用说明依 次填入，将自动生成所需要的引物序列（如下表）。将引物提交华大基因进行合成。 引物序列列表 Primers Seq Tm GC(%) Len Fragment dDNA-P1 attgggtaccgggccctctagATATACTCGACAGGGCCCGC 73.5 61 41 3'-flank dDNA-P2 gtcactgtacGTGTGGCATTGCCCAGTCA 64.3 55 29 dDNA-P3 aatgccacacGTACAGTGACCGGTGACTCTTTCTG 66.8 51 35 5’-flank dDNA-P4 atcggtgcTCGAGTGGAGATGTGGAGTGG 65.7 59 29 dDNA-P5 atctccactcgaGCACCGATGTCGCCACGC 68.5 63 30 Marker fragment dDNA-P6 aagggaacaaaagctggagctGTAGTAGAGAACTTGGACTTCGGCG 70.8 50 46 2. 目的片段的扩增 反应体系 DNA(248ng/μL) 1 μL
287 doi:10.3969/j.issn.0253-9608.2015.04.007 DNA同源重组机制的确立 向义和? 清华大学物理系，北京 100084 摘要 介绍了DNA同源重组机制确立的过程。其主要内容包括基因连锁和重组现象的发现，交叉假设的提出，断裂重接假设和复制选择假设的出现，同源重组的三个模型(Holliday模型、单链断裂模型和双链断裂模型)的确立。关键词 连锁基因；同源重组；交叉假设；Holliday模型；单链断裂模型；双链断裂模型 DNA 重组(recombination)是指发生在DNA 分子内部或DNA 分子之间核苷酸序列的交换、重排和转移现象，是已有遗传物质的重新组合过程。同源重组(homologous recombination)是在两个DNA 分子的同源序列之间直接进行交换的一种重组形式。进行交换的同源序列可能是完全相同的，也可能是非常相近的。同源生物体通过重组可以产生新的基因或等位基因的组合，还可以提高种群内遗传物质的多样性，而人们可使用同源重组进行遗传作图。 本文介绍了DNA 同源重组机制确立的过程。20世纪初发现了基因连锁和重组现象，在探讨重组现象出现的原因时又提出了交叉假设，形成了交换概念。20世纪30年代中期在探讨基因交换的机制时，出现了染色体交换的两种假设：断裂重接假设和复制选择假设。1953年DNA 双螺旋结构发现后，科学家开始在分子水平上探讨同源重组的机制。20世纪60—80年代，科学家分别提出了DNA 同源重组的三种模型：Holliday 模型，单链断裂模型和双链断裂模型。 1 基因连锁和重组现象的发现 1.1 连锁现象的发现 1905年，英国生物学家贝特森(Bateson W., 1851—1926)和庞尼特(Punnet R. C.)研究香豌豆两对性状的遗传。他们选择的一对性状是花的颜色，有紫色和红色两种；另一对是花粉粒的形状，有长形和圆形两种。将紫花长花粉粒和红花圆花粉粒的植株作亲本进行杂交，结果F 1代都是紫花长花粉粒，可见紫花对红花是显性，长花粉粒对圆花粉粒是显性。将F 1代自交得到的F 2代有紫长、紫圆、红长、红圆4种表型。这4种表型的比率不符合孟德尔的两对遗传因子的分离比9∶3∶3∶1，其中紫长和红圆的表型的比率远远超出9/16和1/16，而相应的紫圆和红长的表型却大大少于3/16(表1)。[1] 表1 香豌豆紫长×红圆杂交试验 F 2紫长紫圆红长红圆总数实得数 4 831390393 1 338 6 952预计数 3 910.5 1 303.5 1 303.5 434.5 6 952 将实验数据与由孟德尔自由组合定律所预期结果相比较，F 2代中性状的亲本组合类型远远多于重组组合的类型。这等于说，两对基因在杂交子代中的组合并不是随机的，在F 1杂种形成配子时，原来属于同一亲本的两个基因更倾向于进入同一配子中，有更多保持亲本原来组合的倾向，而且这种倾向与显隐性无关。这是在自由组合定律方面第一次出现的显著的例外，无疑，这 ?通信作者，E-mail ：xiangyhts@https://www.doczj.com/doc/9110531834.html,
同源重组 同源重组（Homologous Recombination) 是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。同源重组需要一系列的蛋白质催化，如原核生物细胞内的RecA、RecBCD、RecF、RecO、RecR等；以及真核生物细胞内的Rad51、Mre11-Rad50等等。同源重组反应通常根据交叉分子或holiday结构（Holiday Juncture Structure) 的形成和拆分分为三个阶段，即前联会体阶段、联会体形成和Holiday 结构的拆分。 目录 1简介 2基因敲除 1. 2.1 定义 2. 2.2 技术路线 3转移法 4DNA 1简介 同源重组（Homologus Recombination) 是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin)之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。同源重组需要一系列的蛋白质催化，如原核生物细胞内的RecA、RecBCD、RecF、RecO、RecR等；以及真核生物细胞内的Rad51、Mre11-Rad50等等。 同源重组 同源重组反应通常根据交叉分子或holliday结构（Holiday Juncture Structure) 的形成和拆分分为三个阶段，即前联会体阶段、联会体形成和Holiday 结构的拆分。同源重组反
应严格依赖DNA分子之间的同源性，100%重组的DNA分子之间的重组常见于非姐妹染色体之间的同源重组，称为Homologous Recombination，而小于100%同源性的DNA分子之间或分子之内的重组，则被称为Hemologus Recombination。后者可被负责碱基错配对的蛋白如原核细胞内的MutS 或真核生物细胞内的MSH2-3等蛋白质“编辑”。同源重组可以双向交换DNA分子，也可以单向转移DNA分子，后者又被称为基因转换（Gene Conversion)。由于同源重组严格依赖分子之间的同源性，因此，原核生物的同源重组通常发生在DNA复制过程中，而真核生物的同源重组则常见于细胞周期的S期之后。 2基因敲除 定义 基因敲除（geneknockout），是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去除，或用其它顺序相近基因取代，然后从整体观察实验动物，推测相应基因的功能。这与早期生理学研究中常用的切除部分-观察整体-推测功能的三部曲思想相似。 基因敲除除可中止某一基因的表达外，还包括引入新基因及引入定点突变。既可以是用突变基因或其它基因敲除相应的正常基因，也可以用正常基因敲除相应的突变基因。技术路线 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的一门新技术。80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型。此后的几年中，基因敲除技术得到了进一步的发展和完善。 基因敲除的技术路线如下： （1）构建重组基因载体﹔ （2）用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA转入受体细胞核内﹔ （3）用选择培养基筛选已击中的细胞﹔ （4）将击中细胞转入胚胎使其生长成为转基因动物，对转基因动物进行形态观察及分子生物学检测。