非受体型酪氨酸激酶Syk蛋白的提取与纯化

󰀁论著󰀁文章编号:1007-8738(2004)02-0230-04非受体型酪氨酸激酶-Syk蛋白的提取与纯化单保恩1,董󰀁青1,李宏芬1,陈󰀁晶1,董金琢2,马󰀁洪2(1河北医科大学第四医院科研中心,河北石家庄050011;2美国MD技术公司,Mo63021,美国)

收稿日期:2003-06-07;󰀁修回日期:2003-09-18基金项目:美国MD技术公司合作课题基金资助(2002年)作者简介:单保恩(1962-),男,河北邯郸人,教授,博士生导师.Tel:(0311)6033941-290;Email:baoenshan@yahoo.com.cnExtractionandpurificationofnon-recep-tortypePTKs-SykSHANBao-en1,DONGQing1,LIHong-fen1,CHENJing1,DONGJin-zhuo2,MAHong21ResearchCenter,TheFourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China;2MDTechnologiesInc.845PheasantWoodsDriveManchester,Mo63021,USAAbstractAIM:ToextractandpurifySykproteinfromSf21cellstransfec-tedbysykgene.METHODS:Sf21cellsweretransfectedwithrecombinantsykgene.After48hofincubationat28󰀁,thetransfectedcellswerecollectedandsonicatedwithSonfierson-icatoronice.FilteredcellextractwasloadedontoaReactiveYellow-3resincolumnandToyopearlAF-Heparin-650Mcolumnrespectively.ThecharacterofSykproteininthefractionswereidentifiedbySDS-PAGE,WesternblottingandIEF.RESULTS:225mgofproteincontainingSykwereobtainedfromSf21cells(2.5󰀁109)extract.Thereweretwosubpopulationsintheelu-tionofReactiveYellow-3resincolumnwiththesamerelativemolecularmass(Mr)72󰀁103.ThetwosubpopulationswerethenappliedonToyopearlAF-Heparin-650Mcolumnandtwopureproteinswereobtained.TheresultsofSDS-PAGE,Wes-ternblotting,andIEFshowedthetwoproteinshavingthesamerelativemolecularmass(72󰀁103),correspondingtoSyk,butwithdifferentpI.CONCLUSION:TheyieldofSykwas8mgfrom2.5billioncellsandthepuritywas>95%.ThetwopurifiedSykproteinshavethesameMranddifferentpI.ThepurifiedSykproteincanbeappliedtostudySyk󰀁smechanism,produceant-iSykantibodyandinventSykdiagnosiskit,etc.Keywords:Syk;purification;chromatography;Sf21cells摘要目的:从转染syk基因的Sf21细胞中提取、纯化免疫相关因子Syk蛋白。方法:将syk基因转染Sf21细胞,于28󰀁培养48h,收集细胞,用超声波破碎仪裂解细胞,提取裂解液中总蛋白,用Yellow-3凝胶和Toyopear-lAF-Heptin-650M凝胶层析柱分离、纯化。层析液中的Syk蛋白存在和性质,用SDS-PAGE、免疫印迹实验和等电聚焦实验鉴定。结果:从25亿个Sf21细胞裂解液中提取了含有Syk的225mg蛋白质。经Yellow-3凝胶层析分离,得到两个亚种的Syk蛋白,相对分子质量(Mr)均为72󰀁103。进一步用Toyopear-lAF-Heptin-650M凝胶层析纯化后,得到两个纯的Syk蛋白,SDS-PAGE、免疫印迹实验结果显示,两种Syk的Mr均为72󰀁103,与Syk的理论相对分子质量吻合。但等电聚焦实验显示,这两种Syk蛋白成分具有不同的pI值。结论:从25亿个转染syk基因的Sf21细胞中纯化出8mgSyk蛋白,纯度高于95%。这两种Syk的Mr虽然相同,但具有不同的pI值,是两个亚种。这些Syk可用于研究Syk的作用机制、抗Syk抗体的制备和Syk诊断试剂盒的制备等。关键词:Syk;分离纯化;凝胶层析;Sf21细胞中图分类号:R392.11󰀁󰀁󰀁文献标识码:B󰀁󰀁非受体型酪氨酸激酶(spleentyrosinekinase,Syk),是一种B细胞激活信号转导中最重要的激酶[1],与T细胞激活中的ZAP-70属于同一个PTK家族,Mr为72󰀁103。Syk在T细胞和B细胞的成熟和活化过程中起关键作用[2]。该酶除有激酶活性中心SH1之外,还有两个SH2结构域,因而成为磷酸化I-TAM招募的首选对象。被招募的Syk立即成为Src作用的第二个靶目标,进而启动B细胞活化信号转导的三条主要途径(磷脂酰肌醇途径、MAP激酶相关途径和磷酸肌醇3激酶途径),激活各种转录因子转位进入细胞核,与基因启动子区域中各种顺式作用元件或DNA小盒结合,使相应基因发生转录激活和产物表达,调整B细胞等细胞克隆的蛋白质表达、细胞分化或凋亡。研究发现,Syk不但是免疫调节因子,在肿瘤发生发展中也发挥着重要作用。但是,用于研究Syk的蛋白标准品、抗体和诊断用试剂很难取得。我们介绍从转染syk基因的Sf21细胞中提取、纯化免疫相关因子Syk蛋白。230ISSN1007-8738细胞与分子免疫学杂志(ChinJCellMolImmunol)2004,20(2)1󰀁材料和方法1.1󰀁材料󰀁兔抗Syk抗体购自美国SantaCruz生物技术公司。酶标记绵羊抗兔二抗购自美国LexingtonKY转导实验室。蛋白Mr标准品[Mr(14~97)󰀁103\󰀁和ECL购自华美公司分装的AmershanPharmaciaBiotech公司产品。PVDF膜使用Millipore产品。其他化学试剂均为分析纯。1.2󰀁方法1.2.1󰀁细胞株及细胞培养󰀁Sf21细胞株来源于黏虫卵巢组织(Spodopterafrugiperda),由美国Inritrogen提供[4]。Sf21细胞应用Grace󰀁s培养基(含100mL/LFCS,10g/L抗菌素和抗霉菌素)(Gibco-BRL)进行培养[5]。将细胞调整到1󰀁109/L左右的密度,用培养瓶(BellcoGlassInc.Vineland,NJ)于恒温摇床(80~100r/min)26~28󰀁进行培养。经胎盼蓝染色检测活细胞百分率应为95%~100%。1.2.2󰀁重组syk基因的杆状病毒制备󰀁应用Luckow建立的Bac-to-Bac方法进行制备[6]。该方法是基于在大肠杆菌中点特异性转录重组病毒的产生特性,表达水平较高,是较理想的基因表达载体。1.2.3󰀁纯化baconidsykDNA󰀁应用脂质体介导技术[7],将转染syk基因的Sf21细胞于28󰀁培养4~6d,用cellfectin试剂(Gibco-BRL)进行选择培养,收集细胞制备sykDNA。应用O󰀁Reill等[7]报道的噬菌体纯化法纯化病毒颗粒。经培养一些孔形成噬菌斑,将这些阳性培养孔细胞经SDS-PAGE检测,有Mr为72󰀁103蛋白条带的存在。1.2.4󰀁Sf21细胞的大量制备及Syk的分离、纯化󰀁于3L培养瓶中加入1L呈对数生长期的Sf21细胞悬液[(1.0~1.2)󰀁106/mL],加入25mL病毒贮存液(󰀁2.5󰀁108pfu/mL),于恒温摇床(80~100r/min)28󰀁培养48h进行病毒感染(病毒感染率约为6)和细胞增殖[8]。收集细胞悬液低速离心(500g,7min),将细胞沉淀物(2.5󰀁109)与细胞裂解液(20mmol/L磷酸钠pH7.4,1mmoL/LEDTA,1mmol/LEGTA,1mmol/LDTT,1mL/LTriton-100,200mg/L抑蛋白酶肽,50mg/L亮抑蛋白酶肽,10mmol/L焦亚硫酸钠)共同培养30min,于冰浴中用超声波破碎仪(BransonsonicPowerCo.Danburg.CT)震荡裂解3次,每次30s(设定输出功率为󰀁3󰀁档)。将细胞裂解液于4󰀁100000g离心60min(贝克曼LE-80K超速离心机)。收集上清液,用0.2󰀁m滤器滤过。将滤液加入活化的Yellow-3层析柱(2.5󰀁10cm,Sigma),用两倍体积的缓冲液(20mmol/LNa-Pi,pH7.4,1mmol/LEDTA,1mmol/LEGTA,1mmol/LDTT)和1倍体积的含有200mmol/LNaCl的缓冲液冲洗层析柱。Syk蛋白用3.5倍体积的含0.2~1mol/LNaCl的缓冲液洗脱,层析液中的Syk蛋白用SDS-PAGE和免疫印迹进行检测。含有Syk的层析成分分别被收集到一起,用含有200mmol/LNaCl的缓冲液透析2h,再加入ToyopearlAF-Heptin-650M层析柱(2.5󰀁12cm,Sigma)层析柱中,用含200mmol/LNaCl的缓冲液平衡后,Syk蛋白用含有(0.2~1)mol/L浓度梯度NaCl的缓冲液洗脱,层析成分用SDS-PAGE和免疫印迹分析Syk蛋白的存在。1.2.5󰀁蛋白电泳和免疫印迹实验󰀁细胞溶解物或层析液进行SDS-PAGE分离(分离胶浓度为100g/L),凝胶用CBB-R250染色确认蛋白条带,并将此凝胶上的蛋白转移至PVDF膜,蛋白Marker用Ponceans(Sig-ma)染色。PVDF膜用30g/LBSA(BSA溶于TBST缓冲液:1mmol/LTris-HCl,pH7.4,150mmol/LNaCl和1mL/LTween20)封闭1h后,与抗Syk抗体(用TBST作1󰀁20000稀释),室温反应1h。用化学发光显色系统显色(ECL,AmershanPhamaciaBiotech)。1.2.6󰀁等电聚焦实验󰀁Syk的等电聚焦实验应用PhamaciaphastSystem和IEFPhastGel系统,按产品说明书操作。2󰀁结果2.1󰀁从Sf21细胞中提取蛋白质󰀁将转染syk基因的Sf21细胞(2.5󰀁109)与细胞裂解液共同孵育30min,再用超声波破碎仪震荡裂解。裂解液经100000g离心,收集上清液,用0.2󰀁m滤器滤过,从细胞裂解液中获取了225mg蛋白质。2.2󰀁SykYellow-3层析柱的分离和初步纯化󰀁将从Sf21细胞提取的蛋白质,用Yellow-3层析柱分离得到两个Syk层析成分(图1A黑色区域,表示23~33和34~41两个层析成分的峰值),析出两个Syk的盐浓度梯度(虚线)分别在(420~500)mmol/L和(550~650)mmol/LNaCl之间。SDS-PAGE分离结果显示,23~33和34~41两个层析成分均含有单一的蛋白条带,Mr为72󰀁103(图1B)。免疫印迹结果显示两种蛋白质均为Syk(图1C)。231ISSN1007-8738细胞与分子免疫学杂志(ChinJCellMolImmunol)2004,20(2)