神经干细胞体外培养研究进展罗湘颖 1.2.杨志敏 2.王廷华 1.赵匡彦 2.冯忠堂 1.（1.昆明医学院神经科学研究所2.昆明医学院附属第一医院神经外科，云南昆明65 003 1）近年来，随着神经科学的迅猛发展，神经科学界不但摆脱了哺乳动物中枢神经系统神经元损伤后不可再生的传统观念的桎梏，接受了神经干细胞的概念，而且已经将神经干细胞应用于体内、外各种实验研究。
鉴于体外培养方法在神经干细胞研究中的特殊的重要性，本文将就这一方面的研究进展做一综述。
1. 神经干细胞概念的提出干细胞（stem ce II）是指具有自我复制能力、能够分化成为至少一种功能细胞的早期未分化细胞。
根据干细胞分化潜能的大小, 可分为全能干细胞、多能干细胞以及只能向一种细胞类型分化的单能干细胞。
神经干细胞选择性培养法的建立是人们认识神经干*国家自然科学基金资助（No.30260112）罗湘颖，男（1978〜），湖南人，硕士，单位：昆明医学院神经科学研究所通讯作者：王廷华，男（1966〜），教授，博士，地址：云南省昆明市人民西路191号昆明医学院神经科学研究所（邮编650031）Tel:0871-******* Fax:0871-******* E-maiI:tinghua@全文3950字细胞的起点，是推动神经干细胞生物学发展的一大动力。
1992 年，Reynolds 等［1］首先利用一种称为“ neuro sphere 法”的特殊体外培养方法分离成年鼠的纹状体组织，酶解后加入表皮生长因子(ep id ermal gro wt h facto r, EGF )体外培养，获得了神经球干细胞，这些聚集成神经球(neuro sphere) 的培养细胞具有自我更新和增殖能力，表达神经上皮干细胞标记巢蛋白(neuro epithe lia l stem cell protein ，nest in)，并在体外培养诱导时可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。
Reyno lds 等从而据此提出来神经干细胞(neural stem cell , NSC)这一概念。
神经干细胞属于多能干细胞，在一定微环境中可分化出神经元和胶质细胞。
神经干细胞至少具备 3 种特性［2］：( 1) 缺乏神经系统分化的标志，是一种具有分化潜能的原始细胞；( 2) 具有自我更新和增殖能力；( 3) 多潜能性，即在特定条件影响或诱导下能分化为神经元和神经胶质细胞。
2. 体外培养神经干细胞的来源目前，体外培养神经干细胞的来源主要有以下几个方面［3］：( 1) 从成体组织或胚胎组织分离；(2) 胚胎干细胞 ( emb ryo nic stem cell , ESC)的定向诱导；(3)用癌基因如V- myc等转化神经细胞获得永生化细胞系。
胚胎干细胞具有分化的全能性，通过改变其培养基成分可定向诱导为某一专能干细胞。
但其中人胚胎干细胞的应用受到伦理及法律的限制。
而应用病毒或V-myc 等癌基因修饰的永生化细胞，其遗传特性改变并有继续突变的趋势，可能在移植后生成肿瘤或在分析正常基因对子代细胞分化方向时产生影响，因而其应用亦不广泛。
所以目前进行的神经干细胞研究，一般多是从胚胎组织或成体组织取材。
经过十余年的研究，现已发现哺乳类胚胎中，NSCs 集中在嗅球、侧脑室的脑室区、室下区、海马、脊髓、后脑和脑皮层。
而在成年啮齿类动物和成人的脑中则有三个NSCs 群，一个位于脑室区和室下区(sub ven- tricular zone，SVZ) ，这两个区域的室管膜细胞是由神经母细胞组成的混合细胞群，它们可以迁移到嗅球产生前体细胞 ( p recurso rcell )、星形细胞；另一个在连接侧脑室和嗅球的区域(在成人尚未得到证实)；第三个是海马［4］。
另外，继成年哺乳动物脑内成功地分离到了神经干细胞后，1996 年Weiss 等［5］首次报道成功地从成年哺乳动物脊髓内分离到了神经干细胞。
此外，在神经干细胞长期培养过程中，现已明确中枢神经系统的神经干细胞来源于囊胚期的内细胞群，至少分两类，即神经上皮干细胞和神经球干细胞，前者依赖碱性成纤维生长因子(fib roblast growth facto r, FGF)发育分化，后者依赖EGF发育分化。
起源于纹状体和皮层的干细胞，既可以在EGF 的刺激下分裂增殖，又可以在FGF 的刺激下分裂增殖，但EGF 反应性和FGF 反应性干细胞可能分属于干细胞的不同群组。
从中枢神经系统的头端向尾端过渡，脑干源的神经干细胞已经发现对EGF 的反应性下降，到了脊髓，基本就丧失了对单独的EGF 的反应能力，只对FGF 的刺激有反应，甚而只有在EGF 和FGF 的协同作用下才能长出能够分裂传代的功能性神经干细胞［6］。
3. 体外培养神经干细胞的方法3. 1成体组织及胚胎组织神经干细胞的培养方法最先培养成功成年大鼠纹状体组织神经干细胞以及成年大鼠脊髓组织神经干细胞的Reyno lds[1 ]和Weiss[5 ]所采用的培养方法基本一致：组织取材后酶解消化，然后转入含0.7 mg/ml 卵粘蛋白的DMEM/F 12(1:1)液中机械吹散，将细胞悬液400转高速冷冻离心5分钟，再将沉淀洗涤一次后用培养基悬浮细胞，调整活细胞浓度为5000 — 1 0,000个/ml ,置于未包被的培养皿中培养。
培养基的配方为：DMEM/F1 2(1 :1)为基础培养基，包含5 mM HEP ES , 0.6%葡萄糖，3 mM 碳酸氢钠，以及2 mM 谷氨酰胺；另加入25血/ml胰岛素，100血/ml转铁蛋白，20 nM 孕酮，60 側腐胺，以及30 nM 亚硒酸钠代替血清；再加入人重组EGF 和/或bFGF 各20ng/ml 。
悬浮培养在培养皿中的成年小鼠纹状体细胞大部分于2d后死亡，但有少量细胞可继续分裂、增殖，形成细胞球，并悬浮于培养液中。
经免疫细胞化学检查，细胞球中几乎所有细胞都是nestin 阳性。
当这些细胞球被接种到涂有多聚左旋鸟氨酸的玻璃盖片后，细胞球贴壁后分化为神经元及胶质细胞。
若在培养板底部涂敷具有抗贴壁作用的多聚 2 羟乙基甲基丙烯酸酯，也能成功地分离出神经干细胞球。
所以，可以认为，悬浮培养是分离培养神经干细胞的前提。
在培养基适合的情况下，神经干细胞可分裂增殖并维持其干细胞特性以上由Reyno lds 和Weiss 所创立的“ neuro sp here 法”一直沿用至今。
但为适应目前神经干细胞实验研究的需要，许多学者发展了众多效率更高的方法。
Kallo s 等［7］提出接种神经干细胞的最佳PH 值是7. 1－7.5 之间，细胞密度在105 个/ml 以上。
Sen 等［8］创立了一种大规模扩增神经干细胞数目的方法。
他们不把神经球打散，而是将神经球的平均直径控制在150叩左右，这样球中心的细胞就不会发生坏死。
然后将神经球置于悬浮生物反应器中培养，12 天内传代3 次，细胞数目就扩增了近3000 倍，细胞密度达到106个/ml，且活细胞比例达到80 %以上。
而Low］等［9］则将EGF 反应性鼠神经干细胞用旋转管培养法培养3 天后，细胞形成肉眼可见的三维复合物，其数量是传统固定培养瓶培养所获细胞数量的数十倍。
此外，有许多学者将“ neuro sp here 法” 加以发展，应用于鼠胚、人胚、成人以及其它哺乳动物如犬［10］、羊［11］等的胚胎及成体组织的神经干细胞培养，并对这些不同来源神经干细胞培养方法的差异加以探讨。
Carpenter 等［12］提出分离和增殖人神经干细胞的条件是和啮齿类动物不同的，并指出了LIF 对人神经干细胞增殖的重要性。
他们发现在培养液中加入EGF 、bF GF 和LIF 时，在培养50 天以内干细胞增殖的速度和不加LIF 没有差别，但50天以后不加LIF 的培养液中的干细胞的增殖明显缓慢下来，而加LIF 的培养液中的干细胞的增殖速度每7至10 天就增加一倍。
另有实验研究了人胚与鼠胚神经干细胞体外培养的差异后认为：（1）使用单一生长因子即可从鼠胚分离神经干细胞，但不能从人胚皮层分离神经干细胞，而要协同采用具有丝裂原作用的生长因子，如bFGF 和EGF，才能够从人胚皮层分离神经干细胞；（2）鼠胚神经干细胞的增殖能力明显高于人胚神经干细胞；（3）人胚神经干细胞分化为神经元的比例高于鼠胚神经干细胞［13］。
3. 2其它来源神经干细胞的培养方法人胚胎干细胞的应用虽受限制，但仍有定向诱导胚胎干细胞向NS C转化的报道。
Tro pepe等［14］将ESC置于含有成纤维细胞生长因子2（F G F 2）1 0 ng/ml、白血病抑制因子（leuk emia in h ib it io n factor，LIF） 1000U/ml 条件下低密度培养，约0.3%的细胞形成表达nest in的细胞团，证实为NSC,且在传代培养中对F G F 2和LIF具有依赖性。
Fraichard 等［15］在含有1卩mo 1/1视黄酸(retino ic acid , RA)的培养液中培养ESC2 d,第3d在单层细胞表面可鉴别出nest in 阳性细胞。
这些细胞在无LIF和R A的培养基中分化为星形细胞、少突胶质细胞、丫氨基丁酸(GABA)能神经元和胆碱能神经元。
电生理检查发现这些细胞具有电压依赖性K+ 、Na+ 通道，并对电刺激产生冲动，说明ESC 能被RA 定向诱导为NSC。
此外，由于在体外状态很难维持原代神经干细胞生存或增殖达足够长的时间以检测其特性或对外源性因子的反应，所以可通过基因转移技术得到永生化神经干细胞系，用于基因转移及神经再生方面的研究。
比较经典的产生永生化神经干细胞系的方法是用携带癌基因的逆转录病毒转导发育中的脑细胞，使得细胞停留于细胞分化的某一时期，不能进行终末分化，并获得了长期传代的能力。
常用基因是myc、neu、p53、腺病毒EIA和猿猴病毒40(SV40 ) large T 抗原热敏突变体。
通过检测large T 抗原各种已知的变异情况对细胞凋亡的影响，发现large T抗原的J结构域和Rb结合基元(Rb- bind ing motif) 在此过程中发挥决定性作用。
因此可以将large T 抗原转导入神经干细胞中，从而使神经干细胞成为永久稳定的不死的细胞系。
根据这一原理，Slinsk ey 等［16］应用SV4 0 的病毒质粒载体将large T 抗原导入来源于胚鼠的神经干细胞中，发现每一个表达large T抗原的细胞系既可以在不含E GF的培养基中进行细胞分裂，又可以使细胞克服血清的生长抑制作用，能够在含有10%胎牛血清的培养基中生长增殖，还可以有效地抵抗凋亡的发生。
4. 体外培养神经干细胞的应用自从神经干细胞的自身分裂增殖和多潜能分化能力被认识以后，人们就对其在中枢神经系统损伤和退行性疾病这样非常棘手的疾病中可能发挥的治疗作用充满了希望。
