RT-PCR和real time PCR 原理及步骤.ppt

特点： 高灵敏：至少可检出20pg DNA，高于 EB染色法25-100倍。 信噪比高：样品荧光信号强，背景信 号低。 操作简单：无须脱色或冲洗。 适用范围广：可适用于多种电泳分析 。 使用方便：不影响其它修饰酶作用。 经济：价格比银染便宜。
DNA交联荧光染料技术的评价
优点：成本较低，操作简单，无需对引物 或探针进行预先特殊的荧光标记，适用于 任何反应体系 缺点：特异性弱，因为染料也会结合到非 特异性扩增产生的双链分子和引物二聚体 中，使反应体系中的荧光本底较高。
R F Q Intact probe - reporter quenched by FRET R Reporter Q Quencher
R
Q R
Q
During PCR, probe hybridizes to target sequence
Probe is partially displaced during extension Probe cleaved by 5’- 3’ nuclease activity of polymerase Free reporter exhibits unquenched fluorescence
原理：扩增过程中，探针 与模板杂交时两种染料互 相接近，两探针能够进行 荧光共振能量的转移；转 移过程中，外来光源首先 刺激供体荧光染料，供体 便发光刺激附近的受体荧 光染料，使后者再发射出 具另一种波长的信号而被 检测系统接收。由于受体 荧光染料只有在两个探针 都与模板杂交时才会被激 发而发射荧光信号，所以 对信号的检测室在退火后 进行。
供体荧 光基团 受体荧 光基团
靶DNA
靶DNA
分子信标 (moclecular beacon )技术
该技术事一种基于荧光能量转移基础和碱基互补原则建立的技 术。分子信标实际是一段荧光素标记的寡核苷酸，结构是有环 状区和柄区组成，5’ 端标记报告基团R，3’ 端标记淬灭基 团Q在自由状态下，分子信标的结构呈发夹状

大于0.99 真正的信号:荧光信号超过域值
实时荧光定量PCR 原理 -------Ct值
Ct值的定义：
PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经 过的扩增循环次数
C(t) value
纵轴：荧光信号量
实时荧光定量PCR 原理 -------Ct值的重现性
横轴：PCR反映循环数
Ct值的特点：
EXON 1 EXON 1
INTRON 2 EXON 2
EXON 2
DNA RNA
PRIMER PREMIER 5.0
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运行程序
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结果分析
难以查找原因。
• Buffer and dNTPs Ex：扩增效率
实时荧光定量PCR定义
• Template
cDNA
Real-time PCR
Real-time PCR
引物设计
• 总原则与普通PCR相同 –避免引物二聚体，避免二级结构 • 尽量小些 （70 - 300bp) • 目标区段位置：考虑目标剪接体 • 推荐做跨intron设计
实时荧光定量PCR法
染料法举例
SYBR Green法研究CDK6 在
肺癌组织标本中的表达差异
实验步骤
流程示意图
TaqMan法举例
材料准备
从正常肺组织中提取的总 RNA 从肺癌组织中提取的 总RNA
-Trizol 最常用 -裂解液 （氰酸胍，异硫氰酸呱， SDS） -液氮
-RNA保存液
小心DNA污染！ -使用DEPC处理相关器材
TaqMan法
优缺点
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实时荧光定量PCR原理 相对定量
以各自样本中内参（housekeeping）基因为标杆，

实时荧光定量PCR (realtime PCR) 技术原理(Roche公司PPT)Real Real--time time PCRPCR Principle 罗氏诊断产品罗氏诊断产品((上海上海广州办事处应用科学部实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR PCR技术原理技术原理普通 PCR 技术原理基于嵌入式染料的荧光定量 PCR 原理基于探针的荧光定量 PCR 原理荧光定量 PCR 技术平台的功能开发实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR PCR技术原理技术原理普通 PCR 技术原理基于嵌入式染料的荧光定量 PCR 原理基于探针的荧光定量 PCR 原理荧光定量 PCR 技术平台的功能开发PCR 原理信号放大原理PCR 产物的电泳检测和分析SYBR Green IHybProbe TaqMan Real-time PCR原理实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR PCR技术原理技术原理普通 PCR 技术原理基于嵌入式染料的荧光定量 PCR 原理基于探针的荧光定量 PCR 原理荧光定量 PCR 技术平台的功能开发Green ICp(Crossingpoint or Ct (Cyclerthreshold实时荧光定量 PCR 的原理公式N =N 02n =N0(1+En logN= log(1+En +logN0 logN 0= -nlog(1+E+logN Cp =n= -logN 0/log(1+E +logN/log(1+E(Y=kX+b结论:Cp 值与模板起始浓度的负对数成线性关系N :扩增产物量 ;N 0:启始模板量 ; N :循环数 ; E :扩增效率(0 ≤E ≤1实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR PCR技术原理技术原理普通 PCR 技术原理基于嵌入式染料的荧光定量 PCR 原理基于探针的荧光定量 PCR 原理荧光定量 PCR 技术平台的功能开发FRET 现象 (Fluorescence resonanceenergy transferTaqMan probeTaqMan probe principle Roche Applied Science 16杂交探针HybProbe－罗氏专利性技术－杂交探针 for sequence specific detection of DNA Fluorescein LC Red Denaturation Annealing Elongation End of Elongation Roche Applied Science 17实时荧光PCR检测结果 Roche Applied Science 18New Probe Format : SimpleProbe Format -高效低成本的新型探针 Denaturation phase: SimpleProbe free in solution; emission of reporter dye is quenched R Q R = Reporter (Fluorescein Q = Quencher 5‘ 3‘-p Annealing phase: Fluorescence from reporter dye increases when probe is annealed to it‘s complementary target R primer 3‘ Q 3‘-p 5‘ 5‘ Roche Applied Science 19实时荧光PCR技术的优势实时荧光PCR技术的优势 PCR 特异性强：引物和探针“双”，避免检测的假阳特异性强性。

pcrrtpcr反应体系模板45ltagmixture50l025l荧光染料sybrgreen荧光标记的探针taqman探针法rtpcrmonitoringpcrsybrgreendyesybrgreen变性退火延伸rtpcrsybrgreenrtpcr10rtpcrmonitoringpcrtaqmantaqman法11rtpcrtaqman法12taqmanrtpcr13?绝对定量absolutequantificationaq病原体检测转基因食品检测基因表达研究?相对定量relativequantificationrq基因在不同组织中的表达差异药物疗效考核耐药性研究rtpcr14相对定量通过内标定量内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数rtpcr内标endogenouscontrol通常是18s28sactingapdh基因等看家基因在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定受环境因素影响小15rtpcr16rtpcrctpcr扩增循环数荧光域值threshold的设定在定量pcr中需要经过数个循环后荧光信号才能够被检测到一般以15个循环的荧光信号作为荧光本底信号
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实时荧光定量PCR的定义
PCR技术和荧光检测技术的结合
通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行 标记跟踪，实时在线监控反应过程，通过仪器和相应的软 件分析结果，对待测样品的初始模板进行定量或定性分析。
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RT-PCR技术的原理及试验流程
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RT-PCR技术的原理及试验流程
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RT-PCR技术的原理及试验流程
RT-PCR反应体系
模板
4.5μl
Tag mixture
5.0μl
F(F’)
0.25μl
R(R’)
0.25μl