RTPCR和realtimePCR原理及步骤

Real-time PCR(RT-PCR) 原理介绍实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。

本文试就其定量原理、方法及参照问题作一介绍。

一.实时荧光定量PCR原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

1.Ct 值的定义在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念—— Ct值。

C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图1所示）。

图1. Ct值的确定2.荧光域值（threshold）的设定PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ´SDcycle 6-153.Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系〔1〕，起始拷贝数越多，Ct值越小。

利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值（如图2所示）。

因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

图2. 荧光定量标准曲线4.荧光化学荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料〔2〕。

现将其原理简述如下：1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

Real-time PCR概論Introduction自從聚合酶連鎖反應(PCR)技術開發至今，幾乎是分子生物學中最被普遍使用的技術。

PCR主要是運用DNA的變性、黏合及延伸等三步驟的循環，連續擴增目標DNA片段。

在人類的疾病或其他動植物的疫病蟲害檢測上，以PCR 為基礎的技術都被廣泛的應用，例如多重聚合酶連鎖反應(Multiplex PCR)、巢式聚合酶連鎖反應(Nested PCR)、逢機增幅多態型-聚合酶連鎖反應(RAPD-PCR)、序列特徵化增幅區域(SCARs)、聚合酶連鎖反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)以及即時聚合酶連鎖反應(Real-time PCR)等。

其中以Real-time PCR近年被使用的頻率逐漸被提高，除了反應時間大量的縮短之外，儀器及技術亦不斷的創新進步，真正可以做到兼顧到準確度、敏感度及高效率的多項優點。

What is Real-time PCRReal-time PCR，顧名思義可以視為兩個部份，”Real-time”和PCR。

藉由PCR擴增的原理，使極微量的DNA放大，再經由光學系統達到即時偵測(Real-time)的效果。

每一次PCR擴增循環後，將其生成反應產物之數量記錄下來，待反應全部完成之後，以cycle number和生成產物做圖，可得到一反應曲線圖形，完整的呈現PCR反應中每一個cycle產物的生成情形，所以稱為即時定量PCR。

PCR vs. Real-time PCR一般的PCR反應，利用熱循環步驟，使目標基因以2n進行擴增，將微量的DNA目標片段放大。

最後，再利用洋菜膠電泳(agarose gel electrophoresis)進行結果分析。

我們可以經由產物的片段大小、擴增後產物生成量等等條件來判斷實驗結果是否成功。

必須等反應結束後再進行洋菜膠體電泳分析，對於反應過程並沒有做任何分析、記錄，故一般PCR反應又可稱為End-point PCR。

Real-time PCR中文译作“实时聚合酶链反应”，是一种最新发展的定量PCR技术。

该技术借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据CT值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量，较以往常用的终点定量的方法更加准确。

根据所使用的技术不同，荧光定量PCR 又可以分为TaqMan探针和SYBR Green I荧光染料两种方法。

Real-time PCR 所采用的专用PCR仪能够自动在每个循环的特定阶段对反应体系的荧光强度进行检测，实时的记录荧光强度的改变，从而对样品的浓度进行精确的定量。

RT-PCR是Reverse transcription PCR的简称，中文译作“逆转录聚合酶链反应”，是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。

首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。

RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。

作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。

无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。

用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT及基因特异性引物中的一种。

对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。

Real time RT-PCR是将Real time-PCR的方法用于RT-PCR中，目的也是为了对样品浓度进行精确控制。

RT-PCR和Real time-PCR是没有必然联系的，两种技术可以一起使用，就是Real time RT-PCR；也可以单独使用。

就是名称有点绕，逆转录PCR先出现，所以占用了RT-PCR这个简写，等Real time-PCR技术出现后，本来按照惯例，简写也是RT-PCR，但为了与逆转录PCR相区别，还是写成Real time-PCR。

rtqpcr原理RT-qPCR（real-time quantitative polymerase chain reaction）是一种准确、快速、灵敏的核酸定量技术，广泛应用于基因表达分析、病原体检测、基因型鉴定等领域。

本文将介绍RT-qPCR的原理及其在科研和临床中的应用。

RT-qPCR原理。

RT-qPCR是一种结合了逆转录（RT）和聚合酶链式反应（PCR）的技术，能够在同一反应体系中完成RNA的逆转录和DNA的扩增。

其原理主要包括以下几个步骤：1. RNA逆转录，首先，RNA模板经过逆转录酶的作用，转录成相应的cDNA。

逆转录过程中，逆转录酶利用RNA模板合成cDNA，同时RNA模板被降解，生成单链cDNA。

2. DNA扩增，接下来，利用PCR酶和引物对cDNA进行扩增。

PCR酶在不断的退火、延伸和连接过程中，将cDNA逐渐扩增成双链DNA。

3. 荧光信号检测，在扩增的过程中，荧光探针与扩增产物结合，释放出荧光信号。

荧光信号的强度与起始模板的数量成正比，通过检测荧光信号的变化，可以实时监测扩增过程。

RT-qPCR的应用。

RT-qPCR技术具有高灵敏度、高特异性和高准确性的特点，因此在科研和临床中有着广泛的应用。

1. 基因表达分析，科研人员可以利用RT-qPCR技术对特定基因在不同组织、不同时间点或不同处理条件下的表达水平进行定量分析，从而揭示基因在生物学过程中的功能和调控机制。

2. 病原体检测，临床上常用RT-qPCR技术对病原体（如病毒、细菌等）进行快速、准确的检测，对于传染病的早期诊断和流行病学调查具有重要意义。

3. 基因型鉴定，RT-qPCR技术可用于检测基因多态性和基因突变，对于遗传性疾病的诊断和个体化治疗具有重要意义。

总结。

RT-qPCR作为一种高效、准确的核酸定量技术，已经成为分子生物学和临床诊断中不可或缺的工具。

通过实时监测扩增过程中的荧光信号，可以快速获取目标核酸的数量信息，具有高通量、高灵敏度和高特异性的优势。

real-time PCR技术的原理及应用摘要：一、实时荧光定量PCR原理（一）定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

（二）实时原理 1、常规PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准一、实时荧光定量PCR原理（一）定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

（二）实时原理1、常规PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。

2、实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析3、如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析.4、几个概念：（1）扩增曲线：（2）荧光阈值：（3）Ct值：CT值的重现性：5、定量原理：理想的PCR反应： X=X0*2n非理想的PCR反应： X=X0 (1+Ex)nn：扩增反应的循环次数X：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率5、标准曲线6、绝对定量1）确定未知样品的 C(t)值2）通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量7、DNA的荧光标记：二、实时荧光定量PCR的几种方法介绍方法一：SYBR Green法（一）工作原理1、SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位2、SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光3、变性时，DNA双链分开，无荧光4、复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。

PCR反应体系的建立及优化:1、SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测2、Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准3、MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物4、反应Buffer 体系的优化5、反应温度和时间参数:由酶和引物决定6、其他与常规PCR相同（二）应用范围1、起始模板的测定；2、基因型的分析；3、融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。

实时荧光rt pcr法的原理实时荧光RT-PCR（Real-Time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）是一种能够同时进行逆转录和聚合酶链反应的分子生物学技术。

它被广泛应用于基因表达分析、病原体检测以及身份鉴定等领域。

实时荧光RT-PCR的原理基于传统的聚合酶链反应（PCR）技术和逆转录（RT）技术，同时引入了荧光探针并利用了荧光信号的强度和需求时间。

实时荧光RT-PCR包括三个主要步骤：逆转录、扩增反应和检测。

在逆转录步骤中，首先需要提取目标RNA（信使RNA）并将其转录成互补的DNA分子，这一步骤称为逆转录。

逆转录酶会选择性地识别RNA并在其在酶的作用下，将RNA分子的核苷酸链以互补的方式合成DNA。

逆转录后得到的互补DNA被称为cDNA（复制DNA）。

在扩增反应阶段，使用荧光标记的探针（primer），该探针携带有与目标基因或DNA片段相对应的序列，通过与已产生的cDNA结合形成稳定的双链，以达到快速产生大量特定DNA片段的目的。

此探针上还连接有一对荧光染料（如荧光素和对硫代苯磺酸），分子对之间就是存在荧光共振能量转移作用，探针参与到PCR反应中，能够很快产生荧光信号。

在检测步骤中，荧光信号的生成与实时PCR仪里的检测系统有关。

实时PCR仪会在每一个PCR循环中进行检测，同时记录下与反应体系相关的荧光信号强度，一般会以每一个PCR循环结束后所记录的荧光信号的增加来反映扩增的过程。

PCR进行若干个循环后，可以通过检测PCR体系的荧光信号增强的情况，了解起始的DNA模板的数量。

实时荧光RT-PCR的核心原理是通过连续监测PCR反应体系中的荧光信号的强度和相对荧光分子的次数，来反映PCR反应体系中目标序列（RNA/DNA）的起始浓度。

由于PCR反应是指数增加的，因此在反应初期，荧光信号的增长速度较慢。

但是，当PCR反应进入指数阶段时，荧光信号会急剧增加，最终达到一个平台，这里荧光信号的强度与初始模板的浓度有关。

实时定量RTPCR的原理及方法一、本文概述实时定量反转录聚合酶链式反应（Real-Time Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chn Reaction，简称实时定量RT-PCR）是一种在分子生物学领域中广泛应用的实验技术，用于检测和分析RNA样本中特定基因的表达水平。

该技术结合了反转录和聚合酶链式反应（PCR）的基本原理，通过实时监测PCR过程中产生的荧光信号，实现对基因表达量的高精度定量。

本文将对实时定量RT-PCR 的原理、实验方法以及应用进行详细的阐述，旨在为读者提供全面且深入的了解，从而能够在实际研究中灵活应用该技术，提高实验效率和准确性。

二、实时定量RT-PCR的基本原理实时定量反转录聚合酶链式反应（Real-Time Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chn Reaction，简称实时定量RT-PCR）是一种在DNA扩增过程中，通过荧光信号实时监测反应产物量的变化，从而得到起始模板量的分析方法。

这种技术结合了反转录（RT）和聚合酶链式反应（PCR）两个过程，使得RNA模板也能进行定量分析。

实时定量RT-PCR的基本原理可以分为三个步骤：反转录，PCR 扩增，以及实时荧光信号检测。

反转录步骤中，RNA模板在反转录酶的作用下，被转换成互补的DNA（cDNA）。

这个过程中，RNA的特异性序列被保留下来，为后续的PCR扩增提供了模板。

然后，PCR扩增步骤中，特定的DNA片段在DNA聚合酶的作用下，通过引物的引导，进行指数级的扩增。

在这个过程中，DNA的数量以2的n次方（n为循环次数）增长，从而大大提高了检测的灵敏度。

实时荧光信号检测步骤中，通过在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光标记的特异性探针，使得在DNA扩增的每一个循环中，都能实时监测到荧光信号的变化。

这种荧光信号的变化与DNA产物的量成正比，因此可以通过实时监测荧光信号，来推算出起始模板的量。