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恩诺沙星单克隆抗体的制备及酶联免疫分析方法的建立冯婷婷;刘一兵;李子颖;贾娟娟;袁志刚;韩世泉【期刊名称】《同位素》【年(卷),期】2009(022)001【摘要】采用抗恩诺沙星单克隆抗体建立酶联免疫吸附法(ELISA)用以检测恩诺沙星在动物源性食品中的残留.经方法学鉴定,本方法的检测范围为0.5～50 μg/L,灵敏度为0.2 μg/L,批内变异系数<10%,批间变异系数<20%.鸡肉、鱼肉、虾和蜂蜜样品的回收率分别为95.5%～107.5%、80.0%～101.3%、105.7%～122.7%和93.3%～111.3%.方法学鉴定结果符合免疫分析的基本要求.【总页数】5页(P5-9)【作者】冯婷婷;刘一兵;李子颖;贾娟娟;袁志刚;韩世泉【作者单位】中国原子能科学研究院,同位素研究所,北京,102413;中国原子能科学研究院,同位素研究所,北京,102413;中国原子能科学研究院,同位素研究所,北京,102413;中国原子能科学研究院,同位素研究所,北京,102413;中国原子能科学研究院,同位素研究所,北京,102413;中国原子能科学研究院,同位素研究所,北京,102413【正文语种】中文【中图分类】R446.61【相关文献】1.双酚A单克隆抗体的制备及酶联免疫分析方法的建立 [J], 许龙;章英;朱立鑫;范艳;赖肖;孟玮;胡娜;刘仁荣2.中药致肾毒性成分马兜铃酸A单抗制备及酶联免疫分析方法的建立 [J], 南铁贵;何素平;谭桂玉;李刚;王保民;黄璐琦3.镉离子单克隆抗体的制备及其间接竞争酶联免疫分析方法的建立 [J], 周静清;冯锋;邓安平;王玉珍4.吡虫啉单克隆抗体的制备及其间接竞争化学发光酶联免疫分析方法的建立 [J], 谢波;柳心梅;卢迪莎;程勇健;罗林;肖治理5.氟乐灵抗体的制备及其酶联免疫分析方法的建立 [J], 黄惠威;刘凤银;曾思敏;曾羲;钱振杰;施迪燊;聂玉丹;江海超;袁学文;穆洪涛因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
免疫印迹和酶联免疫吸附法检测糖尿病自身抗体的结果比较陆红; 周薇【期刊名称】《《实用医技杂志》》【年(卷),期】2007(014)018【摘要】目的:探讨免疫印迹(IB)和酶联免疫吸附法(ELISA)在糖尿病自身抗体检测中的差异。
方法:用IB和ELISA分别测定43例Ⅰ型糖尿病(T_1DM)和50例正常人血清中胰岛细胞抗体(IcA)、谷氨酸脱羧酶抗体(GADA)和胰岛素抗体(IAA),评价其敏感性和特异性。
结果:IB法检测T_1DM患者血清中IcA、GADA和IAA的阳性率分别为69. 7%、67.4%和23.3%。
3种抗体联合检测的敏感性和特异性分别是93.0%和98.0%;ELISA检测IcA、GADA和IAA的阳性率分剐为72.1%、81.4%和41.9%,3种抗体联合检测的敏感性和特异性分别是97.7%和88%。
结论:IB法检测糖尿病自身抗体的敏感性低于ELIsA(P<0.05);而IB法的特异性明显高于ELISA(P<0.05)。
【总页数】2页(P2377-2378)【作者】陆红; 周薇【作者单位】北京大学深圳医院广东深圳 518036【正文语种】中文【中图分类】R587.1【相关文献】1.免疫印迹法检测1型糖尿病自身抗体的临床应用 [J], 冯春颜;张永顶;胡纪文2.免疫印迹法检测老年2型糖尿病患者血清胰岛自身抗体的临床价值 [J], 胡兰萍;顾萍;王坚;邵加庆;杜宏;王扬天;卢斌;彭丽3.免疫印迹法检测胰岛自身抗体系列在糖尿病分型诊断中的应用 [J], 邱阳;郭慧淑;刘越坚;单路娟;郭莉4.化学发光法和免疫印迹法检测糖尿病自身抗体的结果分析 [J], 高泽斌;马悦;李晓兰5.化学发光酶免疫法和免疫印迹法检测糖尿病自身抗体的结果分析 [J], 赵凯因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
促卵泡激素酶促化学发光免疫分析试剂盒的研制杨超一;韩世泉;张雪峰;贾娟娟;刘一兵【期刊名称】《同位素》【年(卷),期】2009(022)001【摘要】采用双抗体夹心法建立了测定人血清FSH酶促化学发光免疫分析方法.本方法的测量范围为1.5～100 IU/L,灵敏度为0.36 IU/L,批内变异系数为1.0%～1.6%,批间变异系数为4.0%～4.6%,回收率为90.6%～117.8%,稀释实验测定值与稀释度呈线性相关,相关系数r=0.990.与TSH的交叉率<0.23%,与LH和HCG的交叉率分别<0.16%和<0.27%.与贝克曼化学发光免疫分析方法测定的临床值进行比较,相关性方程为y=0.85x-0.03,相关系数r=0.954.与免疫放射分析试剂盒进行比较,相关性方程为y=0.97x+5.29,相关系数r=0.965,与放射免疫分析试剂盒,进行比较,相关性方程为y=0.95x-3.82,相关系数r=0.954.方法学鉴定结果符合免疫分析的基本要求.【总页数】6页(P34-39)【作者】杨超一;韩世泉;张雪峰;贾娟娟;刘一兵【作者单位】中国原子能科学研究院,同位素研究所,北京,102413;中国原子能科学研究院,同位素研究所,北京,102413;中国原子能科学研究院,同位素研究所,北京,102413;中国原子能科学研究院,同位素研究所,北京,102413;中国原子能科学研究院,同位素研究所,北京,102413【正文语种】中文【中图分类】R446.61【相关文献】1.3种β-兴奋剂化学发光酶免疫试剂盒分析检测方法的评价 [J], 宁霄;张伟清;梁瑞强;曹进;张庆生2.硫酸去氢表雄酮定量测定试剂盒(化学发光免疫分析法)的研制及性能评价 [J], 苏立;贾晨路3.人促卵泡激素酶催化化学发光免疫分析检测试剂的研发 [J], 施利琴;周晔4.催乳素酶促化学发光免疫分析试剂盒的研制 [J], 贾娟娟;刘一兵;许文革;张雪峰5.HBeAb光激化学发光免疫分析试剂盒的研制 [J], 马强;贺安;董志宁;刘天才;邹丽萍;林冠峰;李明;吴英松因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
人胰岛素自身抗体（IAA）酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用预期应用ELISA法定量测定人血清、血浆或其它相关液体中胰岛素自身抗体（IAA）含量。
实验原理本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中IAA水平。
用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入IAA抗原、生物素化的抗人IAA抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。
TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的IAA呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。
试剂盒组成及试剂配制1.酶联板：一块（96孔）2.标准品（冻干品）：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为400ng/ml，做系列倍比稀释后，分别稀释200ng/ml，100ng/ml，50ng/ml，25 ng/ml，12.5ng/ml，6.25ng/ml，3.12ng/ml，样品稀释液直接作为标准浓度0ng/ml，临用前15分钟内配制。
如配制200ng/ml标准品：取0.5ml400ng/ml的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。
3.样品稀释液：1×20ml/瓶。
4.检测稀释液A：1×10ml/瓶。
5.检测稀释液B：1×10ml/瓶。
6.检测溶液A：1×120ul/瓶（1:100）临用前以检测稀释液A1:100稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔100ul），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。
如1ul检测溶液A加99ul检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。
7.检测溶液B：1×120ul/瓶（1:100）临用前以检测稀释液B1:100稀释。
稀释方法同检测溶液A。
人胰岛素酶联免疫分析法的建立贾娟娟;刘一兵;陈键;许文革;官国英;韩世泉【期刊名称】《同位素》【年(卷),期】2007(020)001【摘要】采用两株抗胰岛素单克隆抗体,一株包被聚苯乙烯板、另一株标记辣根过氧化物酶,建立了测定人胰岛素的双抗体夹心酶联免疫分析法.方法学研究表明,本方法的灵敏度为1.7 mIU/L,曲线范围5～160.mIU/L,批内、批间变异系数分别小于11%、15%,回收率96.4%～111.1%;高浓度胰岛素血清样品系列倍比稀释后测定,测定值与稀释度呈线性相关,相关系数0.998;38例健康人血清样品测定值为3.6～10.8 mIU/L.该方法与人胰岛素放射免疫分析法测定结果的相关性良好,r=0.97.【总页数】5页(P24-28)【作者】贾娟娟;刘一兵;陈键;许文革;官国英;韩世泉【作者单位】中国原子能科学研究院同位素研究所,北京,102413;中国原子能科学研究院同位素研究所,北京,102413;中国原子能科学研究院同位素研究所,北京,102413;中国原子能科学研究院同位素研究所,北京,102413;中国原子能科学研究院同位素研究所,北京,102413;中国原子能科学研究院同位素研究所,北京,102413【正文语种】中文【中图分类】R392-33;Q814.9【相关文献】1.谷物中伏马菌素B1酶联免疫分析法的建立 [J], 刘师文;何庆华;邹龙;许杨2.热加工食品中α-乳白蛋白双抗夹心酶联免疫分析法的建立 [J], 张挺3.恩诺沙星残留酶联免疫分析法的建立 [J], 穆洪涛;李嘉慧;刘凤银;黄玉琦4.基于单克隆抗体的双酚A间接竞争酶联免疫分析法的建立 [J], 张玉超;刘旭东5.恩诺沙星残留酶联免疫分析法的建立 [J], 穆洪涛;李嘉慧;刘凤银;黄玉琦因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
单克隆抗体酶联免疫方法检测人血清胰岛素原及其应用贾恩志;李爱香;徐振霞【期刊名称】《世界华人消化杂志》【年(卷),期】2005(13)13【摘要】目的:建立灵敏、特异的检测人血清中胰岛素原的酶联免疫吸附试验并应用于临床与流行病学研究. 方法:选择2种mAb并引入生物素与亲和素放大系统来建立酶联免疫分析方法,一种抗C肽mAb结合到酶反应板上作为固相抗体,另一种生物素标记的抗胰岛素抗体作为液相抗体,将该检测方法应用于流行病学研究(n=1196). 结果:本法灵敏度0.83 pmol/L,与1 200 pmol/L胰岛素、3 960 pmol/L C肽无交叉反应,线性标准范围0.83-142 pmol/L.批内变异系数小于11.4%,批间变异系数小于11.2%.流行病学研究结果显示胰岛素原的含量与体重指数、腰围、收缩压、舒张压、胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇、危险因素数目呈正相关, 与高密度脂蛋白胆固醇呈负相关. 结论:本法适用于在临床研究及流行病学研究中检测人血清中胰岛素原的含量.β细胞功能受损与纤溶功能的紊乱可能是高胰岛素原与心血管危险因素关联的原因.【总页数】5页(P1562-1566)【关键词】胰岛素原;人血清;酶联免疫方法;单克隆抗体;检测;流行病学研究;低密度脂蛋白胆固醇;高密度脂蛋白胆固醇;mol/L;酶联免疫分析方法;酶联免疫吸附试验;心血管危险因素;抗胰岛素抗体;变异系数;生物素标记;放大系统;固相抗体【作者】贾恩志;李爱香;徐振霞【作者单位】南京医科大学第一附属医院心内科;山东省济宁市第二人民医院急诊科【正文语种】中文【中图分类】R587.1;R446.112【相关文献】1.人血清胰岛素原单克隆抗体夹心酶联免疫法的建立 [J], 黎明;杨静2.单克隆抗体酶标法检测人血清真胰岛素及其应用 [J], 马建锋;贾恩志;陈士伟3.抗人AFP单克隆抗体酶联免疫检测法的建立及其应用 [J], 房国坚;边敏章4.抗人AFP单克隆抗体酶联免疫检测法的建立 [J], 房国坚;边敏章5.抗人AFP单克隆抗体酶联免疫检测法 [J], 楼锦新因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
酶联免疫标记技术酶联免疫标记技术（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种常用于检测生物样本中特定蛋白质、抗体、荷尔蒙、抗原等的定量和定性方法。
该技术利用酶与抗原-抗体复合物相互作用的原理，通过酶的催化作用将底物转化为可检测的产物，从而实现对目标分子的检测和测量。
ELISA技术通常分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和夹心ELISA等不同类型，但它们的基本原理相似。
以下是酶联免疫标记技术的基本步骤：1．包被阶段（Coating）：将要检测的抗原或抗体吸附在固体表面上，如微孔板的底部或壁上。
2．阻断阶段（Blocking）：用非特异性蛋白质（如牛血清蛋白、鱼胶等）阻断未被包被的表面，以减少非特异性结合。
3．结合阶段（Binding）：将待测样本加入到包被的微孔板中，目标分子与包被的抗体或抗原发生特异性结合。
4．洗涤阶段（Washing）：使用缓冲液洗去未结合的样本成分，以减少背景干扰。
5．检测阶段（Detection）：加入与目标分子特异性结合的检测抗体，形成抗原-抗体复合物。
6．洗涤阶段（Washing）：再次使用缓冲液洗去未结合的检测抗体。
7．酶标记阶段（Enzyme Labeling）：加入与检测抗体特异性结合的酶，如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）等。
8．底物加入阶段（Substrate Addition）：加入底物，酶催化底物产生可检测的产物。
9．测量阶段（Measurement）：使用光度计或荧光测量仪器测量产物的光学密度或荧光强度，从而定量目标分子的浓度。
ELISA技术具有灵敏度高、特异性强、操作简便、成本较低等优点，因此在医学诊断、生物医学研究、药物开发等领域被广泛应用。
酶联免疫试验操作方法酶联免疫试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISA）是一种常用的实验方法，用于检测样本中特定抗原或抗体的存在与数量。
ELISA方法的原理是将特定的抗原或抗体与检测物质打标记，然后通过可以与标记物结合的特异性抗体反应来检测目标物质的存在与浓度。
下面将介绍ELISA的操作方法。
1. 试剂准备：(1) 底物：将所需底物溶于缓冲液，根据实验需求选择适当的底物，如TMB、ABTS等。
(2) 酶标记抗体：将所需的酶标记抗体充分稀释至适当浓度，通常为1:1000至1:10000。
(3) 试样：将待测样品按照需要进行稀释或处理。
如果检测抗体，则需将样品加入酶标记抗体反应，在室温下孵育。
(4) 洗涤缓冲液：常见的洗涤缓冲液为PBS-T（含有Tween 20）。
准备好PBS-T或其他适当的洗涤液，以用于洗涤步骤。
(5) 制备标准曲线：根据实验需求，选择适当的标准品并制备浓度梯度的标准曲线。
2. 板涂覆：(1) 取出ELISA板，将所需抗原或抗体稀释至适当浓度，加入每个孔中。
每个样品需设置多个平行孔，以进行可靠的实验结果分析。
(2) 封闭非特异性结合位点：将孔板封闭，并将其置于37C恒温箱中孵育1至2小时。
3. 底物-标记物结合：(1) 倾倒每个孔的液态，并在每个孔中分别加入酶标记的抗体。
通过抗体与抗原或抗体结合，在孔中形成免疫复合物。
(2) 将孔板置于恒温箱中，在室温下孵育1至2小时，促使免疫反应的发生。
4. 孔洗涤：(1) 将液体倾倒，然后用洗涤缓冲液充分洗涤每个孔，以去除未结合的抗体。
(2) 每孔洗涤的次数及洗涤时间依实验需求而定，通常为3至5次，每次洗涤持续约30秒。
5. 底物反应：(1) 将稀释好的底物加入每个孔中，底物与酶标记结合物质反应，形成可见的颜色变化。
(2) 在室温下进行底物反应，反应时间依抗体的检测结果而定，通常为15分钟至1小时。
酶联免疫吸附法检测胰岛素的初步研究
石国富;胡远峰;王鉴波;葛永新;张洪德
【期刊名称】《中国糖尿病杂志》
【年(卷),期】1994(000)001
【摘要】报道ＥＬＩＳＡ竞争法检测人血清胰岛素与人胎胰组织培养液内胰岛素含量，应用自制的胰岛素抗体，豚鼠ＩｇＧ抗体及酶标记胰岛素。
本方法可检测的范围是５～４８６０ｐｍｏｌ／Ｌ，非特异性结合ＯＤ＜０．０４，方法回收率为１０６％，批内ＣＶ５．９％，批间ＣＶ７．４％。
３０例正常人空腹血清胰岛素均值４５ｐｍｏｌ／Ｌ，与放射免疫分析法比较，其相关系数ｒ＝０．９６７３。
【总页数】3页(P31-33)
【作者】石国富;胡远峰;王鉴波;葛永新;张洪德
【作者单位】上海市第一人民医院糖尿病研究室
【正文语种】中文
【中图分类】R446.6
【相关文献】
1.重组多肽酶联免疫吸附法检测抗LKM-1抗体的初步应用 [J], 王文凯;李永哲;段秀杰
2.酶联免疫吸附测定检测人血清胰岛素抗体的研究 [J], 冯根宝;王燕燕
3.夹心酶联免疫吸附试验法与PCR法对检测牛I型疱疹病毒结果的比较研究 [J], 张光磊;魏田田;高月;梁云坤
4.A蛋白酶联免疫吸附法检测葡萄卷叶病毒的研究用离体微嫁接法快速检测苹果潜
隐病毒 [J], 何水涛;周厚成;刘崇怀;卢其真
5.胆汁泡蛋白酶联免疫吸附检测法的建立与初步临床应用 [J], 蔡端;项建斌;张延龄;马保金
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收稿日期:2006-06-21;修回日期:2006-11-16作者简介:贾娟娟(1979～),女(汉族),河南人,硕士,免疫分析专业第20卷第1期2007年2月同 位 素Journal o f Isoto pesV ol.20 N o.1Feb.2007人胰岛素酶联免疫分析法的建立贾娟娟,刘一兵,陈 键,许文革,官国英,韩世泉(中国原子能科学研究院同位素研究所,北京 102413)摘要:采用两株抗胰岛素单克隆抗体,一株包被聚苯乙烯板、另一株标记辣根过氧化物酶,建立了测定人胰岛素的双抗体夹心酶联免疫分析法。
方法学研究表明,本方法的灵敏度为1.7mI U /L ,曲线范围5～160mIU /L ,批内、批间变异系数分别小于11%、15%,回收率96.4%～111.1%;高浓度胰岛素血清样品系列倍比稀释后测定,测定值与稀释度呈线性相关,相关系数0.998;38例健康人血清样品测定值为3.6～10.8mIU /L 。
该方法与人胰岛素放射免疫分析法测定结果的相关性良好,r =0.97。
关键词:胰岛素;单克隆抗体;酶联免疫分析;放射免疫分析中图分类号:R392-33;Q 814.9 文献标识码:A 文章编号:1000-7512(2007)01-0024-05The Establishment of an Enzyme Linked Immunosorbent Assay for InsulinJIA Juan -juan ,LIU Yi -bing ,CH EN Jian ,XU Wen -ge ,G UAN Guo -ying ,H AN Shi -quan(Department of Isotope ,China I nstitute o f Atomic Energy ,Beij ing 102413,China )A bstract :Tw o monoclonal antibodies ag ainst insulin a re applied in tw o -site enzy me linkedimmuno so rbent assay (ELISA ).One of the antibo dies is imm obilized on the microtiter plate ,the other is labelled w ith H RP.The sensitivity of the assay is 1.7mIU /L and the re -covery is 96.4%～111.1%.The intra -and interassay CV are below 11%and 15.0%re -spectively.The co rrela tion coefficient betw een measured and cliluted values is 0.998after serial dilutions of the sam ples using hig h co ncentratio n of insulin.The value for normal samples (n =38)is 3.6～10.8mIU /L.Co mpared w ith RIA ,the correlatio n coefficient is acceptable (r =0.97).Key words :insulin ;monoclonal antibody ;enzy me -linked im muno sorbent assay ;radioim -m unoassay 糖尿病(Diabetes M ellitus ,DM )是一种多病因的代谢性疾病,特点是慢性高血糖、伴随因胰岛素分泌减少或作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱。
糖尿病在我国及全世界发病率都很高,并发症问题也非常严重。
临床诊断中,血液胰岛素含量的测定对于了解糖尿病的发生、发展、预后及制定适当的治疗方案非常重要[1]。
1959年Yallow 等[2]首次应用放射免疫分析法测定胰岛素。
40余年来,胰岛素的免疫测定方法有了很大改进,为避免放射性的使用,酶联免疫分析、发光免疫分析等先后发展起来[3～6]。
在实际应用中,与放射免疫分析方法相比,酶联免疫分析也显示出了众多的优越性[7]。
由于受血液中胰岛素不均一性的影响,采用双抗体夹心法的酶联免疫分析较放免法测定胰岛素的特异性增高[8,9],因此,本工作拟建立人胰岛素酶联免疫分析方法。
1 实验材料Spectra酶标仪:奥地利S LT公司产品;96孔酶标板:美国Co star公司产品;抗胰岛素单克隆抗体分别由Biode sign公司、原子高科股份有限公司提供;胰岛素、辣根过氧化物酶(H RP)、四甲基联苯胺(TMB)、过氧化氢(H2O2):均为美国Sigm a公司产品;胎牛血清:北京元亨圣马生物技术研究所产品;胰岛素放射免疫分析试剂盒:原子高科股份有限公司提供;胰岛素酶联免疫分析试剂盒:瑞典M erco dia公司产品;人血清样本由中国核工业北京401医院提供;实验所用化学试剂均为分析纯。
包被缓冲液:0.1mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液;封闭液:含1%BSA的0.05m ol/L pH 7.4磷酸缓冲液(PB);酶标抗体稀释液:含0.2% BSA、0.05%Tw een的0.025m ol/L pH7.4 PB;洗涤液:含0.05%Tw een的0.025mol/L pH7.4PB。
2 实验方法2.1 人胰岛素单克隆抗体酶标试剂的制备[10]称取0.5mg H RP溶于0.05mL双蒸水中,搅拌下加入新鲜配制的0.06mol/L高碘酸钠(N aIO4)水溶液0.05mL,4℃静置30min;搅拌下加入0.16mo l/L乙二醇水溶液0.05m L,室温下静置30min;将0.5m g(170μL)抗胰岛素单克隆抗体的水溶液加入上述溶液中,混匀后,装入透析袋对0.05mol/L pH9.5的碳酸盐缓冲液4℃透析过夜;次日,将溶液自透析袋取出,加入0.02m L(5g/L)新配制的硼氢化钠蒸馏水溶液,混匀,4℃静置2h;装入透析袋在4℃下对0.02m ol/L pH7.4的PB透析,之后加等体积甘油(分析纯)-20℃保存备用。
2.2 人胰岛素单克隆抗体包被酶标板的制备用包被缓冲液将包被用抗体稀释至5mg/ L,以200μL/孔加入聚苯乙烯酶标板中,置4℃过夜。
次日,倾去包被液,加入250μL/孔封闭液,37℃封闭1h。
弃去封闭液,自然凉干。
2.3 人胰岛素标准品的配制胎牛血清56℃灭活4h,3000r/min离心20m in后,上清液用于配制标准品。
将不同量的人胰岛素加入到灭活后的胎牛血清中,配制胰岛素浓度分别为5、10、20、40、80、160m IU/L的标准品,用胰岛素放射免疫分析试剂盒(分析灵敏度1.5m IU/L,检测范围0～160mIU/L)校正该标准品的浓度。
校正后的标准品以0.5m L 分装,冻干,于2～8℃保存。
2.4 底物溶液和终止剂将TMB和H2O2分别溶于0.15mo l/L pH 5.0的柠檬酸-醋酸缓冲液中,使其浓度分别为0.6、1.2mmo l/L,使用时以体积比1∶1混合即为底物溶液。
终止剂为2mol/L的H2SO4。
2.5 分析程序在包被有抗体的酶标板中,每孔加50μL标准/血样、150μL酶标抗体混匀,37℃反应3h;洗涤拍干;加入底物溶液200μL,37℃显色15 m in,加入50μL2m ol/L的硫酸终止反应,测定OD450。
以胰岛素标准品浓度(mIU/L)为横坐标,相应的OD450值为纵坐标,在半对数坐标纸上绘制标准曲线。
根据样品的OD450值,从标准曲线上查出相应的胰岛素浓度,或者使用仪器内的计算程序直接获得样品中胰岛素浓度。
2.6 方法学比较用本方法与放射免疫分析法同时测定血清样本90例,与Mercodia ISO-Insulin ELISA试剂盒(10-1128-01)同时测定血清样本46例,对测定结果进行相关性分析。
3 结果与分析3.1 酶标抗体工作浓度的选择胰岛素单克隆抗体包被浓度为5mg/L时,观察不同酶标抗体浓度对标准曲线的影响,结果示于图1。
由图1可知,从标准曲线的范围结合分析灵敏度,选择酶标抗体稀释度为1∶50000为酶标抗体工作浓度。
3.2 包被浓度的选择用包被缓冲液将包被用抗体稀释至15、10、5、2mg/L,酶标抗体稀释度为1∶50000时,观察不同包被浓度对标准曲线的影响,结果示于图2。
由图2可知,当包被浓度大于5mg/L时对标准曲线影响不大,提示包被浓度为5mg/L即可满足要求。
25 第1期 贾娟娟等:人胰岛素酶联免疫分析法的建立3.3 加样体积的选择加样体积分别为25μL 标准、100μL 酶标抗体;50μL 标准、150μL 酶标抗体;50μL 标准、100μL 酶标抗体,观察其标准曲线的变化。
三种情况下标准曲线示于图3。
根据分析灵敏度和各标准点OD 450,选择加样体积为50μL 标准、150μL 酶标抗体。
图1 酶标抗体不同稀释度下的标准曲线■———1∶10000;●———1∶20000;▲———1∶50000;●———1∶100000图2 不同包被浓度下的标准曲线◆———15mg /L ;■———10mg /L ;▲———5mg /L ;◆———2mg /mL图3 胰岛素酶联免疫分析加样体积的选择■———25μL 标准、100μL 酶标抗体;●———50μL 标准、150μL 酶标抗体;▲———50μL 标准、100μL 酶标抗体3.4 反应时间的选择在包被有固相抗体的酶标板微孔中加入胰岛素标准品、酶标抗胰岛素抗体混匀后分别在37℃反应1、2、3、5h ,考察反应时间对标准曲线的影响,结果示于图4。
根据分析灵敏度和标准曲线,确定反应时间为37℃反应2h 。
3.5 免疫分析一步法与两步法免疫分析两步法具体步骤为固相抗体、胰岛素标准品、酶标抗体稀释液混和,37℃反应3h ,洗涤;加入酶标抗体37℃反应3h ,洗涤,显色。
一步法、两步法标准曲线示于图5。
根据免疫结合及分析灵敏度确定一步法优于二步法。
图4 反应时间的选择◆———1h ;▲———2h ;●———3h ;■———5h图5 胰岛素酶联免疫分析一步法与两步法■———两步法;▲———一步法3.6 方法学鉴定3.6.1 标准曲线与灵敏度 胰岛素酶联免疫分析标准曲线示于图6。
同时测定20个“零”标准的OD 450,以其平均值加2s 在标准曲线上对应的值为1.7m IU /L ,即本方法的灵敏度位为1.7m IU /L 。
