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实验一RT-PCR法钓取小鼠肝脏GAPDH基因一、TRlzol试剂提取小鼠肝脏总RNATRIzol RNA提取试剂盒是由GIBCOBRL公司推出的产品，其操作方法简捷、方便，lh之内即可完成，所制备的RNA可用于cDNA合成及Northern blot等。
【试剂】TRlZOL试剂氯仿异丙醇75％乙醇（DEPC水配制）无RNase水【操作方法】（1）收获细胞1~5×106；或50-100mg组织，加TRlzol试剂lml匀浆。
（2），移入1.5ml Ep管中，室温静置5min。
（3）每1ml TRIZOL中加氯仿0.2m1，摇振15s，置室温2～3min。
（4）4℃离心，12,000g×15min。
（5）仔细吸取上层水相，移至另一Ep管中。
（6）加0.5ml异丙醇，混匀，置室温10min。
（7）4℃离心，12,000g×10min。
（8）弃上清，加75％乙醇1m1，轻轻摇振，充分洗涤沉淀，4℃离心，7500g×5min。
（9）弃上清，真空干燥后，沉淀重悬于50μl无RNase水中。
一70℃保存备用。
二、核酸的定量（1）分光光度法测定核酸浓度。
组成核酸分子的碱基，均具有一定的吸收紫外线特性，最大吸收波长为250~270nm之间。
例如腺嘌呤的最大紫外线吸收值在260.5nm，胞嘧啶：267nm 鸟嘌呤：276nM胸腺嘧啶：264.5 nm尿嘧啶259nm。
这些碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后，其最大吸收峰不会改变，但核苷酸最大吸收波长是260nm，吸收低谷在230nm，这个物理特性为紫外分光光度法测定核酸溶液浓度提供了基础。
在波长260nm紫外线下，1OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50ug/ ml；单链DNA或RNA为40ug/ml；单链寡核苷酸为20ug/ml。
另外，还可以通过测定260nm和280nm的紫外线吸收值，然后根据其比值来估计核酸的纯度。
DNA样品的比值为1.8，RNA样品的比值为2.0。
分子生物学基本实验操作1.DNA提取：DNA提取是分子生物学中的基础实验操作，目的是从生物组织或细胞中提取出纯净的DNA样品。
常用的DNA提取方法包括酚氯仿法、盐法和商业化提取试剂盒。
该实验操作通常包括细胞破碎、蛋白质去除、DNA沉淀和洗涤等步骤。
2.PCR：聚合酶链反应（PCR）是分子生物学中常用的方法，用于扩增特定的DNA片段。
PCR通过加入DNA模板、引物、碱基和聚合酶，利用循环反应的方式在体外合成特定序列的DNA。
PCR通常包括三个步骤：变性、退火和延伸。
3.凝胶电泳：凝胶电泳是一种分离和分析DNA、RNA和蛋白质的常用方法。
通过将待测样品加载到凝胶中，然后通过电场使DNA、RNA或蛋白质在凝胶中迁移，可以根据迁移速度和分子大小进行分离和定性。
4. Western blot：Western blot是一种用于检测特定蛋白质的方法。
该方法通过将待测样品进行电泳分离，然后将蛋白质转移到膜上，并用特异性抗体与目标蛋白质结合，最后再用染色剂或化学发光来检测目标蛋白质的存在。
5.DNA克隆：DNA克隆是将DNA片段插入到载体DNA中的过程，用于研究和重组DNA。
常用的DNA克隆方法包括限制性内切酶切割、连接酶反应和转化。
通过将DNA片段插入载体中并转化至宿主细胞，可以大量复制目标DNA并随后进行研究。
6.基因测序：基因测序是确定DNA或RNA序列的方法，用于分析基因组、转录组和序列变异。
常用的基因测序方法包括链终止法（Sanger测序）和下一代测序（NGS）。
通过测序，可以获取DNA或RNA的序列信息，并进一步研究基因功能和变异。
7.基因表达分析：基因表达分析通过检测RNA水平来研究基因的表达情况。
常用的方法包括实时定量PCR、Northern blot和转录组测序。
这些方法可以定性和定量地研究基因的表达水平，并帮助解析基因调控和信号通路。
这些是分子生物学的一些基本实验操作。
当然，随着技术和方法的不断发展，分子生物学领域中还有许多其他的实验操作，用于研究生物分子结构和功能。
分子生物学实验指导主编:于冰马春泉高传军杨峰山主审:李海英黑龙江大学生命科学学院2006 年 3月目录绪论分子生物学实验安全注意事项及分子生物学实验室所需要的仪器设备................................................... 1 实验一植物基因组 DNA 的分离.................................... 6 实验二 RNA 的分离................................................... 11 实验三 DNA/RNA的琼脂糖凝胶检测.............................. 15 实验四 DNA/RNA浓度、纯度的测定及浓度的调整............ 21 实验五聚合酶链式反应(PCR .................................... 24 实验六随机扩增多态性 DNA 反应(RAPD ..................... 28实验七甜菜 M14品系 AFLP 分析.................................... 32 实验八生物信息学 (49)前言黑龙江大学生命科学学院自成立以来,相继成立了生物工程专业,生物技术专业,生物制药专业和食品科学与工程专业。
分子生物学是一门二十一世纪的前沿学科,而实验操作是分子生物学的一个重要组成部分。
我们结合了我院现有的仪器设备及材料情况,为本科生设立了八个分子生物学实验项目(包括一个综合性实验项目 ,以使学生掌握分子生物学领域中最基本的实验技能。
本书编写充分考虑了实验的系列操作性,比如从基因组 DNA 、总 RNA 的提取到琼脂糖凝胶检测,从 DNA 浓度的调整到 PCR 技术,从分子标记技术到生物信息学分析等,完全贯穿了分子生物学的基本实验技术。
对生命科学学院的本科生来说是一本很好的实验教材。
分子生物学实验指导(总45页) -CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1-CAL-本页仅作为文档封面，使用请直接删除分子生物学实验指导分子生物学实验课程的内容是从亚克隆一个基因直到最终表达出该基因产物的一个完整的科研项目。
以表达纳豆激酶为例，从已经克隆在pMD-18-T 载体上的纳豆激酶酶原基因上用PCR扩增出837bp的纳豆激酶成熟肽基因片段，与T载体连接后转入DH5菌中筛选鉴定，然后用双酶切下纳豆激酶成熟肽基因片段，插入带有6个组氨酸标签的原核表达载体pET-Trx，在表达菌BL(21)DE3中诱导表达出纳豆激酶蛋白质并用SDS-PAGE鉴定。
整套实验围绕纳豆激酶基因的亚克隆、重组、转化、筛选直到表达这一研究顺序进行操作。
其间共涉及学习约11种基因操作的基本技术，我们按这些操作技术出现的先后顺序分别编为实验一至实验十一。
各个实验之间具有很强的逻辑性和连贯性，前一个实验的结果就是下一个实验的原料。
整套实验设计实际上是一个基因操作实验平台，随时能根据需要更改外源基因和表达载体或进一步扩充实验内容。
我们在每年的教学实践中会不断增加目的基因和表达载体的种类，以便于学生实验小组能够从事不同的项目，减少雷同，增加兴趣。
分子生物学实验的宗旨是让学生在独立实践操作中学习分子生物学的基本研究方法和体会分子生物学研究的严密逻辑和科研理念。
实验教学的组织方式是科研项目式管理，即在教师的总体指导下，在给定的实验材料和实验条件的基础上，让学生独立思考、自行规划实验流程、制定实验计划、准备实验材料、动手操作、整理和分析实验结果，最后完成实验项目，写出实验论文。
因此学生在实验前要认真预习实验内容，结合学过的分子生物学原理，弄懂每一步实验的目的和原理，了解实验的内容和总体实验方案，写出分子生物学大实验《开题报告》，交教师审阅和讨论修改后才能进入实验室操作。
在实验过程中，教师不干涉学生的实验安排和操作程序，仅以导师的身份对学生的实验操作进行现场巡回指导、回答学生的疑问、为学生示范一些高档实验仪器和软件的使用，提供公用的试剂（如酶）等，并对学生的每一步实验结果进行评价和把关。
高中生物实验指南：分子生物学实验操作手册1. 简介分子生物学是研究生物体内分子结构、组成、功能以及相互作用的科学。
在高中生物学课程中，通过进行一系列分子生物学实验，可以加深对基因、DNA、RNA等内容的理解，并培养学生动手实践和科学探究的能力。
本操作手册将介绍一些适合高中副标准课程的基本分子生物学实验，帮助教师和学生更好地开展这方面的实验教学。
2. 实验一：提取DNA2.1 实验目的了解DNA的结构和提取过程，并掌握提取DNA的基本方法。
2.2 材料与仪器•成熟香蕉或其他植物材料•盐水溶液（含氯化钠）•蛋白酶（如葡萄胺酸酶）•洗涤剂（如洗衣粉）•咖啡滤纸或滤纸漏斗•烧杯•酒精1.将香蕉剥皮后放入砧板上，用刀将香蕉捣碎成泥状。
2.在烧杯中加入适量的盐水溶液，并将捣碎的香蕉放入其中搅拌均匀。
3.加入少量蛋白酶和洗涤剂，再次搅拌均匀，让细胞破裂释放DNA。
4.将混合物过滤到另一个烧杯中，通过滤纸除去大颗粒的残渣。
5.将过滤后的溶液倒入试管中，并缓慢地倾斜试管，在溶液与酒精接触的界面处，会出现白色粘稠物质，即提取到的DNA。
2.4 实验结果及分析实验中提取到的DNA呈现为白色细丝状物质。
通过这个实验可以观察到DNA 在水相和酒精相之间的界面上凝聚堆积。
说明了DNA在酒精中不溶性，从而便于提取。
3. 实验二：PCR扩增3.1 实验目的了解聚合酶链式反应（PCR）的原理和基本步骤，并能够进行PCR扩增实验。
3.2 材料与仪器•PCR试剂盒（含模板DNA、引物、聚合酶等）•热循环仪•PCR试管或反应管1.准备PCR反应体系，按照试剂盒说明书的要求加入模板DNA、引物和聚合酶等。
2.将装有反应溶液的PCR管放入热循环仪中。
3.设置PCR的温度程序，包括变性、退火和延伸阶段。
4.启动热循环仪开始PCR扩增反应。
5.完成PCR后，可以通过凝胶电泳等方法检测扩增产物。
3.4 实验结果及分析通过PCR扩增，可以在较短的时间内大量复制并放大目标基因片段。
分⼦⽣物学实验指导（精）分⼦⽣物学实验指导⽣物技术教学室编宁夏⼤学⽣命科学学院2008年8⽉实验⼀分⼦⽣物学实验技术多媒体演⽰[⽬的要求]通过多媒体试验录像进⼀步掌握分⼦⽣物学基本操作技术。
[教学⽅式]多媒体光盘演⽰。
[实验内容]基本的分⼦⽣物学实验操作技术包括核酸凝胶电泳技术；质粒提取；转化；重组体的筛选；PCR技术等。
实验⼆琼脂糖凝胶电泳检测DNA[⽬的要求]通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的⽅法和技术[实验原理]琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA⽚段的常⽤⽅法。
DNA分⼦在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分⼦筛效应，DNA分⼦在⾼于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。
由于糖磷酸⾻架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA⼏乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极⽅向移动。
不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从200bp⾄50 kb的DNA⽚段。
在琼脂糖溶液中加⼊低浓度的溴化⼄锭（Ethidum bromide ,EB），在紫外光下可以检出 10ng的DNA条带，在电场中，pH8.0条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。
琼脂糖凝胶有如下特点：(1) DNA的分⼦⼤⼩在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数⽬的常⽤对数值成反⽐，分⼦越⼤迁移得越慢。
(2) 琼脂糖浓度⼀个特定⼤⼩的线形DNA分⼦,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。
DNA电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度(t)成线性关系。
(3) 电压低电压时，线状DNA⽚段迁移速率与所加电压成正⽐。
但是随着电场强度的增加，不同分⼦量DNA⽚段的迁移率将以不同的幅度增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩⼩。
要使⼤于2kb的DNA⽚段的分辨率达到最⼤，所加电压不得超过5v/cm。
(4) 电泳温度DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳⾏为受电泳时的温度影响不明显，不同⼤⼩的DNA⽚段其相对迁移速率在4℃与30℃之间不发⽣明显改变，但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最好在4℃条件下电泳。
分子生物学实验的设计与操作技巧引言：分子生物学在现代生物科学研究中占据重要的地位，其实验设计和操作技巧的高超与否直接影响研究结果的准确性和可重复性。
本文旨在分享一些分子生物学实验的设计与操作技巧，帮助读者在实验中取得较好的效果。
一、实验前的准备工作1. 设计实验方案：在进行分子生物学实验之前，首先需要明确实验的目的、研究问题和实验流程，并合理安排时间和资源。
2. 准备实验材料和试剂：根据实验方案确定所需的实验材料和试剂，例如DNA/RNA样本、引物、酶切剂、PCR试剂盒等，并确保其质量和储存条件良好。
3. 消毒和清洁：实验前需要对实验台面、仪器设备和实验用具进行消毒和清洁，以防止污染对实验结果的影响。
二、实验设计的要点1. 正、对照组的设置：在进行实验设计时，应考虑设置适当的正、对照组，以验证实验结论的准确性和可靠性。
2. 重复实验的次数：为了保证实验结果的可信度，应尽量增加实验的重复次数，统计分析实验结果的稳定性和可靠性。
3. 实验步骤的顺序和时序：在进行分子生物学实验时，应按照实验步骤的顺序和时序进行操作，确保实验各步骤的顺利进行，避免操作失误和结果偏差。
三、实验操作的技巧1. 分装试剂的技巧：在分装试剂时，应根据需要准确称量，并使用干燥、无污染的试剂瓶和量筒或量管，避免试剂损失或污染。
2. 样本的提取和纯化：样本提取和纯化是分子生物学实验中的重要一步，应选择合适的提取和纯化方法，并注意反应条件的控制和操作技巧的熟练程度，以提高样本的纯度和产量。
3. PCR反应的条件控制：PCR反应是分子生物学实验中常用的方法之一，应合理选择引物的设计和浓度，控制反应的温度、时间和循环次数，避免非特异性扩增或PCR产物的损失。
4. 凝胶电泳的操作技巧：在进行凝胶电泳实验时，应注意凝胶的制备和质量，选择合适的电泳缓冲液，并控制电泳条件，以得到清晰的电泳图谱。
5. 技术操作的规范化：在进行分子生物学实验时，应严格按照操作规范进行，注意实验操作的细节和步骤，避免引入外源污染和操作偏差。
实验一、动、植物组织总RNA的提取一、材料、试剂和仪器材料：动物组织，一次性塑料手套，200 μl、1000 μl吸头。
试剂：TRIzol总RNA提取试剂，氯仿，异丙醇，0.1％DEPC，75％乙醇（用RNase-free 水配制），RNase-free水。
仪器：烘箱，超低温冰箱，高速冷冻离心机，普通离心机，高压灭菌锅，微量取样器，研钵二、提取操作步骤1、匀浆处理：a、动物组织：以鼠肝脏RNA提取为例。
取新鲜或-70'C冻存组织，大约10-30 mg组织加1m1 TRIquick，用一次性组织研磨杵或匀浆器匀浆处理。
b、单层培养细胞：直接在培养板中加入TRIquick裂解细胞，每10cm2面积加1ml TRIquick。
用取样器吹打混匀。
c、细胞悬液：离心收集细胞。
每5-10×106动物、植物和酵母细胞或每107细菌细胞加1 ml TRIquick。
d、血液处理：直接取新鲜的血液，加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10分钟，8，000-10，000 rpm离心1分钟。
彻底吸弃上清，收集白细胞沉淀。
每100-200 μl 血液收集的白细胞沉淀加入1 ml TRIquick。
2、将匀浆样品在室温放置5分钟，使得核酸蛋白复合物完全分离。
如不连续进行实验，加入TRIquick的匀浆样品可在－70'C下保存1-2个月。
3、可选步骤：4℃12，000 rpm离心5-10分钟，取上清。
如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可离心去除。
离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。
处理脂肪组织样品时，上层是大量油脂，应除去。
取澄清的匀浆溶液进行下一步操作。
4、每使用1ml TRIquick向匀浆样品中加0.2 ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置3-5分钟，使其自然分相。
如不能旋涡混匀，可手动颠倒混匀2分钟代替。
5、4℃12，000 rpm离心10-15分钟。
分子生物学实验教案第一部分茶树CBF基因的克隆实验一目标基因的5’-末端的PCR扩增、3’-末端的PCR扩增一、实验目的通过本实验学习和掌握用RACE方法扩增cDNA的5’-末端和3’-末端的方法和技术。
二、实验原理1. 聚合酶链反应的原理聚合酶链反应（the polymerase chain reaction, PCR）是一种在模拟DNA复制反应的基础上对一个DNA分子某一特定区域进行选择性扩增的方法。
DNA分子上任何一个区域，只要它两端的序列是已知的，都可以利用PCR进行特异性扩增，获得大量的扩增产物。
PCR反应体系包括：①模板：其上待扩增的序列称为靶序列；②一对特异性引物：它们是人工合成的10 ~ 30个核苷酸长的单链DNA片段，与靶序列的两端互补；③耐热DNA聚合酶：用于延伸引物合成DNA，PCR反应中常用的DNA聚合酶是Taq DNA聚合酶；④四种脱氧核糖核苷三磷酸：dATP、dGTP、dCTP和dTTP是DNA合成的前体分子。
PCR实验的基本步骤如下：①高温变性：反应混合物被加热到94℃，在该温度下，DNA 双螺旋两条链之间的氢键被打断，DNA分子发生变性；②低温退火：当温度降低时，引物与单链模板杂交；③适温延伸：退火后，温度又被升高到了72℃，这是Taq DNA聚合酶的最适工作温度，Taq DNA聚合酶延伸引物合成与模板互补的新链。
这三步构成一个循环，接下来温度又被升到94℃，双链DNA分子又变性成为单链，于是便开始了第二轮变性－退火－延伸的循环（图1-1）。
由于每一次循环的产物都可以作为下一次循环反应的模板，通常经过25 ~ 30次后，被扩增的DNA片段可以达到几百万个拷贝。
2. RACE技术的原理以4℃处理24 h的茶树幼叶为材料，利用SMART cDNA synthesis Kit构建了SMART cDNA文库。
首先以3' SMART™ CDS Primer II A为引物，以RNA为模板合成第一链cDNA。
北京化工大学分子生物学实验指导实验一 少量质粒DNA的制备一、实验目的（1）了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的作用。
（2）掌握质粒DNA分离、纯化的原理。
（3）学习碱裂解法分离质粒DNA的方法。
二、实验原理质粒（plasmid）是一种双链的共价闭环状的DNA分子，它是染色体外能够稳定遗传得因子。
质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主地进行自身复制，并使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。
从细胞生存来看，没有质粒存在，基本上不妨碍细胞的存活，因此质粒是寄生性的复制子。
根据质粒的这种特性，通常采用DNA体外重组技术和微生物转化等基因工程的技术和方法，使重组到质粒的某种基因（如干扰素基因）带进受体细胞（如具有一定特性的大肠杆菌细胞等）表达它的遗传性质，改变或修饰寄主细胞原有的代谢产物，或产生新的物质（如干扰素）。
目前，质粒已广泛地用作基因工程中的DNA分子无性繁殖的运载体，同时它也是研究DNA结构与功能的较好模型。
在细菌细胞中，质粒DNA通常为染色体DNA的2%左右，但是细菌质粒DNA的含量与其复制类型有关。
质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制（stringent control）复制型和松弛控制型（relaxed control）复制型。
严密控制复制型的质粒只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，质粒也不复制。
每个细胞内只含1个或几个质粒分子（即有1个或几个拷贝）。
松弛控制复制型的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，当染色体复制已经停止时，该质粒仍然能够继续复制。
该质粒在一个细胞内有许多拷贝，一般在20个以上，例如col E1 质粒（含有产生大肠杆菌素E1 基因）及其衍生质粒，在每个细胞内约有20多个拷贝。
所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。
目前应用于质体DNA的纯化或抽取的方法众多，例如碱溶裂法（alkaline lysis）、热裂解法（boiling method）、氯化铯（CsCl）纯化法，及市售柱层析套管法等。
最常用的碱裂解法具效率高、价廉、简单易学等优点。
其原理是利用碱处理质粒DNA及染色体DNA，使两者双股打开呈单股状态，再加酸中和，使单股回复为双股DNA，同时在急速中和反应中，染色体DNA因分子过于庞大以致于碱基匆忙配对，形成杂乱无序的巨大分子，对水的相对溶解度低而易被沉淀下来。
相反，质粒DNA因分子小，两单股DNA恢复原碱基配对快而易溶于水中，所以只要经过离心，即可将染色体DNA与质体DNA分离。
本实验所使用的pUC19含有β-lactamase基因，会产生peripasmic酶，进行蓝白斑筛选，抗氨苄青霉基因ampicillin (Amp)两种抗性筛选标记。
碱裂解法：本实验是以alkaline lysis的方法进行，其原理是将大肠杆菌以NaOH及SDS分解，并使蛋白质及DNA变性，然后以酸中和。
小分子质粒DNA在中和后可恢复原状，但大部分的大肠杆菌染色体DNA则无法完全复原而与SDSD-K+所含复合物一起沉淀下来，可离心去除，上清液所含质粒则可以乙醇(ethanol)或异丙醇(isopropanol)将其沉淀下来。
三、实验方法1.仪器用具:a.无菌操作台(laminar flow)b.台式型离心机(microcentrifuge)c.微量吸管(pipetman)d.真空干燥机(speed vac)e． 漩涡混合器f． 琼脂糖凝胶电泳仪2.材料:实验前一天，将含质粒的大肠杆菌接种至含ampicillin (50 μg/ml)的LB培养液中，并在37 o C下振荡培养过夜。
3.药品及试剂:a.Solution I: 25mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA (pH 8.0), 50 mM glucoseb.Solution II: 0.2M NaOH, 1% SDS (使用前以10 N NaOH与10% SDS稀释配制)c.Solution III: 3M醋酸钾溶液(KAc, pH 5.2)d.RNase A: 1mg/mle.TE buffer: 10mM Tris-HCl(pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0)f.100% 乙醇(ethanol)或异丙醇(isopropanol)g.LB(Luria-Bertani)培养液: 10g tryptone, 5g yeaste extract, 10g NaCl in 1Lh．酚/氯仿（1：1）溶液i．1 x TAE电泳缓冲液：40 mM Tris-乙酸, 1mM EDTA（pH 8.0）j .DNA mark er：DL20004.实验步驟:1)将过夜菌液分別倒入1.5ml微量离心管中以10,000 rpm离心1分钟后，倒去上清液。
2)沉淀菌体加入50 μl Solution I，用漩涡混合器剧烈振荡使菌体完全悬浮，置于冰上5分钟。
3)加入100 μl Solution II，盖上管盖后将管子反复上下摇动3次，不可剧烈振荡，置于冰上5分钟。
4)加入75 μl Solution III，亦温和摇匀，置于冰上5分钟。
5）加等体积酚：氯仿(1:1)225 μl混匀。
6)以12,000 rpm 离心5分钟，小心吸取上清液至另一微量离心管中。
7)加入2倍体积100% 酒精，混合均匀，置于冰上20分钟。
8)以12,000 rpm 离心8分钟，倒掉上清液，加入70% 酒精清洗一次，置于真空干燥机中10分钟。
9)加入15ul灭菌水，溶解DNA。
10）电泳检测（琼脂糖凝胶电泳），取5μl DNA溶解液加2μl Loading buffer于1%琼脂糖,电泳半小时,电压80伏。
11）电泳凝胶在透射式紫外检测仪上观察，记录结果。
四、注意事项1．细菌培养过程要求无菌操作。
抗菌素等不能高温灭菌，应使用细菌滤器过滤后使用。
细菌培养液、配试剂用的蒸馏水、试管和Eppendorf离心管等有关用具和某些试剂须经高压灭菌处理。
接触过细菌的器具用后应消毒灭菌再洗净。
2．制备质粒过程中，所有操作必须缓和，不要剧烈振荡，以避免机械剪切力对DNA的断裂作用。
同时也应防止DNase引起DNA的降解。
3．酚氯仿有强腐蚀性，使用时要格外小心，不要弄到手上，必要时带手套。
4．加入乙酸钾溶液后，可用小玻璃棒轻轻搅开团状沉淀物，防止质粒DNA可能被包埋在沉淀物内，不易释放出来。
5．用酚/氯仿混合液除去蛋白效果比单度作用酚或氯仿更好。
为充分除去残余的蛋白质，可以进行多次抽提，直至两相间无絮状蛋白沉淀。
6．提取的各步操作尽量在低温条件下进行（冰裕上）。
7．电泳时，电泳缓冲液要没过凝胶。
8. 在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能使质粒DNA链发生断裂。
所以，多数 质粒粗提取物中含有三种构型的质粒：共价闭合环状DNA（cccDNA）： 质粒的两条链没有断裂；超螺旋开环DNA（ocDNA）： 质粒的一条链断裂；松弛的环状分子线形DNA（lDNA）： 质粒的两条链均断裂；线性分子质粒DNA的形态不一，电泳时在凝胶中的迁移率不同。
超螺旋的质粒DNA一般迁移最快、开环（缺口）质粒DNA迁移最慢，线化DNA位于两者之间。
本实验采用绿色荧光蛋白（GFP）对DNA进行染色，电泳显示有些脱尾，绿色荧光部分有一大片，可能是把染料直接加到质粒DNA中所致，所以我又将胶用EB（溴化乙锭）染色，紫外线照射下呈桔红色荧光，可由上图清除看到质粒DNA所在位置。
(a)松弛线性的DNA；(b)松弛开环的OC构型；(c)超螺旋的SC构型实验二 PCR反应一、实验目的1、学习PCR 反应的基本原理与实验技术。
2、了解引物设计的一般要求。
二、实验原理聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）是体外酶促合成特异DNA片断的一种技术。
利用PCR技术可在数小时之内大量扩增目的基因或DNA片断，从而免除基因重组和分子克隆等一系列繁琐操作。
由于这种方法操作简单、实用性强、灵敏度高并可自动化，因而在分子生物学、基因工程研究以及对遗传病、传染病和恶性肿瘤等基因诊断和研究中得到广泛应用。
PCR进行的基本条件是：（1） 以DNA为模板（在RT-PCR中模板是RNA）；（2） 以寡聚核苷酸为引物；（3） 需要4种dNTP 作为底物；（4） 有 Taq DNA 聚合酶。
PCR 每一个循环由三个步骤组成：（1） 变性 加热模板DNA，使其解离成单链；（2） 退火 降低温度，使人工合成的寡聚核苷酸引物在低温条件下与模板DNA 所需扩增序列结合；（3） 延伸 在适宜温度下，DNA 聚合酶利用dNTP 使引物3’端向前延伸，合成与模板碱基序列完全互补的DNA链。
每一个循环产物可作为下一个循环的模板，因此通过35-45个循环后，目标片断的扩增可达106-107倍。
本实验扩增的片段约1.3kb，故需用LA Taq TM 扩增长片段。
三、 实验方法1、仪器用具：a．PCR 扩增仪b．琼脂糖凝胶电泳仪2、药品及试剂a．LA Taq TM（5U/μl）购于Takarab.10×反应缓冲液：0.67mol/l，pH = 8.8 Tris-HCl,0.067mol/l MgCl2，0.166mol/l （NH4）2SO4c.dNTP(2.5mM)d.引物P1，P23、实验步骤1）PCR扩增体系在150μl离心管中按体积有大到小加入下列试剂，最后加酶：模板 0.5μl引物P1 0.5μl引物P2 0.5μldNTP 3 μl10×buffer 2.5μlLA Taq 0.5μlO 17.5μlddH2Total 25 μl2）扩增程序预变性 94℃ 5min变性 94℃ 30s30个循环退火 43℃ 30s延伸 72℃ 2min末端延伸 72℃ 10min保存 16℃ 8h3）PCR产物电泳检测 反应结束后，取5μl PCR 产物用1% 的琼脂糖凝聚电泳检测，用GLP 在紫外灯下检测。
四、注意事项1、在加入各试剂时要先加体积大的试剂，再加体积小的试剂，并充分混合。
2、加Taq酶时要拿管的上部，避免用手触摸酶的部分。
3、PCR的影响因素：（1）模板 单、双链 DNA 都可作为PCR的模板，若起始材料是RNA，需先通过逆转录反应得到一条cDNA。
虽然PCR 可以用极度微量的样品甚至是来自于单一细胞的DNA，但为了保证反应得特异性，一般宜用ng级的克隆DNA，μg水平的染色体DNA 或104拷贝数量的待扩增片断来作起始材料。
原料可以是粗制制品，但不能混有蛋白酶、核酸酶、Taq DNA 聚合酶抑制剂以及任何能结合DNA 的蛋白质。
