HLD+ATP+7B基因8、12、14、16、18号外显子突变的DNA分析(Ⅱ)
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ＫＥＹ ＷｏＲＤＳ ｈｅｐａｔｏｌｅｎｔｉｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ８ ｅｘｏｎ ａｎｄ ２ ｅｘｏｎ １ ｏｆ ＷＤ ｇｅｎｅ
ＭｓｐＩ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｔａｉｌ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ
ＤＮＡ ｍｕｔａｔｉｏｎ
Ｗｉｌｓｏｎ病（ＷＤ）是一种与铜代谢障碍有关的常 染色体隐｜生遗传病。由于铜代谢障碍，铜沉积于大脑 基底节、肝脏、肾脏等处，导致各种症状，包括锥体外 系症状、急性和慢性肝功能损害及肾功能损害等。不 同地区及人群的患病率不一，估计世界人群的患病率 为０．３－３／１０万。１引，近年来，随着Ｗｉｌｓｏｎ病的进一步 研究，ＷＤ基因最近被克隆并定位于１３号染色体长 臂上，编码一个Ｐ型铜转运ＡＴＰ酶（ＡＴＰ７Ｂ），此酶参 与铜跨膜转运的代谢过程。３引。ＷＤ基因包含２１个 外显子，国外报道欧洲以１４和１８号外显子为基因突 变热区，作者曾于２００７年在中国优生优育第４９期就 ｗｉｌｓｏｎ氏病ＡＴＰ７Ｂ基因的第８号外显子突变的ＤＮＡ 进行了分析和介绍，现就该基因的第１２、１４、１６、１８号
万方数据
中国优生优育２００７年９月第１３卷第３期 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｎａａｌ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈｙ Ｂｉｒｔｈ＆Ｃｈｉｌｄ Ｃａｒｅ Ｖ０１．１ ３ Ｎｏ．３ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２００７
尿铜排泄量＞１００ｕｇ。记录下每个病人的发病年龄 及｜｝鑫床表现。８２馕健康自愿者，男５８铡，女２４铸， 年龄最小７岁，最大３６岁，平均２１．７岁。血清镧蓝 嚣白及铜氧化酶等生化检查均为正常水平。 ２方法 ２＋ｌ基因组ＤＮＡ稠备擒取研究对象外鼷静脉直 ２ｍｌ，用酚氯仿法提取基因组ＤＮＡ。 ２．２目的基因的扩增 聚合酶链反应（ＰＣＲ）：扩增 ＡＴＰ ７Ｂ基因外短子８、１２、１４、１６、１８，弓｜物与文献报道 一致１乱¨（表１），由上海生工公司合成。扩趱采用 ５０ｕｌ反应体系进行，含基因组ＤＮＡ ４００ｎｇ，ｄＮＴＰ各 ２００ｕｍｏｌ／Ｌ，引物各２．０ｐｍｏｌ／ｕＬ，Ｔａｑ ｐｌｕｓ酶（Ｓａｎｇｏｎ 公司）１Ｕ及其棚应Ｔａｑ ｐｌｕｓｌ×Ｂｕｆｆｅｒ，Ｍ９２＋浓度２．０ ｍｍｏｌ／Ｌ，采蔫Ｈｅｍａ基因扩增仪（产品标准：Ｑ １９２ＨＭ０１０－９５），条件为９５０ｃ ３ｍｉｎ预变性，９４℃５０ 秒，退火５０秒，退火温度因外妲子不同而不同（５０— ６０℃），７２０Ｃ延伸６０秒，循环数２６～３０个，最后７２℃ 延伸∞分锌。
摘 要 目的 对肝豆状核变性（又称Ｗｉｌｓｏｎ病，ＷＤ）基因的突变位点外显子８、１２、１４、１６、１８进行ＤＮＡ测序分析并建立直
接基因诊断方法。方法 对１０２例ＷＤ病人和８２例对照正常人提取基因组ＤＮＡ，ＰＣＲ扩增ＡＴＰ７Ｂ第８、１２、１４、１６、１８号外 显子，８号外显子及１２号外显子扩增产物分别行Ｍｓｐ Ｉ及Ｔａｉｌ内切酶酶切分析；后对所有病人及对照组ＤＮＡ外显子扩增产物 行直接测序，进而与临床表型做相关分析。结果 １０２例ＷＤ病人，８号外显子３５例存在Ｍｓｐ Ｉ酶切反应异常，测序示 ＡｒｇＶ７８Ｌｅｕ纯合或杂合突变，占３４．３１％，其中１２例伴Ｌｅｕ７７０Ｉ．ｅｕ多态性；１２号外显子１３例存在Ｔａｉｌ酶切反应异常，测序示 Ｔｈｌ９３５Ｍｅｔ杂合错义突变，占１２．７５％，１例存在ｌｒ９９１９Ｇｌｙ杂合错义突变，Ａｒ９９５２Ｌｙｓ在患者及对照组中均检出；余外显子１４、 １６、１８对照组与患者均未发现突变。结论 ＡＴＰ７Ｂ基因外显子８、１２为ＷＤ突变热点，其中８号外显子以Ａｒ’９７７８Ｌｅｕ、１２号外 显予以Ｔｈｒ９３５Ｍｅｔ为主要突变形式，ＰＣＲ—Ｍｓｐ Ｉ酶切、ＰＣＲ—Ｔａｉｌ酶切反应可作为ＷＤ病人初步筛选方法。 关键词 肝豆状核变性 ＷＤ基因８、１２号外显子 Ｍｓｐ Ｉ酶切Ｔａｉｌ酶酶切ＤＮＡ突变
表３ ｅＸＯＨ １２扩增产物Ｔａｉｌ酶切反应体系
２．４ ＤＮＡ基因测序ＰＣＲ产物经Ｑｉａｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ柱 （Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ。）纯化。对所有瘸人稀对照组进行 ＤＮＡ测序以了解８、１２、１４、１６、１８号外显子突变的 位置和形式，测序工作委托上海生工公司完成。 ３结果 ３。１抽提基因组ＤＮＡ共１８４份标本，ＤＮＡ浓度为 ０．６６ｕｇ／ｕｌ，电泳纯，在１．７％琼脂糖凝胶电泳示一条 带（约２０ｋｂ）。 ３．２酶切分析 ３．２．】ＭｓｐＩ酶切分析 在１０２例ＷＤ患者中，８号 外显子扩增产物经ＭｓｐＩ酶切异常者共３５例， Ａｒ９７７８Ｌｅｕ纯合突变１４例，占所有瘸人的１３．７３％ （Ｍｓｐ ｌ内切酶未酶切，２９６ｂｐ一条带），杂合型突变 ２ｌ铡，占２０．５９％（Ｍｓｐ Ｉ内切酶部分酶切，２９６ｂｐ、 ２３７ｂｐ、５９ｂｐ三条带），而对照组无一例检出此突变 （Ｍｓｐ Ｉ内切酶完全酶切，２３７ｂｐ、５９ｂｐ两条带）。 （图１）
１ 对象
１０２例ＷＤ患者，均为安徽中医学院第一附属 医院神经内科２００４年９月一２００６年１２月期间收住 的患者，其中男６１例，女４１例，年龄最大者５３岁， 最小者６岁，平均１５．２岁土３．２岁，所有病例均依 据以下主要条件诊断：（１）具有锥体外系症状和／或 肝损害表现及精神异常等临床特点；（２）眼裂隙灯 下查角膜Ｋ—Ｆ环阳性；（３）血清铜蓝蛋白（ＣＰ）＜ ２００ｍｇ／Ｌ或血清铜氧化酶＜０．２活力单位；（４）２４ｈ
万方数据
圈１ ＡＴＰ ７Ｂ基因８霹外显子ＰＣＲ产物ＭｓｐＩ酶切电泳豳
正常对照缀（２３７ｂｐ，５９ｂｐ） 不含Ａｒ妒７８Ｌｅｕ突变粒患者（２３７ｂｐ，５９ｂｐ） Ａｒ９７７８Ｌｅｕ纯合突变患者（２９６ｂｐ） Ａｒ９７７８Ｌｅｕ杂合突变患者（２９６ｂｐ，２３７ｂｐ，５９ｂｐ） 酶切Ｍａｒｋ
中国优生优育２００７年９月第１３卷第３期 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ），Ｂｉｒｔｈ＆Ｃｈｉｌｄ Ｃａｒｅ Ｖ０１．１３ Ｎｏ．３ Ｓｅｐｔｅｍｈｅｒ ２００７
表１ ＰＣＲ扩增所用的５对弓Ｉ物
２，３限制性内切酶消化 ２。３．１ ＭｓｐＩ内切簿消讫ＡＴＰ ７Ｂ基因８号外显子 扩增产物采用２５ｕｌ酶切反应体系，如表２所示， ３７。Ｃ孵育４小时使样本完全酶切后，３％琼脂糖凝胶 电泳。
表２ ｅｘｏｎ ８ ｇ－增产麓ＭｓｐＩ酶甥复痉露系
２．３．２ Ｔａｉｌ内切酶消化ＡＴＰ ７Ｂ基因１２号外显子 扩增产物亦采用２５ｕｌ酶切反应体系，如表３所示， ６５℃孵育５小时使样本完全酶切后，３％琼脂糖凝胶 电泳。
ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ．３５ ｃａｓｅｓ ｗｅｒｅ ａｂｎｏｒｍａｌ ｉｎ １０２ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｓ ｔｈａｔ ｉｎ ｔｈｅ １０２ ｐａｔｉｅｎｔｓ ３４．３ｌ％ｈａｖｅ ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ ｏｒ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ Ａｒ９７７８Ｌｅｕ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｅｘｏｎ ８，１２ Ｌｅｕ７７０Ｌｅｕ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ａｎｄ ｔｈａｔ ｆｏｒ ｅｘｏｎ １２，１３ ｃａｓｅｓ ｗｅｒｅ ａｂｎｏｒｍａｌ ｕｓｉｎｇ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｂｖ ＴＡｊｌ．ｄｉｒｅｃｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｓｈｏｗｓ １２．７５％ｏｆ ｔｈｅ ｃａｓｅｓ ｈａｖｅ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ Ｔｈｌ９３５Ｍｅｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ，ｏｎｅ ｃａｓｅ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ Ａｒ９９１９Ｇｌｖ．ｗｈｉｌｅ Ａｒ９９５２Ｌｙｓ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｂｏｔｈ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｎｄ ｎｏｒｍａｌ ｃｏｎｔｒ０１．Ｎｏ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｅｘｏｎｌ４、１６、１８ ｏｆ ａｌｌ ｖｏｌｕｎ—
Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｏｎ ８１２ １４ １６来自７７１８
ｏｆ Ｗｉｌｓｏｎ＋Ｓ
Ｄｉｓｅａｓｅ Ｇｅｎｅ
ＢＡＯ Ｙｕａｎ—ｃｈｅｎｇ ＹＵ Ｙｕａｎ—ｘｕｎ ＷＵ ｐｅｎｇ ＪＩＡＮＧ Ｈｕａｉ—ｚｈｏｕ ＷＡＮＧ Ｈｏｎｇ—ｈａｏ ＡＢＳＴＲＡＣＴ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅｓ Ｔｏ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｅｘｏｎ ８、１２、１４、１６、１８ ｏｆ ｗＤ ｇｅｎｅ（ｈｅｐａｔｏｌｅｎｔｉｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，Ｗｉｌｓｏｎ§ ｄｉｓｃａｓｅ １ ａｎｄ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｔｈｅ ｄｉｒｅｃｔ ｇｅｎｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｘｔｒａｃｔ ｔｈｅ ｇｅｎｏｎｆｉｃ ＤＮＡ ｆｒｏｍ １０２ ＷＤ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｎｄ ８２ ｎｏｒｍａｌ ｃｏｎｔｒｏｌｓ， ａｎｄ ａｍｐｌｉｆｙ ｅｘｏｎ ８、１２、１４、１６、１８ ｏｆ ＡＴＰ７Ｂ ｇｅｎｅ ｂｙ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）．Ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｅｘｏｎ ８、ｅｘｏｎ １２ ｗｅｒｅ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｗｉｔｈ ＭｓｐＩ ａｎｄ Ｔａｉｌ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｈｅ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｅｘｏｍ ８、１２、１４、１６、１ ８ ｆｒｏｍ ａｌｌ ｔｈｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｎｄ ｎｏｒｍａｌ ｃｏｎｔｒｏｌｓ．Ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｓｔｕｃｄｉｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｂｙ ＭｓｐＩ ｔｈｒｏｕｇｈ
作者单位１．安徽中医学院第一附属医院神经内科 ２．安徽优生优育遗传医学中心
外显子突变的分析研究作进一步的探讨。 对于中国人，大部分基因突变发生在外显子８、１２
上，作者对来自９８个家系１０２位ＷＤ病人进行调查分 析，ＰＣＲ扩增ＡＴＰ７Ｂ第８、１２、１４、１６、１８号外显子，８号、 １２外显子扩增产物分别行ＭｓｐＩ及Ｔａｉｌ酶切分析，对所 有病人及对照组进行ＤＮＡ测序，分析其突变隋况。
例中１２例在８号外显子Ａｒ９７７８Ｌｅｕ突变基础上发 生Ｌｅｕ７７０Ｌｅｕ同义突变。１０２例病人中８号外显子 总染色体突变率３４．３１％。（图３－５）
图２ ＡＴＰ ７Ｂ基因１２号外显子ＰＣＲ产物Ｔａｉｌ酶切电泳图 １．酶切Ｍａｒｋ ２．正常对照组（２２９ｂｐ） ３．不含‘Ｐｈｌ９３５Ｍｅｔ突变的患者（２２９ｂｐ） ４．Ｔｈｒ９３５Ｍｅｔ杂合突变的患者（８９ｂｐ、１４０ｂｐ、２２９ｂｐ）
ＭｓｐＩ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｔａｉｌ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ
ＤＮＡ ｍｕｔａｔｉｏｎ
Ｗｉｌｓｏｎ病（ＷＤ）是一种与铜代谢障碍有关的常 染色体隐｜生遗传病。由于铜代谢障碍，铜沉积于大脑 基底节、肝脏、肾脏等处，导致各种症状，包括锥体外 系症状、急性和慢性肝功能损害及肾功能损害等。不 同地区及人群的患病率不一，估计世界人群的患病率 为０．３－３／１０万。１引，近年来，随着Ｗｉｌｓｏｎ病的进一步 研究，ＷＤ基因最近被克隆并定位于１３号染色体长 臂上，编码一个Ｐ型铜转运ＡＴＰ酶（ＡＴＰ７Ｂ），此酶参 与铜跨膜转运的代谢过程。３引。ＷＤ基因包含２１个 外显子，国外报道欧洲以１４和１８号外显子为基因突 变热区，作者曾于２００７年在中国优生优育第４９期就 ｗｉｌｓｏｎ氏病ＡＴＰ７Ｂ基因的第８号外显子突变的ＤＮＡ 进行了分析和介绍，现就该基因的第１２、１４、１６、１８号
万方数据
中国优生优育２００７年９月第１３卷第３期 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｎａａｌ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈｙ Ｂｉｒｔｈ＆Ｃｈｉｌｄ Ｃａｒｅ Ｖ０１．１ ３ Ｎｏ．３ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２００７
尿铜排泄量＞１００ｕｇ。记录下每个病人的发病年龄 及｜｝鑫床表现。８２馕健康自愿者，男５８铡，女２４铸， 年龄最小７岁，最大３６岁，平均２１．７岁。血清镧蓝 嚣白及铜氧化酶等生化检查均为正常水平。 ２方法 ２＋ｌ基因组ＤＮＡ稠备擒取研究对象外鼷静脉直 ２ｍｌ，用酚氯仿法提取基因组ＤＮＡ。 ２．２目的基因的扩增 聚合酶链反应（ＰＣＲ）：扩增 ＡＴＰ ７Ｂ基因外短子８、１２、１４、１６、１８，弓｜物与文献报道 一致１乱¨（表１），由上海生工公司合成。扩趱采用 ５０ｕｌ反应体系进行，含基因组ＤＮＡ ４００ｎｇ，ｄＮＴＰ各 ２００ｕｍｏｌ／Ｌ，引物各２．０ｐｍｏｌ／ｕＬ，Ｔａｑ ｐｌｕｓ酶（Ｓａｎｇｏｎ 公司）１Ｕ及其棚应Ｔａｑ ｐｌｕｓｌ×Ｂｕｆｆｅｒ，Ｍ９２＋浓度２．０ ｍｍｏｌ／Ｌ，采蔫Ｈｅｍａ基因扩增仪（产品标准：Ｑ １９２ＨＭ０１０－９５），条件为９５０ｃ ３ｍｉｎ预变性，９４℃５０ 秒，退火５０秒，退火温度因外妲子不同而不同（５０— ６０℃），７２０Ｃ延伸６０秒，循环数２６～３０个，最后７２℃ 延伸∞分锌。
摘 要 目的 对肝豆状核变性（又称Ｗｉｌｓｏｎ病，ＷＤ）基因的突变位点外显子８、１２、１４、１６、１８进行ＤＮＡ测序分析并建立直
接基因诊断方法。方法 对１０２例ＷＤ病人和８２例对照正常人提取基因组ＤＮＡ，ＰＣＲ扩增ＡＴＰ７Ｂ第８、１２、１４、１６、１８号外 显子，８号外显子及１２号外显子扩增产物分别行Ｍｓｐ Ｉ及Ｔａｉｌ内切酶酶切分析；后对所有病人及对照组ＤＮＡ外显子扩增产物 行直接测序，进而与临床表型做相关分析。结果 １０２例ＷＤ病人，８号外显子３５例存在Ｍｓｐ Ｉ酶切反应异常，测序示 ＡｒｇＶ７８Ｌｅｕ纯合或杂合突变，占３４．３１％，其中１２例伴Ｌｅｕ７７０Ｉ．ｅｕ多态性；１２号外显子１３例存在Ｔａｉｌ酶切反应异常，测序示 Ｔｈｌ９３５Ｍｅｔ杂合错义突变，占１２．７５％，１例存在ｌｒ９９１９Ｇｌｙ杂合错义突变，Ａｒ９９５２Ｌｙｓ在患者及对照组中均检出；余外显子１４、 １６、１８对照组与患者均未发现突变。结论 ＡＴＰ７Ｂ基因外显子８、１２为ＷＤ突变热点，其中８号外显子以Ａｒ’９７７８Ｌｅｕ、１２号外 显予以Ｔｈｒ９３５Ｍｅｔ为主要突变形式，ＰＣＲ—Ｍｓｐ Ｉ酶切、ＰＣＲ—Ｔａｉｌ酶切反应可作为ＷＤ病人初步筛选方法。 关键词 肝豆状核变性 ＷＤ基因８、１２号外显子 Ｍｓｐ Ｉ酶切Ｔａｉｌ酶酶切ＤＮＡ突变
表３ ｅＸＯＨ １２扩增产物Ｔａｉｌ酶切反应体系
２．４ ＤＮＡ基因测序ＰＣＲ产物经Ｑｉａｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ柱 （Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ。）纯化。对所有瘸人稀对照组进行 ＤＮＡ测序以了解８、１２、１４、１６、１８号外显子突变的 位置和形式，测序工作委托上海生工公司完成。 ３结果 ３。１抽提基因组ＤＮＡ共１８４份标本，ＤＮＡ浓度为 ０．６６ｕｇ／ｕｌ，电泳纯，在１．７％琼脂糖凝胶电泳示一条 带（约２０ｋｂ）。 ３．２酶切分析 ３．２．】ＭｓｐＩ酶切分析 在１０２例ＷＤ患者中，８号 外显子扩增产物经ＭｓｐＩ酶切异常者共３５例， Ａｒ９７７８Ｌｅｕ纯合突变１４例，占所有瘸人的１３．７３％ （Ｍｓｐ ｌ内切酶未酶切，２９６ｂｐ一条带），杂合型突变 ２ｌ铡，占２０．５９％（Ｍｓｐ Ｉ内切酶部分酶切，２９６ｂｐ、 ２３７ｂｐ、５９ｂｐ三条带），而对照组无一例检出此突变 （Ｍｓｐ Ｉ内切酶完全酶切，２３７ｂｐ、５９ｂｐ两条带）。 （图１）
１ 对象
１０２例ＷＤ患者，均为安徽中医学院第一附属 医院神经内科２００４年９月一２００６年１２月期间收住 的患者，其中男６１例，女４１例，年龄最大者５３岁， 最小者６岁，平均１５．２岁土３．２岁，所有病例均依 据以下主要条件诊断：（１）具有锥体外系症状和／或 肝损害表现及精神异常等临床特点；（２）眼裂隙灯 下查角膜Ｋ—Ｆ环阳性；（３）血清铜蓝蛋白（ＣＰ）＜ ２００ｍｇ／Ｌ或血清铜氧化酶＜０．２活力单位；（４）２４ｈ
万方数据
圈１ ＡＴＰ ７Ｂ基因８霹外显子ＰＣＲ产物ＭｓｐＩ酶切电泳豳
正常对照缀（２３７ｂｐ，５９ｂｐ） 不含Ａｒ妒７８Ｌｅｕ突变粒患者（２３７ｂｐ，５９ｂｐ） Ａｒ９７７８Ｌｅｕ纯合突变患者（２９６ｂｐ） Ａｒ９７７８Ｌｅｕ杂合突变患者（２９６ｂｐ，２３７ｂｐ，５９ｂｐ） 酶切Ｍａｒｋ
中国优生优育２００７年９月第１３卷第３期 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ），Ｂｉｒｔｈ＆Ｃｈｉｌｄ Ｃａｒｅ Ｖ０１．１３ Ｎｏ．３ Ｓｅｐｔｅｍｈｅｒ ２００７
表１ ＰＣＲ扩增所用的５对弓Ｉ物
２，３限制性内切酶消化 ２。３．１ ＭｓｐＩ内切簿消讫ＡＴＰ ７Ｂ基因８号外显子 扩增产物采用２５ｕｌ酶切反应体系，如表２所示， ３７。Ｃ孵育４小时使样本完全酶切后，３％琼脂糖凝胶 电泳。
表２ ｅｘｏｎ ８ ｇ－增产麓ＭｓｐＩ酶甥复痉露系
２．３．２ Ｔａｉｌ内切酶消化ＡＴＰ ７Ｂ基因１２号外显子 扩增产物亦采用２５ｕｌ酶切反应体系，如表３所示， ６５℃孵育５小时使样本完全酶切后，３％琼脂糖凝胶 电泳。
ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ．３５ ｃａｓｅｓ ｗｅｒｅ ａｂｎｏｒｍａｌ ｉｎ １０２ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｓ ｔｈａｔ ｉｎ ｔｈｅ １０２ ｐａｔｉｅｎｔｓ ３４．３ｌ％ｈａｖｅ ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ ｏｒ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ Ａｒ９７７８Ｌｅｕ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｅｘｏｎ ８，１２ Ｌｅｕ７７０Ｌｅｕ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ａｎｄ ｔｈａｔ ｆｏｒ ｅｘｏｎ １２，１３ ｃａｓｅｓ ｗｅｒｅ ａｂｎｏｒｍａｌ ｕｓｉｎｇ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｂｖ ＴＡｊｌ．ｄｉｒｅｃｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｓｈｏｗｓ １２．７５％ｏｆ ｔｈｅ ｃａｓｅｓ ｈａｖｅ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ Ｔｈｌ９３５Ｍｅｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ，ｏｎｅ ｃａｓｅ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ Ａｒ９９１９Ｇｌｖ．ｗｈｉｌｅ Ａｒ９９５２Ｌｙｓ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｂｏｔｈ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｎｄ ｎｏｒｍａｌ ｃｏｎｔｒ０１．Ｎｏ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｅｘｏｎｌ４、１６、１８ ｏｆ ａｌｌ ｖｏｌｕｎ—
Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｏｎ ８１２ １４ １６来自７７１８
ｏｆ Ｗｉｌｓｏｎ＋Ｓ
Ｄｉｓｅａｓｅ Ｇｅｎｅ
ＢＡＯ Ｙｕａｎ—ｃｈｅｎｇ ＹＵ Ｙｕａｎ—ｘｕｎ ＷＵ ｐｅｎｇ ＪＩＡＮＧ Ｈｕａｉ—ｚｈｏｕ ＷＡＮＧ Ｈｏｎｇ—ｈａｏ ＡＢＳＴＲＡＣＴ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅｓ Ｔｏ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｅｘｏｎ ８、１２、１４、１６、１８ ｏｆ ｗＤ ｇｅｎｅ（ｈｅｐａｔｏｌｅｎｔｉｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，Ｗｉｌｓｏｎ§ ｄｉｓｃａｓｅ １ ａｎｄ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｔｈｅ ｄｉｒｅｃｔ ｇｅｎｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｘｔｒａｃｔ ｔｈｅ ｇｅｎｏｎｆｉｃ ＤＮＡ ｆｒｏｍ １０２ ＷＤ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｎｄ ８２ ｎｏｒｍａｌ ｃｏｎｔｒｏｌｓ， ａｎｄ ａｍｐｌｉｆｙ ｅｘｏｎ ８、１２、１４、１６、１８ ｏｆ ＡＴＰ７Ｂ ｇｅｎｅ ｂｙ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）．Ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｅｘｏｎ ８、ｅｘｏｎ １２ ｗｅｒｅ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｗｉｔｈ ＭｓｐＩ ａｎｄ Ｔａｉｌ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｈｅ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｅｘｏｍ ８、１２、１４、１６、１ ８ ｆｒｏｍ ａｌｌ ｔｈｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｎｄ ｎｏｒｍａｌ ｃｏｎｔｒｏｌｓ．Ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｓｔｕｃｄｉｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｂｙ ＭｓｐＩ ｔｈｒｏｕｇｈ
作者单位１．安徽中医学院第一附属医院神经内科 ２．安徽优生优育遗传医学中心
外显子突变的分析研究作进一步的探讨。 对于中国人，大部分基因突变发生在外显子８、１２
上，作者对来自９８个家系１０２位ＷＤ病人进行调查分 析，ＰＣＲ扩增ＡＴＰ７Ｂ第８、１２、１４、１６、１８号外显子，８号、 １２外显子扩增产物分别行ＭｓｐＩ及Ｔａｉｌ酶切分析，对所 有病人及对照组进行ＤＮＡ测序，分析其突变隋况。
例中１２例在８号外显子Ａｒ９７７８Ｌｅｕ突变基础上发 生Ｌｅｕ７７０Ｌｅｕ同义突变。１０２例病人中８号外显子 总染色体突变率３４．３１％。（图３－５）
图２ ＡＴＰ ７Ｂ基因１２号外显子ＰＣＲ产物Ｔａｉｌ酶切电泳图 １．酶切Ｍａｒｋ ２．正常对照组（２２９ｂｐ） ３．不含‘Ｐｈｌ９３５Ｍｅｔ突变的患者（２２９ｂｐ） ４．Ｔｈｒ９３５Ｍｅｔ杂合突变的患者（８９ｂｐ、１４０ｂｐ、２２９ｂｐ）
