紫外分光光度法和荧光分析法..

武汉软件工程职业学院教案（理论教学首页）（第1页）章节名称第四章药物的杂质检查授课安排授课时数2授课时间第五周授课方法讲授授课教具多媒体教学目的1、明确药物的杂质“特殊物质的检查”的测定意义、原理及注意事项；2、学会测定药物中特殊杂质的操作技术。

教学重点学会测定药物中特殊杂质的操作技术；教学难点学会测定药物中特殊杂质原理及注意事项；项目6几种药物特殊杂质的检查一、利用药物与杂质在物理性质方面的差异（一）臭味及挥发性质的差异例如：黄凡士林中异性有机物检查：本品2.0g ，直火加热无辛味。

浓过氧化氢中不挥发性杂质检查：10ml 水浴蒸干残渣＜15mg 。

（二）颜色差异例如：磺胺嘧啶中有色偶氮苯化合物的检查：取本品2.0g ，加NaOH 试液10ml ，加水25ml ，与黄色3号比色液比，不得更深。

（三）溶解行为的差异：例如：吡哌酸中碱中不溶物吡哌酸甲酯（I ）和（II ）（四）旋光性质的差异：例如：硫酸阿托品中莨菪碱检查：本品溶液(50mg/ml)α＜-0.4（五）对光吸收性质的差异（1）紫外分光光度法：①在一定的波长杂质有吸收，而药物无吸收；②杂质杂质紫外吸收光谱与药物紫外吸收光谱重叠；③药物在紫外区有明显吸收，而杂质吸收很弱货物吸收。

（2）原子吸收分光光度法：主要用于药物中金属盐等杂质的检查，如曾用于维生素C 、硫酸庆大霉素和安痛定注射液中Na 、K 、Ca 、Mg 含量测定。

（3）红外分光光度法：主要用于药物中无效和低效晶型的检查，如甲苯米唑装订线中A晶型的检查。

（4）荧光分析法：例如利血平中氧化产物的检查，是根据利血平纯品无荧光，其氧化产物有荧光。

1.紫外分光光度法：例如：地蒽酚中二羟基蒽醌的检查。

再如：苯丙醇中苯丙酮的检查：可利用供试液的吸收度比来控制杂质；纯品苯丙醇A247nm/A258nm=0.59，99.5%时A247nm/A258nm=0.79；因此规定供试品A247nm/A258nm＜0.79；即所含苯丙酮＜0.5%。

核酸的定量与纯度的测定在分子生物学实验中，核酸提取需要进行其纯度和浓度的测定。

目前实验室常用的测定方法主要有分光光度法、荧光染料法、PCR法和杂交定量法等。

分光光度法分光光度法主要包括紫外分光光度法、定糖定磷法及基于酶催化的核酸定量方法等。

（1）紫外分光光度法紫外分光光度法基于DNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，DNA/RNA在260nm 处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。

因此，可以用260nm波长进行分光测定核酸浓度，OD值为1相当于大约50μg/ml双链DNA，单链DNA浓度约为33µg / ml，RNA约为40μg/ml，寡核苷酸约为35μg/ml。

如用1cm光径，用H2O稀释DNA/RNA样品n倍并以H2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：DNA（mg/ml）=50×OD260读数×稀释倍数/1000RNA（mg/ml）=40×OD260读数×稀释倍数/1000。

A280nm是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA 的A260/A280比值为1.8，纯RNA为2.0。

假如比值低，表示受到蛋白（芳香族）或分类物质的污染，需要纯化样品。

比值=1.5相当于50%蛋白质/DNA溶液。

A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA和RNA的A260/A230比值为2.5。

若比值小于2.0标明样品被碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶剂污染，需要纯化样品。

A320nm或A340nm为检测溶液样品的浊度，该值应该接近0.0。

假如不足，标明溶液中有悬浮物，需要纯化样品。

实验步骤1、将制备的DNA悬浮溶解于TE缓冲液中pH8.0，10mmo1/L的Tris缓冲液，内含(1mmol/L EDTA)或悬浮溶解在灭菌水中(依据DNA含量加水)。

实验二.氨基酸的荧光激发、发射及同步荧光光谱的测量093858 张亚辉一. 实验目的1.学习荧光分析法的基本原理和LS －55B 发光分析仪的操作。

2.学习同步荧光的操作，了解同步荧光的优点。

二.实验原理荧光是分子从激发态的最低振动能级回到原来基态时发射的光。

利用物质被光照射后产生的荧光辐射对该物质进行定性分析和定量分析的方法，称为荧光分析。

在一定光源强度下，若保持激发波长ex λ不变，扫描得到的荧光强度与发射波长em λ的关系曲线，称为荧光发射光谱；反之，保持em λ不变，扫描得到的荧光强度与ex λ的关系曲线，则称为荧光激发光谱。

在一定条件下，荧光强度与物质浓度成正比，这是荧光定量分析的基础。

荧光分析的灵敏度不仅与溶液的浓度有关，而且与紫外光照射强度及所选测量波长等因素有关。

酪氨酸(Tyr)、色氨酸（Try ）、苯丙氨酸（Phe ）是天然氨基酸中仅有的能发射荧光的组分，可以用荧光分析法测定。

它们的激发光谱和发射光谱有互相重叠的现象。

同步扫描荧光光谱技术可以简化、窄化光谱，提高选择性。

三.实验仪器和试剂 1. LS-55型发光谱仪;2. 移液枪(德国BRAND 公司生产);3. 100ml 容量瓶2支; 废液池（烧杯）一只；4. 氨基酸储备液：色氨酸20mg/l ，苯丙氨酸20mg/l.双酚A;5. 去离子水; 四.实验步骤1．打开电脑和光谱仪主机，将仪器预热20分钟左右。

设定仪器参数：全波长预扫描参数，用储备液在100ml 容量瓶中配置溶液，加水定溶后，使得色氨酸浓度为0.1mg/l, 苯丙氨酸1mg/l ；对两种溶液进行预扫描，并记录扫描结果。

同时查看其拉曼波长、瑞利散射波长、以及双倍频峰波长。

2．从预扫描得到激发和发射波长的初步结果（200 –600nm），分别对两种氨基酸溶液测量它们的荧光激发、发射和同步荧光光谱。

激发光谱参数：扫描波长范围200 - 350nm。

emλ(Phe)=287nm，扫描速度=500nm/min, Ex-Slit=5nm, Em-slit=5nm,记录信息；emλ(Try)=357nm, 扫描速度=500nm/min, Ex-Slit=5nm, Em-slit=5nm,记录信息。

紫外可见分光光度法与分子荧光光度法的比较
紫外可见分光光度法和分子荧光光度法，是两种现代分析化学中常用的光度测定技术，它们之间有许多不同之处。

首先，紫外可见分光光度法可以用来测量悬浮液和溶液中某种物质含量，通过检测它
们吸收波长不同的光，并使用紫外可见分光仪可以很好地用来定量分析一种物质的含量，
主要原因是它可以采用强度谱的方式测定光谱分析，这是数据量最大的分光光度法。

而分子荧光光度法则与紫外可见分光光度法存在很大的不同。

分子荧光光度法是一种
用于测定物质的定量分析的光度测量技术，其原理是通过激发某种物质的激发状态，并采
用光谱分析的方式测定淬发状态下某种物质吸收的光谱，采用发射率谱测量它发射出来的
光谱，这种方法有利于识别样品中含量很小的物质。

此外，两种光度测量技术在检测样品中的某种物质的含量时也有很大的差异。

紫外-
可见分光光度法通常可以测到复杂样品中有结构特性的物质，因此适用于分析各种复杂混
合样品，分子荧光光度法则是通过向某种物质添加少量共振激发剂来标记样品中某种物质，然后进行定量分析，它可以清楚地测量某种独特结构物质，因此被广泛应用于纯化和同位
素比值等细胞研究中，并可以更明确地测量和筛选出某种物质。

综上所述，紫外可见分光光度法和分子荧光光度法是两种现代分析化学中常用的光度
测定技术，它们在原理，应用，检测样品中含量的某种物质等方面都存在差异，根据实际
情况和需要，可以依据自身需要选择不同的光度测量技术，以获得更准确的定量分析结果。

紫外分光光度法测定苹果醋中的V C含量【实验目的】（1）掌握紫外分光光度计的工作原理及使用方法。

（2）掌握水果（或蔬菜）中V C含量的测定方法。

【实验原理】在紫外分光光度分析中，常用波长为200～400nm的近紫外光。

当有机物分子受到紫外光辐射时，分子中的价电子或外层电子能吸收紫外光而发生能级间的跃迁，其吸收峰的位置与有机物分子的结构有关，其吸收强度遵循Beer定律，与有机物的浓度有关。

通过测定分子对紫外光的吸收，可以对大量的无机物和有机物进行定性和定量分析。

其主要应用范围是：对具有芳香环或共轭双键结构的有机化合物，进行定性和定量分析。

维生素C(V C)是为类营养中最重要的维生素之一，缺少它时会产生坏血病，因此又称为抗坏血酸(ascorbicacid)。

分子式为C6H8O6，结构式如下：Vc是所有具有抗坏血酸生物活性的化合物的统称。

它对物质代谢的调节具有重要的作用。

近年来，发现它有增强机体对肿瘤的抵抗力，并具有对化学致癌的阻断作用。

它在人体内不能合成，必须依靠膳食供给。

Vc不仅具有广泛的生理功能，能防止坏血病，关节肿，促进外伤愈合，使机体增强抵抗能力。

而且在食品工业上常用作抗氧化剂、酸味剂及强化剂。

因此，测定食品中Vc的含量以评价食品品质及食品加工过程中Vc的变化情况具有重要的意义。

Vc纯品为白色无臭结晶，熔点在190—192℃，易溶于水，微溶于丙酮，在乙醇中溶解度更低，不溶于油剂。

结晶抗坏血酸在空气中稳定，但它在水溶液中易被空气和其他氧化剂氧化，生成脱氢抗坏血酸;在碱性条件下易分解，见光加速分解;在弱酸条件中较稳定。

Vc含量的测定方法很多。

一般方法有2.6-二氯靛酚滴定法;2.4-二硝基苯肼比色法;荧光分光光度法;电化学法和高效液相色谱法。

Vc广泛存在于植物组织中，新鲜的水果、蔬菜中含量较多。

水果、蔬菜Vc含量的测定依国标GB/T6195-1986是采用2.6-二氯靛酚滴定法[1]。

根据Vc的氧化还原性质，从样品溶液由蓝色转变为粉红色来辨别其终点的到达。

执业药师《药物分析学》备考：分光光度法2017年执业药师《药物分析学》备考：分光光度法不放过每一个知识点，尤其对容易混淆的东西要下更大工夫搞清楚，基础要牢固，店铺为大家整理了2017年执业药师《药物分析学》备考：分光光度法，希望对你有所帮助!第一节可见—紫外分光光度法掌握可见--紫外分光光度法的基本原理和测定方法。

掌握可见—紫外分光光度法在药物鉴别、检查和含量测定中的应用。

熟悉仪器的校正和检定方法;紫外吸收光谱与物质结构的关系。

了解紫外分光光度计的基本结构。

一、基本原理波长200～400nm范围称为紫外光区，400～760nm称为可见光区。

物质吸收紫外和可见光区电磁波而产生的吸收光谱称为紫外-可见吸收光谱。

1.光源：紫外光区通常采用氢灯或氘灯，可见光区采用钨灯。

2.吸收池：玻璃池适用于370nm以上的可见光区，石英池适用于紫外、可见光区，通常仅在紫外光区使用。

三、紫外吸收光谱与物质结构的关系：紫外—可见吸收光谱属分子吸收光谱，是由分子的外层价电子跃迁产生的，也称电子光谱。

它与原子光谱的窄吸收带不同。

每种电子能级的跃迁会伴随若干振动和转动能级的跃迁，使分子光谱呈现比原子光谱复杂得多的宽带吸收。

当分子吸收紫外—可见区的辐射后，产生价电子跃迁。

这种跃迁有三种形式：(1)形成单键的σ电子跃迁。

(2)形成双键的π电子跃迁。

(3)未成键的n电子跃迁。

通常，未成键的孤对电子较易激发，成键电子中π电子较相应的σ电子具有较高的.能量，反键电子则相反。

故简单分子中n→π* 跃迁需能量最小，吸收带出现在长波方向;n→σ*及n→π* 跃迁的吸收带出现在较短波段;σ→σ*跃迁吸收带则出现在远紫外区。

例题：物质分子吸收紫外光后，电子跃迁的类型为：A. n→σ* B. n→π* C. π→π* D. σ→σ* E .σ→π* 答案ABCD四、吸收度的测定方法1.对溶剂的要求：能充分溶解样品，与样品无相互作用，挥发性小，在测定波长处的吸收要符合要求。

荧光分析法比紫外-可见分光光度法灵敏度高的原因
答：荧光分析中与浓度有关的参数是银光物质发射的荧光强度，测量的方式是在入射光的直角方向，即在黑暗背景下检测所发射的强度信号，因此可采用增强入射光强度或增大检测新还得放大倍数来提高灵敏度；
在分管光度法中与浓度相关的参数是吸光度，如果正大入射光强度，相应也增大了透射光强度，同样不能提高其比值；如果增大检测器放大倍数，检测到的入射光强度和透射光强度同时增大，比值同样不增大，也就不能达到提高灵敏度的目的，所以，荧光分析法的灵敏度比紫外分管光度法高。

紫外分光光度法和荧光光度法的对比
紫外分光光度法和荧光光度法是两种不同的光学分析方法，下面进行一些对比：
1.原理：紫外分光光度法基于物质对于紫外光的吸收特性，而荧光光度法基
于物质在特定波长的光的作用下产生的荧光效应。

2.应用范围：紫外分光光度法常用于测定物质在紫外区的吸收光谱和吸光度，
适用于有机化合物、络合物等；而荧光光度法常用于测定物质在可见光区的荧光光谱和荧光强度，适用于荧光物质、高灵敏度分析等。

3.灵敏度：荧光光度法的灵敏度通常比紫外分光光度法高，可以检测到更低
浓度的物质。

4.干扰因素：紫外分光光度法受到溶剂、pH值等干扰因素影响较大，需要精
心选择和调节；而荧光光度法受到的干扰因素相对较少。

5.样品要求：紫外分光光度法对样品的纯度要求较低，可以直接测定；而荧
光光度法对样品的纯度要求较高，需要预先进行提纯和浓缩。

6.测量时间：紫外分光光度法测量时间较短，可以快速得到吸收光谱和吸光
度；而荧光光度法测量时间较长，需要等待样品达到稳态荧光。

综上所述，紫外分光光度法和荧光光度法各有其优缺点，根据具体的分析需求和样品特性选择合适的方法。

紫外分光光度计的用途1.药物分析：紫外分光光度计在医药领域被广泛用于药物的定量分析、质量控制和指纹图谱的建立。

通过测定药物在特定波长下的吸光度，可以计算出其浓度，用于药品质量评估。

2.化学分析：紫外分光光度计可用于测定溶液中一些离子或有机化合物的浓度。

例如，可以通过测定其中一种金属离子溶液在紫外区域的吸光度来判定溶液中该金属的浓度。

3.环境监测：紫外分光光度计可以用于检测大气中有毒气体、污染物、水中有机物的浓度等。

例如，利用紫外吸收分析方法可监测大气中臭氧、二氧化硫等污染物的浓度，从而评估大气污染的程度。

4.食品安全：紫外分光光度计可以用于食品中添加剂、农药、重金属离子等物质的检测。

通过测定食品样品在紫外区域的吸光度，可以确定其中的有害物质含量，保证食品的安全性。

5.生物分析：紫外分光光度计在生物学研究中也有广泛应用。

比如，用于测定蛋白质、核酸、酶等生物分子的浓度和纯度。

此外，还可以通过测定细胞培养液中细胞生长相关物质的吸光度来监测细胞培养进程。

6.荧光分析：紫外分光光度计可以用于荧光分析中。

例如，可以用于测定荧光染料的浓度、研究荧光化学反应等。

7.质量控制：紫外分光光度计广泛应用于工业生产中的质量控制。

通过测定产品中其中一种物质的浓度，判断产品的质量是否符合要求，保障生产过程的稳定性和产品的一致性。

总之，紫外分光光度计作为一种重要的分析仪器，通过测定物质在紫外光区域的光强变化，实现了对物质的定量分析、质量控制和研究。

在医药、环境监测、食品安全、生物学研究等领域都有广泛的应用，对于提高分析精度、保障工业生产和人类生活的安全起着重要作用。

荧光分析法1荧光：物质分子接受光子能量被激发后，从激发态的最低振动能级返回基态时发射出的光。

2荧光分析法是根据物质的荧光谱线位置及其强度进行物质鉴定和含量测定的方法。

荧光分析法的优点：灵敏度高，选择性好，比紫外可见分光光度法低3个数量级以上。

3振动弛豫：处于激发态各振动能级的分子通过与溶剂分子的碰撞而将部分振动能量传递给溶剂分子，其电子则返回到同一电子激发态的最低振动能级的过程。

（非辐射跃迁）4内部能量转换：简称内转换，是当两个电子激发态之间的能量相差较小以致其振动能级有重叠时，受激分子常由高电子能级以无辐射方式转移至低电子能级的过程。

5荧光发射：无论分子最初处于哪一个激发单重态，通过内转换及振动弛豫，均可返回到第一激发单重态的最低振动能级，然后再以辐射形式发射光量子而返回至基态的任一振动能级上，这时发射的光量子称为荧光。

（辐射）6外部能量转换：简称外转换，是溶液中的激发态分子与溶剂分子或与其他溶质分子之间互相碰撞而失去能量，并以热能的形式释放能量的过程。

（非辐射)7体系间跨越：是处于激发态分子的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变化的过程。

（非辐射）8磷光发射：经过体系间跨越的分子再通过振动弛豫降至激发三重态的最低振动能级，分子在激发三重态的最低振动能级可以存活一段时间，然后返回至基态的各个振动能级而发出光辐射，这种光辐射称为磷光。

磷光的坡长比荧光更长。

9溶液荧光光谱的特征：①斯托克斯位移：荧光发射波长总是大于激发光波长。

激发态分子通过内转换和振动弛豫过程而迅速到达第一激发单重态S*1的最低振动能级。

②荧光光谱的形状与激发波长无关，荧光发射光谱只有一个发射带。

③荧光光谱与激发光谱的镜像关系。

10影响荧光强度的外部因素：⑴温度（温度升高溶液中荧光物质的荧光效率和荧光强度将降低）；⑵溶剂（荧光波长随着溶剂极性的增强而长移，荧光强度也增强）；⑶酸度（每一种荧光物质都有它最适宜的发射荧光的存在形式，也就是它最适宜的PH范围）；⑷荧光熄灭剂（是指荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子相互作用引起荧光强度降低的现象；荧光熄灭的原因：①因荧光物质分子和熄灭剂分子碰撞而损失能量；②荧光物质的分子与熄灭剂分子作用生成了本身不发光的配位化合物；③溶解氧的存在，使荧光物质氧化，或是由于氧分子的顺磁性，促进了体系间跨越，使激发单重态的荧光分子转变至三重态；④浓度较大时，还发生自熄灭现象）⒂散射光。

实验一绘制吸收光谱及测定摩尔吸光系数一.实验目的通过紫外吸收光谱的绘制和摩尔吸光系数的测定，掌握Agilent8453 UV-V is的使用方法。

学习导数光谱计算方法及特点。

二.实验原理1．本实验用Agilent8453型分光光度计绘制氨基酸（苯丙氨酸，色氨酸）的紫外吸收光谱，找出它的吸收峰波长并计算摩尔吸光系数。

紫外分光光度法是利用物质对光的选择性吸收而建立起来的一种分析方法，波长范围为200-400nm的紫外光谱。

各种分子都有其特征的吸收光谱，即吸光度与摩尔吸光系数随波长的变化而变化的规律。

吸收光谱的形状与物质的特征有关，以此进行定性分析。

为了清楚地描述各种物质对紫外区域电磁辐射的选择性吸收的情况，往往需绘制吸收光谱曲线，即吸光度对波长的曲线。

在吸收光谱曲线上可以找到最大吸收峰波长。

根据比尔定律：A = ε b c式中A—吸光度ε—摩尔吸光系数b—液槽厚度，单位：厘米c—摩尔浓度，单位：mol/l摩尔吸光系数可按下式计算：ε=A b c实验测得的吸收光谱及摩尔吸光系数与仪器及其狭缝宽度有关。

因此实验结果须注明所用仪器的型号及缝宽条件。

2．导数分光光度法：利用紫外-可见分光光度计软件系统带有的数学处理功能，对吸收光谱进行处理，可以获得导数光谱。

利用导数光谱进行分光光度测定，称为导数分光光度法。

通常可以获得1-4阶导数光谱。

在各阶导数光谱中，吸光度对波长的微分值与溶液中组分的浓度c保持线性关系：ssd Acdλ∝。

其中s为导数的阶数。

因此，可以利用导数光谱进行定量测定。

导数光谱可用于放大图谱间差别，定性分析中分辨重叠谱带，而且还可以减少定量分析中来自散射、基体、及其它吸收物的干扰影响。

由于导数光谱灵敏度高，因此对于试样纯度检验，多组分混合物的测定，消除共存杂质的干扰和背景吸收，测定混合式样都具有特殊的优越性。

三.实验仪器和试剂1.Agilent8453 UV-Vis分光光度计;2.移液枪(德国BRAND公司生产);3.25ml容量瓶，50ml容量瓶10支;4.氨基酸储备液：色氨酸0.400 g/l，苯丙氨酸2.00 g/l;5.去离子水四.实验步骤1.波长测定（1）用氨基酸储备液及去离子水在50ml容量瓶中配置氨基酸溶液，色氨酸浓度为50mg/l, 苯丙氨酸720mg/l；（2）分别取上述溶液，用1cm石英比色皿，以水作参比溶液，在波长范围为190nm——450nm间测定他们的吸收光谱。

紫外可见分光光度法与分子荧光光度法的比较定义：紫外可见分光光度法：根据被测量物质分子对紫外-可见波段范围（150～800纳米）单色辐射的吸收或反射强度来进行物质的定性、定量或结构分析的一种方法；分子荧光光度法：利用物质吸收较短波长的光能后发射较长波长特征光谱的性质，对物质定性或定量分析的方法。

可以从发射光谱或激发光谱进行分析。

组成部件：紫外可见分光光度法：①辐射源。

必须具有稳定的、有足够输出功率的、能提供仪器使用波段的连续光谱，如钨灯、卤钨灯（波长范围350～2500纳米），氘灯或氢灯（180～460纳米），或可调谐染料激光光源等。

②单色器。

它由入射、出射狭缝、透镜系统和色散元件（棱镜或光栅）组成，是用以产生高纯度单色光束的装置，其功能包括将光源产生的复合光分解为单色光和分出所需的单色光束。

③试样容器，又称吸收池。

供盛放试液进行吸光度测量之用，分为石英池和玻璃池两种，前者适用于紫外到可见区，后者只适用于可见区。

容器的光程一般为 0.5～10厘米。

④检测器，又称光电转换器。

常用的有光电管或光电倍增管。

⑤显示装置。

这部分装置发展较快。

较高级的光度计，常备有微处理机、荧光屏显示和记录仪等，可将图谱、数据和操作条件都显示出来。

分子荧光光度法：激发光源、单色器、样品池、检测器和记录显示部分。

1. 光源能发射紫外到可见区波长的光、强度大、稳定。

常用的有溴钨灯、高压汞灯、氙灯。

2. 单色器，两个单色器。

3. 样品池通常用石英制成。

4. 检测器：光电倍增管。

常见类型：紫外可见分光光度法：1.单光束。

简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性。

2.双光束自动记录，快速全波段扫描。

可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。

仪器复杂，价格较高。

3.双波长。

将不同波长的两束单色光(λ、λ1 ) 快束交替通过同一吸收池而后到达检测器。

紫外可见分光光度法与分子荧光光度法的比较定义：紫外可见分光光度法：根据被测量物质分子对紫外-可见波段范围（150～800纳米）单色辐射的吸收或反射强度来进行物质的定性、定量或结构分析的一种方法；分子荧光光度法：利用物质吸收较短波长的光能后发射较长波长特征光谱的性质，对物质定性或定量分析的方法。

可以从发射光谱或激发光谱进行分析。

组成部件：紫外可见分光光度法：①辐射源。

必须具有稳定的、有足够输出功率的、能提供仪器使用波段的连续光谱，如钨灯、卤钨灯（波长范围350～2500纳米），氘灯或氢灯（180～460纳米），或可调谐染料激光光源等。

②单色器。

它由入射、出射狭缝、透镜系统和色散元件（棱镜或光栅）组成，是用以产生高纯度单色光束的装置，其功能包括将光源产生的复合光分解为单色光和分出所需的单色光束。

③试样容器，又称吸收池。

供盛放试液进行吸光度测量之用，分为石英池和玻璃池两种，前者适用于紫外到可见区，后者只适用于可见区。

容器的光程一般为 0.5～10厘米。

④检测器，又称光电转换器。

常用的有光电管或光电倍增管。

⑤显示装置。

这部分装置发展较快。

较高级的光度计，常备有微处理机、荧光屏显示和记录仪等，可将图谱、数据和操作条件都显示出来。

分子荧光光度法：激发光源、单色器、样品池、检测器和记录显示部分。

1. 光源能发射紫外到可见区波长的光、强度大、稳定。

常用的有溴钨灯、高压汞灯、氙灯。

2. 单色器，两个单色器。

3. 样品池通常用石英制成。

4. 检测器：光电倍增管。

常见类型：紫外可见分光光度法：1.单光束。

简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性。

2.双光束自动记录，快速全波段扫描。

可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。

仪器复杂，价格较高。

3.双波长。

将不同波长的两束单色光(λ1、λ) 快束交替通过同一吸收池而后到达检测器。