丹参DNA提取方法的优化(1)
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药 物 生 物 技 术Pharmaceutical Biotechnology 2007,14(1):29～33丹参D NA提取方法的优化王春丽1,2,梁宗锁13,李殿荣2,王 灏2,舒志明1 (11西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100;21陕西省杂交油菜研究中心,陕西大荔715105)摘 要 针对药用植物丹参含有较多的多酚类、醌类等水溶性次生代谢物,在提取DNA时易发生共沉淀而很难除去等问题,设计双蒸水预洗不同次数和活性碳吸附杂质等处理,对CTAB和SDS两种DNA提取方法进行了系统优化。
研究得出,采用2%的CTAB提取液和双蒸水预洗一遍并且添加样品鲜重4%的活性碳于提取液中的提取方法最佳。
不仅能除去多酚类、醌类等次生代谢物,而且去多糖、蛋白质效果良好,所获DNA纯度高;RA PD2PCR实验结果稳定清晰可靠。
关键词 丹参;次生代谢物;CTAB;双蒸水预洗;活性炭中图分类号:Q781 文献标识码:A 文章编号:100528915(2007)0120029205 丹参(S al vi a miltiorrhi z a Bge)属唇形科(L abli at ae)鼠尾草属(S al vi a),全世界约1000多种,用于药用的40余种(含变种、亚种)。
是一种药用历史悠久的传统中药,以根入药,具有“祛瘀止痛,活血通经,清心除烦”等功效[1],临床上是治疗心血管疾病的首选药物,使用量及种植面积一直在不断迅速扩大。
但是由于品种繁多、真伪混杂,建立一种科学、可靠、方便的鉴定方法成为当务之急。
随着分子生物学技术的发展,以DNA多态性为基础的分子标记技术和传统的形态标记、同工酶标记相比,以其准确,不受外界环境影响等优点被广泛应用。
但是由于丹参含有多种二萜醌类(从丹参及同属植物中已分离鉴定出50多种)和多酚类(20多种)等次生代谢物及大量多糖,采用常用的DNA 提取方法[1～4]所提DNA多含有大量结合牢固的次生代谢物,抑制了PCR扩增反应。
本研究对常规CTAB法[3～6]和SDS法[2,9]进行了系统比较、改进、优化,旨在建立一套提取高纯度丹参DNA的有效方法。
1 材料和方法111 实验材料与试剂试材选用盆栽陕西商洛一年生紫花丹参的叶片。
实验所用主要试剂购于上海生物工程技术有限公司。
2%CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)缓冲液:2%C TAB,100mmol/L Tris2HCl, 50mmol/L ED TA,1.4mol/L NaCl,2%β巯基乙醇,p H8.0。
2%SDS(十二烷基磺酸钠)缓冲液:2%SDS,50mmol/L Tris2HCl,50mmol/L ED TA,500mmol/L NaCl,1%PV P,1%β巯基乙醇,p H8.0。
112 实验操作及方法11211 实验操作 DNA提取参照郭宝林等[3～5]的CTAB法、穆建新[2,9]等的SDS法并做改进,这两种方法及改进后的方法基本程序近似。
具体操作如下:①称取一定量的新鲜丹参叶片,置于灭菌的研钵中,加鲜重3%的PV P(聚乙烯吡咯啉酮)粉末,冰浴研磨成匀浆,分装于1.5ml离心管中,每管0.15g。
②按不同处理要求预洗(改进后的方法)或不预洗(未改进的方法)。
预洗操作为每管每次加预洗剂(水或丙酮)1ml,摇动5～6s,6000g 离心4min,弃上清。
③C TAB法DNA提取剂为2%CTAB缓冲液;SDS法提取剂为2%SDS缓冲液。
向沉淀中加60℃预热的提取剂450μl,65℃保温30min,其间每隔10min摇动一次。
④采用2%SDS缓冲液的各管分别加5mol/L KAc75μl,摇匀后冰浴15min。
⑤各管加-20℃预冷的氯92收稿日期:20060818 修回日期:20061012基金项目:教育部新世纪优秀人才支持计划和西北农林科技大学拔尖人才支持项目作者简介:王春丽,1969年生,女,汉族,硕士研究生,主要从事植物生理与分子生物学研究。
E2mail:wchli226@。
3通讯作者:梁宗锁,教授,博导,E2mail:Liangzs@仿∶异戊醇(24∶1)450μl,摇匀,0℃萃取5min, 17000g离心15min。
⑥取上清加2/3体积-20℃预冷的异丙醇,轻轻混匀,-20℃静置沉淀1.5h。
⑦6000g离心5min,沉淀在-90℃真空冷冻干燥后,加100μl双蒸水溶解。
采用RNase、酚/氯仿/异戊醇纯化DNA。
给提取的DNA溶液中加等体积双蒸水稀释,加RNase(100μg/ml)37℃保温0.5h,冰浴;加-20℃预冷等体积Tris饱和酚/氯仿/异戊醇(体积比:25/24/1)混合液,摇匀,17000g离心15min,上清液加等体积-20℃预冷的氯仿,混匀, 17000g离心10min;取上清加1/4体积N H4Ac,加2/3体积-20℃预冷的异丙醇,轻轻混匀, -20℃静置1.5h以上,6000g离心5min,沉淀在-90℃真空冷冻干燥后,加适量双蒸水溶解。
DNA的检测:①0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA。
②紫外分光光度法检测DNA溶液吸光值(A):5μl DNA溶液,加双蒸水稀释40倍,以双蒸水作对照,采用Beckman核酸测定软件程序,在B EC KMAN DV600型紫外分光光度计上检测A260.0nm/A280.0nm的比率(背景校正波长320.0nm)并据此判断样品纯度。
用Warburg和Christian 系数计算蛋白质和核酸浓度。
蛋白质(μg/ml)= 1552×A280.0-757.3×A260.0;核酸(μg/ml)= 62.9×A260.0-36×A280.0。
11212 DNA提取缓冲液及预洗方法的优选 对2%CTAB和2%SDS两种提取缓冲液、分别设计将研磨后的样品不预洗、用水洗1次丙酮再洗及水预洗两遍共6种处理,每种处理重复3次。
11213 活性炭吸附杂质试验 对2%CTAB和2%SDS两种提取缓冲液分别设计于提取缓冲液中添加活性炭、水预洗不加活性炭共6种处理。
活性炭为样品鲜重4%且需预先用双蒸水清洗并湿润。
11214 去多酚优选试验 总结实验11212、11213,选用2%CT AB缓冲液提取DNA,并对3种效果较好的去多酚等次生代谢物的提取方法进行优选。
实验操作同前面11211介绍的方法,操作至第7步得到的DNA溶液稀释至500μl,17000g离心5min,取上清液加2/3体积-20℃预冷的异丙醇沉淀DNA,得到的DNA溶于100μl双蒸水中备用。
11215 RAPD2PCR扩增 反应体系20μl。
模板2μl (40～50ng),10×Reaction Buffer[含(N H4)2SO4] 2.0μl,10mmol/L dNTP0.4μl,25mmol/L Mg2+ 1.6μl,TaqDNA聚合酶1.0U,25μmol/L引物0.3μl。
扩增程序:95℃预变性3min;扩增循环(40cycles);94℃,50s,38℃,1min10s;72℃, 1min30s;72℃延伸10min。
2 结 果211 DNA提取缓冲液及预洗方法优选实验结果DNA提取缓冲液及预洗方法优选实验结果见表1。
Tab1 Comparison of extracting buffer for DNA in the pre2wash method of nucleicExtraction bufferTreatmentColor of DNAsolutionsA260nm A280nm A260/A280Protein(μg/ml)Nucleic Acid(μg/ml) No pre2wash fawn0.940.69 1.69145.326.712%CTABPre2wash with waterfirstly and then acetonebuff0.590.31 2.0215.2825.46 Pre2wash twice with water buff0.620.30 2.08 1.9427.80 No pre2wash brown 2.83 2.920.89846.9719.682%SDS Pre2wash with water firstlyand then acetonesandy beige 1.86 1.860.99676.3422.18 Pre2wash twice with water sandy beige 1.87 1.78 1.11599.7328.03 从表1可知,2%CTAB缓冲液和2%SDS缓冲液相比,后者提取的DNA溶液颜色普遍较深,以采用2%C TAB缓冲液先水预洗再丙酮预洗及水预洗两遍的处理的DNA溶液颜色最浅。
紫外检测结果显示:前者DNA溶液的A260.0nm/A280.0nm 比值更接近1.8;蛋白含量远低于后者;两种缓冲液提取的核酸浓度相差不大,均在20～30μg/ml 之间,即核酸产率大体相当。
A260.0/A280.0在2.003药物生物技术第14卷第1期 附近是由于含有较多的RNA,但RNA对RA PD 等标记影响不大。
所以采用2%CTAB缓冲液破碎细胞、提取的核酸纯度较高。
采用两种缓冲液提取的DNA溶液中核酸、蛋白质含量均按照不预洗、先丙酮后水预洗、水预洗两遍的顺序降低,且均以水预洗两遍的核酸含量最高。
比较2%C TAB法不同处理提取的DNA,双蒸水预洗两遍的蛋白含量低,核酸含量较高, A260.0/A280.0比值较理想,更适于PCR扩增。
说明水预洗不仅能够简便地除去大量蛋白和多酚类水溶性次生代谢物,优于丙酮等有机试剂,而且水预洗不会降低核酸得率。
212 活性炭吸附杂质实验结果活性炭吸附杂质实验结果见表2。
Tab2 The experiment results of impurities adsorbed by charcoalExtraction bufferTreatmentColors of DNAsolutionsA260nm A280nm A260/A280Protein(μg/ml)Nucleic acid(μg/ml) No pre2wash but added charcoal Light brown 1.71 1.21 1.63237.5851.382%CTAB Pre2wash and added charcoal Light yellow 1.240.62 2.06 2.8854.74 Pre2wash but no charcoa adsorption Light yellow0.690.43 1.8650.7824.21No pre2wash but added charcoal Brown 2.64 2.710.87540.6411.882%SDS Pre2wash and added charcoal Light brown 1.68 1.60 1.11531.5524.54 Pre2wash but no charcoal adsorption Brown 6.62 2.620.99456.1414.63 双蒸水预洗或双蒸水预洗并加活性炭于提取液中处理提取的DNA溶液颜色稍带浅黄其余则为茶褐色或浅褐色。
