解郁1号对抑郁模型大鼠海马神经元细胞凋亡的影响_张丽萍

解郁1号对抑郁模型大鼠海马神经元细胞凋亡的影响张丽萍,武 丽,张 曼(广西中医学院,广西南宁530001)摘 要:探讨以调理脾胃气机法组成的中药复方解郁1号对抑郁模型大鼠海马神经细胞元凋亡的影响。

方法:将60只SD 大鼠随机分为正常组、模型组、西药组及中药组,每组15只,应用孤养加慢性轻度不可预见性应激方法复制大鼠抑郁症模型,采用O pen -field 法测定各组大鼠的行为变化;TUNEL 法检测海马CA 3区神经元细胞凋亡情况。

结果:模型组大鼠水平活动及垂直活动得分显著减少(P <0101),海马C A 3区内凋亡细胞数显著增加(P <0101)。

与模型组比较,中、西药组大鼠旷场活动次数增加(P <0101),海马CA3区内凋亡细胞数减少(P <0101)。

结论:解郁1号可改善大鼠抑郁行为,其作用机制可能与抑制海马神经元细胞凋亡有关。

关键词:解郁1号;抑郁症;海马;细胞凋亡中图分类号:R 749141 文献标识码:A 文章编号:1000-1719(2009)10-1805-02收稿日期:2009-02-24基金项目:国家自然科学基金项目(30660231)作者简介:张丽萍(1962-),女,甘肃张掖人,教授,博士,研究方向:五脏藏神的理论与实验研究;情志病证的中医药防治研究。

通讯作者:张曼(1982-),女,山东枣庄人,硕士,研究方向:五脏藏神的理论与实验研究。

在现代社会激烈的竞争压力下,各种应激因素加剧,使严重危害人类心身健康的精神疾病-抑郁症的患病率高达1113%,已成为影响人类健康的首要疾患[1]。

研究发现:慢性应激可能通过增加海马神经元细胞凋亡,导致海马损害,从而诱发抑郁症[2]。

也有报道证实,抗抑郁药物如文拉法辛可通过拮抗海马神经元细胞凋亡以发挥其疗效[3],但仍存在抗抑郁谱窄、副作用明显、药价高等缺陷[4]。

中医药以其擅长心身并治、整体调节而在抑郁症等情志病证的治疗方面具有一定优势,从中寻找安全有效的抗抑郁药物,探讨其作用机制是抑郁症相关研究的重点。

解郁1号由温胆汤化裁而成,前期临床观察表明:本方能有效改善抑郁症患者情绪低落、失眠、纳呆等精神、神经及消化道症状,临床抗抑郁效果显著,且与盐酸氟西汀胶囊相比毒副作用轻微[4-5]。

动物实验提示:其抗抑郁效应的发挥与干预生长抑素(SS)调衡下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(HPA 轴)功能有关[6]。

然而,本方抗抑郁机制与神经元细胞凋亡是否具有相关性?尚不清楚。

因此,本研究采用孤养加慢性轻度不可预见性应激抑郁大鼠模型,以海马神经元细胞凋亡为切入点,进一步探讨解郁1号的抗抑郁作用机制,为其有效临床实践提供新的科学依据。

1 材 料111 实验动物清洁级S D 雄性大鼠60只,体重(180~200)g ,由长沙市开福区实验动物科技服务部提供[动物许可证号:SCXK (湘)20060001]。

自由饮食,室温(20?3)e ,光/黯周期为12h /12h(光照时间6:00~18:00)。

112 药物与试剂 解郁1号(半夏、竹茹、枳实、茯苓、石菖蒲、合欢花等),购于广西中医学院附属一院中药房,经中药植化室鉴定后,水煎浓缩为115g /mL ,置4e 冰箱内备用。

阿米替林(批号:20070305),25m g /片,北京诺化制药有限公司提供;TUNEL 检测试剂盒(批号:84157920-10),德国宝灵曼公司提供。

113 主要仪器冰冻切片机CRYOTO M E AS620(华骏医疗器材有限公司)、C A I M S 系列-多功能真彩病理图像分析系统(北京麦克奥迪图像技术有限公司)。

2 实验方法211 动物分组购买动物适应性喂养1周后,随机分为模型对照组(以下简称模型组)、模型+解郁1号组(以下简称中药组)、模型+阿米替林组(以下简称西药组)、正常对照组(以下简称正常组),共4组,每组15只,正常组5只/笼群养,其余各组1只/笼饲养。

212 模型制备正常组大鼠自由饮水摄食,不予任何刺激;其余各组自分组之日起,采用慢性应激模型结合孤养模型,接受21天各种未预知的应激,包括24h 禁食,24h 禁水,通宵照明,4e 冷水游泳5m i n ,45e 烘箱热烘5m in ,夹尾1m i n ,高速水平振荡3m in ,100V 电击足底1m i n ,悬尾1m i n ,共9种刺激,21日内随机安排每日给予1种刺激,每种刺激出现2~3次,同一种刺激不能连续出现,使动物不能预知给予的刺激。

213 给药方法各组在造模同时即开始给药,中药组胃饲解郁1号提取液12g /(kg #d),西药组胃饲阿米替林10m g /(kg #d),模型组、正常组胃饲生理盐水2mL /(kg #d),每日8:00开始。

214 取材及组织处理各组动物末次造模结束后24h ,用10%水合氯醛(013~014mL /100g 体重)腹腔麻醉,后经左心室快速灌注37e 生理盐水(含适量肝素)150~200m L ,继而灌注4%多聚甲醛溶液(用PBS 配制,p H =714)200~300mL ,持续30~60m in ,直至大鼠上肢、颈项、下肢僵硬后,断头、取脑组织(此方法对组织和细胞内抗原的保存和定位影响最小)。

将脑组织置于4%多聚甲醛溶液中固定24h ,然后入20%蔗糖4~6h ,取出脑组织,冰冻切片机切片,片厚15L m,-20e 冰箱保存。

215观测指标与方法21511行为学观察旷场行为实验(Open-field法)观察各组大鼠行为变化,实验所用敞箱高为40c m、长宽均为80c m,内空的立柱体,周壁黑色,底部用白线划等分25方格,以动物穿越底面方块数为水平活动得分(四爪均进入的方格方可记数,为水平运动得分),以直立次数为垂直活动得分(两前爪腾空或攀附墙壁,为垂直运动得分),每只动物在造模结束后进行一次测定,时间为3m i n,比较各组得分差异。

21512海马神经元细胞凋亡检测采用末端脱氧核苷酸转移酶(T d T)介导的d-UTP缺口末端标记法(TUNEL法)。

即:切片于20L g/m L蛋白酶K37e下消化30m i n,配制含T d T和荧光素标记的d-UT P混合反应液,加入后37e孵育1h,再滴加连接碱性磷酸酶的抗荧光素抗体37e下孵育30m i n,再滴入稀释后缓冲溶液(SSC),室温下终止反应,最后以甲基绿复染,常规脱水、透明、封片,以上各步骤之间均用0101m o l/ L PBS洗3m i n@3次。

光镜下观察,拍片。

216细胞计数及统计学处理每只大鼠取相同部位的3张切片,每张切片选取3个视野,在同一放大倍数、同一光强度下,采用C M-LAS多功能真彩色病理图像分析系统,记数每张切片中海马CA3区神经元细胞凋亡个数,以3张切片的均值为数据进行统计学检验。

统计分析采用SPSS1115软件,数据均以均数标准差(x?s)表示,以单因素方差分析进行组间差异比较,两两比较用q检验,以P<0105为差异有显著性。

3结果311动物数量分析实验过程中,中药组死亡2只、西药组死亡1只,解剖无特殊发现,死亡原因不明。

最后进入结果分析共57只,模型组、正常组每组各15只,中药组13只,西药组14只。

312解郁1号对大鼠行为变化的影响与正常组比较,模型组大鼠水平活动及垂直活动得分显著减少(P<0101);与模型组相比,中、西药组抑郁大鼠的旷场活动次数增多,差异有显著性(P< 0101)。

结果见表1。

表1各组大鼠Open-fiel d行为观察结果比较(x?s)组别n水平运动(S)垂直运动(S)正常组1535.50?10.1820.50?7.01模型组1516.25?9.70v11.5?4.90v中药组1336.25?14.55n21.63?8.25n西药组1432.38?13.08n17.75?8.29n注:与正常组比较,v P<0101;与模型组比较,n P<0101。

313解郁1号对大鼠海马神经元细胞凋亡的影响在光镜下,各组大鼠海马C A3区均可见细胞核呈蓝绿色,胞质紫红色的凋亡细胞。

与正常组比较,模型组海马CA3区内凋亡细胞数显著增加(P<0101);与模型组比较,中、西药组海马CA3区内凋亡细胞数减少(P<0101);中、西药组间相比,未见显著性差异(P >0105)。

结果见表2。

4讨论抑郁症属于中医/郁证0范畴,是由情志不舒,气机郁滞引起的一类病证,病机在于脏腑气机失调,气、血、痰、热、湿等病理产物蓄积,脾胃为五脏气机升降之表2各组大鼠海马CA3区TUNEL染色比较(x?s)组别n阳性细胞数正常组1512.55?1.43模型组1521.23?3.68v中药组1312.78?1.35n西药组1414.83?2.17n 注:与正常组比较,v P<0101;与模型组比较,n P<0101。

枢纽,因此,通过调理脾胃以协调诸脏腑气机,乃治疗抑郁症关键所在,解郁1号遣方思路正基于此[5]。

旷场实验观察发现:抑郁模型大鼠的活动度(水平运动)以及对周围事物的好奇度(垂直活动)均显著下降,提示模型组大鼠行为学出现显著改变,而中药组对此有纠正作用,证实解郁1号能有效改善抑郁症状。

细胞凋亡又称为程序化死亡,它贯穿于机体的整个生命周期,一方面作为生理条件下的细胞死亡模式,参与调节机体发育、细胞分化及体内正常细胞的更新;另一方面与某些疾病如抑郁症、肿瘤、再障等的发生密切相关[7]。

目前,细胞凋亡常用的检测技术为细胞原位标记法,亦称为TUNEL法。

此方法不仅具有特异性强、灵敏度高、重复性好、分辨率较高及使用方便等优点,而且在细胞凋亡的早期阶段,可在组织原位同时显示凋亡细胞的形态和分布[8]。

因此,本实验采用TUNEL法进行凋亡检测,结果显示:抑郁模型大鼠海马神经元细胞凋亡数目增加,而中药组对此有逆转作用。

前期研究发现:解郁1号可通过增加大鼠海马脑源性神经营养因子(BDNF)含量,发挥其抗抑郁效应[9]。

BDNF作为一种细胞营养因子,具有维持和促进神经元生长、分化及再生,从而调节神经元凋亡的作用。

因此,在前期工作的基础上结合本次实验结果,初步推测:解郁1号的抗抑郁作用机制可能与其上调BDNF在海马区的表达,促进神经元保护性因子的释放,抑制海马神经元细胞凋亡相关,具体途径有待进一步研究。

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