真菌作业指导

目的：

通过无菌检验建立起产品无菌的直接数据，以评估灭菌效果是否符合要求。

2、合用范围：

合用于所有经过灭菌后的产品的检查。

3 、作业条件：

3 ．1 无菌检测在洁净度为 100 级单向流空气区域内进行，严格遵守无菌操作，避免污染。

3 ．2 超净台及工作台面，必须进行洁净度验证。

4、作业方法与步骤

4 ．1 制作或者选择培养基(参见《培养基制作作业指导书》)

4 ．1 ．1 好氧——厌氧菌检测时用硫乙醇酸盐按一定比例制作；

4 ．1 ．2 真菌检测时用改良马丁培养基按一定比例制作。

4 ．1 ．3 培养基需按要求培养 16- 18H 后，检查无菌生长方可使用。

4 ．2 制作阳性对照

4 ．2 ．1 好氧——厌氧菌检测时用枯草芽孢杆菌制作；

4 ．2 ．2 真菌检测时用自然界分离的霉菌制作。

4 ．2 ．3 取对照用菌一环用 0.9%无菌生理盐水按 1:1000 稀释，制成对照供试液。

4 ．2．4 取 1ml 对照供试液加入到一个装有 15ml 培养基试管中，作成阳性对照管，进行培

养。

4 ．3 制作产品供试液

4 ．3 ．1 取待测试产品 1~2PCS，根据产品物性的大小，分别采用直接浸入法或者棉拭子擦洗 法或者冲洗法采集洗脱液，装在相应的容器中。 4 ．4 制作培养用试管

4 ．4 ．1 取 1ml 产品供试液，加入到装好 10~15ml 培养基的试管中，按同样的方法共制作

十个试管进行培养；

4 ．5 培养与判定

4 ．5 ．1 将上述两种制备完成的试管放在恒温箱中进行培养。

4 ．5 ．2 需气菌、厌气菌培养温度 30~35℃、真菌培养温度 20~25℃，培养 14 日。

4．5．3 在培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。 阳性对照管在 24 小时内应有菌生长，

否则为本检测无效；

4 ．5 ．4 经过培养后，若浮现浑浊，可以外观判断有明显长菌的可以判定有菌，若不能明

显判定的，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中或者斜面培养基上继续培养，细菌培 养 2 日，真菌培养 3 日，观察是否再浮现浑浊或者斜面有无菌生长，或者用接种环取培养液涂 片，染色，用显微镜观察是否有菌。

4 ．6 将整个过程进行记录并形成报表

无菌检验作业指导书

1 目的

通过无菌检验，确保灭菌后产品能够达到无菌的要求。

2 合用范围

合用于灭菌后医疗器械产品电凝镊的无菌检验。

3 检验依据

3.1、产品注册标准

3.2、《中国药典》 (2022 年版) 3.3 、GB14233.2-2005 医用输液、输血、注射器具检验方法第二部份：生物试验方法

3.4 、GB15980- 1995 一次性使用医疗用品卫生标准

4 仪器、设备

百级层流超净工作台、电热干燥箱、电热恒温培养箱、霉菌培养箱、压力蒸汽灭菌器、电

子天平、 PH 计、冰箱、酒精灯、三角烧瓶，接种环、无菌棉签、镊子，试管架，大试管若

干等。

无菌检验室的环境要求

5.1 无菌检验应在环境洁净度 10000 级下的局部百级的单向流空气区域内进行。

5.2 缓冲区与外界环境、 无菌检验室与缓冲区之间空气应保持正压， 阳性对照室与缓冲区之

间空气应保持负压。无菌检验室与室外大气之间静压差应大于 10Pa。无菌检验室的室温应

保持 18~26℃，相对湿度： 45~65%。

5.3 无菌检验室的单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室(区)悬浮粒

子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的监测。

每年至少检测一次。

5.4 无菌检验过程中应同时检查超净工作台单向流空气中的菌落数： 每次操作时在层流空气

所及台面的左中右置 3 个营养琼脂平板，暴露30min，于 30~35℃培养 48 小时，菌落数平

均应不超过 1cfu/平板。

6 无菌检验前的准备 6.1 器具灭菌、消毒

6.1.1 灭菌：试验过程中与供试品接触的所有器具必须采用可靠方法灭菌。可经电热干燥箱

160℃以上干烤 2 小时，或者置压力蒸汽灭菌器内 121℃蒸汽灭菌 30 分钟后使用(根据灭菌 效果验证决定灭菌参数)。所有的灭菌物品不应超过 2 周即用毕，否则应重新灭菌。

6.1.2 消毒：凡检验中使用的器材无法灭菌处理的，使用前必须经消毒处理如无菌检验室的 试管架、电子天平、工作台面、工作人员的手、橡胶吸头等。可采用消毒剂浸泡或者擦拭。

消毒剂应每月更换，以防止产生耐药菌株。

6.1.3 标识：器具的灭菌、消毒后必须做好标识，标明灭菌、消毒时间和使用有效期。

6.2 人员、物料进入无菌检验室

6.2.1 开启紫外线灯或者臭氧发生器进行空间灭菌处理，消毒时间不得少于 30min。

6.2.2 物料进入无菌检验室流程

6.2.2.1 脱包： 进入无菌检验室的物品若有双重包装的， 需将外包装在传递窗/缓冲间拆除后，

传入试验室。

6.2.2.2 消毒：进入无菌操作室的所有培养基、供试品等的外表都应采用合用的方法进行消

毒处理，以避免将外包装污染的微生物带入无菌检验室。

6.2.2.3 传递：查看所有进入无菌检验室的器具上的灭菌、消毒标识，是否在有效期内。符

合要求的经传递窗传入无菌检验室。

6.2.3 人员进入无菌检验室流程

6.2.3.1 更鞋脱衣：在一更区脱去普通区工作鞋，穿上无菌检验室工作鞋；脱去普通区工作

服

洗手：首先用肥皂或者洗手液在手上揉擦出泡沫，再用流水连续冲洗 20 秒，洗净泡沫。

6.2.3.3 更衣：在二更区按照从上到下的顺序穿戴无菌工作服(包括衣、帽、口罩等)，要求

裤子掖在上衣里，口罩掩住口鼻，帽子包裹所有头发。

6.2.3.4 手消毒：用消毒液浸泡双手 5 秒以上或者用浸过消毒液的棉球擦拭双手。消毒液可用 洗必泰、新洁尔灭、碘伏、 75%酒精等。

6.2.3.5 人员进入：经缓冲间进入无菌检验室。

6.2.4 人员进入无菌检验室后，进一步用消毒液擦拭工作台面，戴无菌手套。 7 无菌检验操作要求

7.1 全过程必须严格执行无菌操作，防止微生物污染。

7.2 使用玻璃器皿应轻取轻放，避免破损，以防培养物扩散。

7.3 所有操作均应在近火焰区进行， 且不得有大幅度或者快速动作， 以免搅动空气中的尘埃微

粒。

7.4 使用金属接种器具时，用前、用后均需灼烧灭菌。

7.5 在接种培养物时，动作应轻、准，防止培养物溅出，产生汽溶胶，造成污染。

7.6 操作过程中所有的带菌物品，用后均应作消毒、灭菌处理。可在检验过程

中随用随时放入消毒液缸内浸泡或者消毒桶内，或者在检验完成后经传递窗传至普通区，即将 用压力蒸汽灭菌锅 121℃灭菌 30 分钟。 8 对照菌液制备

8.1 无菌检验所用的菌株传代次数不得超过 5 代。

8.2 取金黄色葡萄球的普通琼脂斜面培养物， 接种一白金耳至营养肉汤或者营养琼脂培养基

内，在 30~35℃培养 18~24h 后备用，同时制备 0.9%氯化钠溶液加入在 6 支小试

管内，每支试管内加 9.0ml 的 0.9%氯化钠溶液，在压力锅内经 121℃灭菌 30min 备用。将

已配好的金黄色葡萄球菌培养菌液取 1.0ml 加入第一支小试管内， 稀释成浓度 1:10 的菌液；

取第一支试管内 1.0m l 菌液加入第二支小试管内，稀释成浓度 1:100 的菌液，同法稀释成

浓度 1:106 (每 ml 含菌量≤100CFU)即可。

8.3 采用平皿计数法测定活菌数。

9 无菌检验培养温度

硫乙醇酸盐流体培养基，置 30~35℃培养。 改良马丁培养基，置 23~28℃培养。

无菌检验

10.1 抽样 根据各自的产品注册标准和相应产品出厂检验规程的规定，对成品库内的产品进行抽样。

普通同一个灭菌批产品检验 3 个单位供试品。

10.2 供试液准备

优先采用将供试品或者其有代表性的各部份直接投放入培养基内培养的方法，如供试品不适 宜直接投放，可按下列方法制备供试液，应使浸提介质充分洗提供试品的浸提表面，供试 液制备应按无菌操作法进行， 在制备后 2 小时内使用。 根据供试品具体特性选择下列方法： a) 管类器具：按管内表面积每 10cm2 流过管内腔 1ml 浸提介质，流量约为10ml/min，采集 到无菌的容器内。

b) 容器类器具：按容器内表面积每 10cm2 加入浸提介质 1ml 的比例，振摇数次。

c) 实体类器具：实体类器具按表面及每 10cm2 加入浸提介质 1ml，振摇数次。 采集上述冲

洗液或者浸提介质于无菌容器中。 10.3 接种

薄膜过滤法：优先采用封闭式薄膜过滤器(集菌器)，也可使用开放式薄膜过滤器。滤膜孔

经不大于 0.45µm。滤器和滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌，或者直接采用无菌集菌器。

如采用封闭式薄膜过滤器，取一副三联式集菌器，将供试液通过集菌仪过滤，使通过每只

培养管的量基本均匀。然后通过集菌仪一只加 120ml 改良马丁培养基，另两只分别加入

120ml 硫乙醇酸盐培养基(其中一只做阳性对照，内加金黄色葡萄球菌液 1ml)。另取一副

二联集菌器，用同批的冲洗液或者浸提介质 120ml 通过集菌仪过滤(每只约 50ml)，同法一 只加硫乙醇酸盐培养基 120ml，另一只加改良马丁培养基 120ml 分别作阴性对照。

b、如用普通薄膜过滤器，将供试液过滤后取出滤膜，将其剪成 3 等份，分别置于含 50ml

硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基的容器中，其中两份作检验，一份作阳性对照。

10.4 培养、观察

上述含培养基的容器分别置规定温度的恒温培养箱中，除阳性对照管培养48~72 小时外，